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この記事について

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要約

ここでは、マウス小脳の顆粒ニューロンがシナプス構造を精緻化し、シナプスを形成して脳回路全体に集積する、生後脳の発達過程におけるシナプス形成を可視化する方法について述べる。

要約

神経細胞は、脳の発達中にその構造と機能が動的に変化し、他の細胞と適切な接続を形成します。げっ歯類の小脳は、単一の細胞型である小脳顆粒ニューロン(CGN)の発生と形態形成を経時的に追跡するための理想的なシステムです。ここでは、発達中のマウス小脳における顆粒ニューロン前駆細胞の in vivo エレクトロポレーションを使用して、その後の形態学的分析のために細胞をまばらに標識しました。この技術の有効性は、これらの細胞がシナプス入力の大部分を受け取る特殊な構造である樹状突起爪の形成に特に焦点を当てて、CGN成熟の主要な発達段階を示す能力で実証されています。この技術は、小脳の発達を通してCGNシナプス構造のスナップショットを提供することに加えて、細胞自律的な方法で顆粒ニューロンを遺伝的に操作して、関心のある遺伝子の役割とCGN形態、爪の発達、およびシナプス形成への影響を研究することができます。

概要

脳の発達は、胚発生から出生後の生活に及ぶ長期にわたるプロセスです。この間、脳は内因性刺激と外因性刺激の組み合わせを統合し、樹状突起と軸索の間のシナプスの配線を彫刻して最終的に行動を導きます。げっ歯類の小脳は、前駆細胞から成熟ニューロンに移行する際に、単一のニューロンタイプである小脳顆粒ニューロン(CGN)の発達を追跡できるため、シナプスがどのように発達するかを研究するための理想的なモデルシステムです。これは、小脳皮質の大部分が出生後に発達し、出生後の遺伝子操作と細胞標識が容易になるという事実に一部起因しています1

哺乳類では、CGN分化は、後脳の増殖細胞のサブセットが菱形の唇の上を移動して小脳の表面に二次胚帯を形成する胚発生の終わりに始まります2,3,4それらは顆粒ニューロン前駆細胞(GNP)の同一性に完全に関与していますが、これらの細胞は生後14日目(P14)まで外部顆粒層(EGL)の外側部分内で増殖し続けます。この層の増殖は、これらの細胞がもっぱらCGNを生じさせるため、小脳の大規模な拡張をもたらします5。生まれたばかりのCGNは、EGLの細胞周期を出ると、内顆粒層(IGL)に向かって内側....

プロトコル

注:すべての手順は、デューク大学施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに基づいて実行されました。

1.インビボエレクトロポレーションまたはIVEのためのDNA調製(手術の1日前)

  1. 次の材料を収集します:精製DNA(動物あたり0.5〜25 μg)、3 M酢酸ナトリウム、エタノール、ファストグリーン染料、超高純度蒸留水、リン酸緩衝液(PBS)(材料の表を参照)。
    注:DNAについては、ヒトユビキチンプロモーター下で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する構築物をAddgene(FUGW、https://www.addgene.org/14883/)から取得しました。ユビキタスプロモーターの制御下でGFPまたは他の蛍光タンパク質を発現する任意の構築物が機能するはずである。この技術によるCGN特異的標識は、構築物に依存するのではなく、エレクトロポレーションに依存する。
  2. 所望の量のDNA、10容量%の3 M酢酸ナトリウムおよび250容量%の100%氷冷エタノールを混合することにより、エレクトロポレーション用のDNAを調製する。DNAはすぐに溶液から沈殿することに注意してください。
  3. DNA混合物を-20°Cで一晩沈殿させるか、-80°Cで1時間沈殿させ続けます。
  4. ペレットを卓上遠心分離機で>16,000 × g で沈殿させ....

結果

figure-results-25
図4:小脳発達過程における顆粒ニューロン形態の解析。 (A)3-DPIから14-DPI(出生後年齢P10〜P21)、核(青)およびGFP(緑)のエレクトロポレーションCGNの最大投影画像。矢印は個々の樹状突起を示し、スケールバーは10μmです。 (B)樹状突起の平均数。(C)体細胞の基部?.......

ディスカッション

小脳顆粒ニューロンは、哺乳類の脳で最も豊富なニューロンであり、げっ歯類の脳の全ニューロン集団のほぼ60〜70%を占めています1,14。小脳は、細胞の増殖、遊走、樹状突起形成、シナプス発生のメカニズムの解明に広く利用されています6,9,10,11,15,16,17,18,19,20

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、NIH助成金R01NS098804(A.E.W.)、F31NS113394(UC)、およびデューク大学のSummer Neuroscience Program(D.G.)の支援を受けました。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
BetadinePurdue Production67618-150-17
Cemented 10 µL needleHamilton1701SN (80008)33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style
Chicken anti-GFPMillipore SigmaAB16901Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration
Cotton-tip applicator
Donkey anti-chicken Cy2Jackson ImmunoResearch703-225-155Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration
Ethanol (200 proof)KoptecV1016
Electroporator ECM 830BTX Harvard Apparatus45-0052
Fast Green FCFSigmaF7252-5G
FUGW plasmidAddgene14883
Glass slidesVWR48311-703Superfrost plus
GlycerolSigma-AldrichG5516
Heating padSoftheat
Hoescht 33342 fluorescent dyeInvitrogen62249
ImarisBitplane
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
Micro cover glassVWR48382-138
Nail polishSally HansenColor 109
Normal goat serumGibco16210064
O.C.T. embedding compoundTissue-Tek4583
Olympus MVX10 Dissecting ScopeOlympusMVX10
P200 pipette reach tipFisherbrand02-707-138Used for needle spacer
ParafilmBemisPM-996
PBS pH 7.4 (10x)Gibco70011-044
Simple Neurite TracerFIJIhttps://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_
Instructions
SucroseSigmaS0389
Surgical toolsRWD Life ScienceSmall scissors and tweezers
Triton X-100Roche11332481001non-ionic detergent
TweezertrodesBTX Harvard Apparatus45-04895 mm, platinum plated tweezer-type electrodes
Ultrapure distilled waterInvitrogen10977-015
Vectashield mounting mediaVectashieldH1000
Vetbond tissue adhesive3M1469SB
Zeiss 780 Upright ConfocalZeiss780

参考文献

  1. Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
  2. Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neur....

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