Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser la synaptogenèse des neurones granulaires dans le cervelet de la souris au cours du développement cérébral postnatal lorsque ces cellules affinent leurs structures synaptiques et forment des synapses pour s’intégrer dans le circuit cérébral global.

Résumé

Les neurones subissent des changements dynamiques dans leur structure et leur fonction au cours du développement du cerveau pour former des connexions appropriées avec d’autres cellules. Le cervelet de rongeurs est un système idéal pour suivre le développement et la morphogenèse d’un seul type de cellule, le neurone granulaire cérébelleux (CGN), au fil du temps. Ici, l’électroporation in vivo des progéniteurs des neurones granulaires dans le cervelet de souris en développement a été utilisée pour marquer les cellules de manière clairsemée pour des analyses morphologiques ultérieures. L’efficacité de cette technique est démontrée dans sa capacité à mettre en évidence les étapes clés du développement de la maturation CGN, avec un accent particulier sur la formation de griffes dendritiques, qui sont des structures spécialisées où ces cellules reçoivent la majorité de leurs entrées synaptiques. En plus de fournir des instantanés des structures synaptiques CGN tout au long du développement cérébelleux, cette technique peut être adaptée pour manipuler génétiquement les neurones granulaires de manière autonome par les cellules afin d’étudier le rôle de tout gène d’intérêt et son effet sur la morphologie CGN, le développement des griffes et la synaptogenèse.

Introduction

Le développement du cerveau est un processus prolongé qui s’étend de l’embryogenèse à la vie postnatale. Pendant ce temps, le cerveau intègre une combinaison de stimuli intrinsèques et extrinsèques qui sculptent le câblage des synapses entre les dendrites et les axones pour finalement guider le comportement. Le cervelet des rongeurs est un système modèle idéal pour étudier le développement des synapses, car le développement d’un seul type de neurone, le neurone granulaire cérébelleux (CGN), peut être suivi lors de sa transition d’une cellule progénitrice à un neurone mature. Cela est dû, en partie, au fait qu’une majorité du cortex cérébelleux se développe après la na....

Protocole

REMARQUE: Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Duke (IACUC).

1. Préparation de l’ADN pour l’électroporation in vivo ou IVE (1 jour avant la chirurgie)

  1. Rassemblez les matériaux suivants : ADN purifié (0,5-25 μg par animal), acétate de sodium 3 M, éthanol, colorant vert rapide, eau distillée ultrapure, solution tampon phosphate (PBS) (voir le tableau des matériaux).
    NOTE: Pour l’ADN, une construction exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous un promoteur humain de l’ubiquitine a ét....

Résultats

figure-results-25
Figure 4 : Analyse de la morphologie des neurones granulaires au cours du développement cérébelleux. A) Images de projection maximale des CGN électroporés de 3 DPI à 14 DPI (âge postnatal P10 à P21), noyaux (bleu) et GFP (vert); Les pointes de flèches indiquent une dendrite individuelle et la barre d’échelle est de 10 μm. (B) Nombre moyen de de.......

Discussion

Les neurones granulaires cérébelleux sont les neurones les plus abondants dans le cerveau des mammifères, représentant près de 60 à 70% de la population totale de neurones dans le cerveau des rongeurs 1,14. Le cervelet a été largement utilisé pour élucider les mécanismes de prolifération cellulaire, de migration, de formation de dendrites et de développement des synapses 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Le travail a été soutenu par les subventions NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) et le programme d’été en neurosciences de l’Université Duke (D.G.).

....

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
BetadinePurdue Production67618-150-17
Cemented 10 µL needleHamilton1701SN (80008)33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style
Chicken anti-GFPMillipore SigmaAB16901Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration
Cotton-tip applicator
Donkey anti-chicken Cy2Jackson ImmunoResearch703-225-155Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration
Ethanol (200 proof)KoptecV1016
Electroporator ECM 830BTX Harvard Apparatus45-0052
Fast Green FCFSigmaF7252-5G
FUGW plasmidAddgene14883
Glass slidesVWR48311-703Superfrost plus
GlycerolSigma-AldrichG5516
Heating padSoftheat
Hoescht 33342 fluorescent dyeInvitrogen62249
ImarisBitplane
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
Micro cover glassVWR48382-138
Nail polishSally HansenColor 109
Normal goat serumGibco16210064
O.C.T. embedding compoundTissue-Tek4583
Olympus MVX10 Dissecting ScopeOlympusMVX10
P200 pipette reach tipFisherbrand02-707-138Used for needle spacer
ParafilmBemisPM-996
PBS pH 7.4 (10x)Gibco70011-044
Simple Neurite TracerFIJIhttps://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_
Instructions
SucroseSigmaS0389
Surgical toolsRWD Life ScienceSmall scissors and tweezers
Triton X-100Roche11332481001non-ionic detergent
TweezertrodesBTX Harvard Apparatus45-04895 mm, platinum plated tweezer-type electrodes
Ultrapure distilled waterInvitrogen10977-015
Vectashield mounting mediaVectashieldH1000
Vetbond tissue adhesive3M1469SB
Zeiss 780 Upright ConfocalZeiss780

Références

  1. Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
  2. Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neur....

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Neurosciencesnum ro 172D veloppement neuronalcerveletdendritesynapseneurone granulairelectroporation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Recherche

Enseignement

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.