Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones cérébelleux granulaires et le développement des synapses

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser la synaptogenèse des neurones granulaires dans le cervelet de la souris au cours du développement cérébral postnatal lorsque ces cellules affinent leurs structures synaptiques et forment des synapses pour s’intégrer dans le circuit cérébral global.

Résumé

Les neurones subissent des changements dynamiques dans leur structure et leur fonction au cours du développement du cerveau pour former des connexions appropriées avec d’autres cellules. Le cervelet de rongeurs est un système idéal pour suivre le développement et la morphogenèse d’un seul type de cellule, le neurone granulaire cérébelleux (CGN), au fil du temps. Ici, l’électroporation in vivo des progéniteurs des neurones granulaires dans le cervelet de souris en développement a été utilisée pour marquer les cellules de manière clairsemée pour des analyses morphologiques ultérieures. L’efficacité de cette technique est démontrée dans sa capacité à mettre en évidence les étapes clés du développement de la maturation CGN, avec un accent particulier sur la formation de griffes dendritiques, qui sont des structures spécialisées où ces cellules reçoivent la majorité de leurs entrées synaptiques. En plus de fournir des instantanés des structures synaptiques CGN tout au long du développement cérébelleux, cette technique peut être adaptée pour manipuler génétiquement les neurones granulaires de manière autonome par les cellules afin d’étudier le rôle de tout gène d’intérêt et son effet sur la morphologie CGN, le développement des griffes et la synaptogenèse.

Introduction

Le développement du cerveau est un processus prolongé qui s’étend de l’embryogenèse à la vie postnatale. Pendant ce temps, le cerveau intègre une combinaison de stimuli intrinsèques et extrinsèques qui sculptent le câblage des synapses entre les dendrites et les axones pour finalement guider le comportement. Le cervelet des rongeurs est un système modèle idéal pour étudier le développement des synapses, car le développement d’un seul type de neurone, le neurone granulaire cérébelleux (CGN), peut être suivi lors de sa transition d’une cellule progénitrice à un neurone mature. Cela est dû, en partie, au fait qu’une majorité du cortex cérébelleux se développe après la naissance, ce qui permet une manipulation génétique facile et le marquage cellulaire après la naissance¹.

Chez les mammifères, la différenciation CGN commence à la fin du développement embryonnaire lorsqu’un sous-ensemble de cellules prolifératives dans le cerveau postérieur migre sur la lèvre rhombique pour former une zone germinale secondaire à la surface du cervelet ^2,3,4. Bien qu’elles soient pleinement engagées dans une identité de progéniteur de neurones granulaires (GNP), ces cellules continuent de proliférer dans la partie externe de la couche granulaire externe (EGL) jusqu’au jour postnatal 14 (P14). La prolifération de cette couche entraîne une expansion massive du cervelet car ces cellules donnent naissance exclusivement à CGNs⁵. Une fois que les CGN nouveau-nés quittent le cycle cellulaire dans l’EGL, ils migrent vers l’intérieur vers la couche granulaire interne (IGL), laissant derrière eux un axone qui bifurquera et voyagera dans la couche moléculaire du cervelet, formant des fibres parallèles qui synapsent sur les cellules de Purkinje⁶. La position de ces fibres dans la couche moléculaire dépend du moment de la sortie du cycle cellulaire.

Les CGN qui se différencient en premier quittent leurs fibres parallèles vers le bas de la couche moléculaire, tandis que les axones des CGN qui se différencient plus tard sont regroupés dans le^{haut 7,8}. Une fois que les corps cellulaires CGN atteignent l’IGL, ils commencent à élaborer des dendrites et à former des synapses avec des neurones inhibiteurs et excitateurs voisins. L’arbre dendritique mature d’une CGN présente une architecture stéréotypée avec quatre processus principaux. Au cours de la maturation CGN, les structures à l’extrémité de ces dendrites forment une griffe qui s’enrichit en protéines postsynaptiques ^9,10. Ces structures spécialisées, appelées griffes dendritiques, contiennent la majorité des synapses sur les neurones granulaires et sont importantes pour recevoir à la fois les entrées excitatrices des innervations de fibres moussues provenant des pons, ainsi que les entrées inhibitrices des cellules de Golgi locales. Une fois entièrement configurées, les connexions synaptiques des CGN permettent à ces cellules de relayer les entrées des noyaux pré-cérébelleux aux cellules de Purkinje, qui se projettent hors du cortex cérébelleux vers les noyaux cérébelleux profonds.

L’électroporation postnatale in vivo des GNP est avantageuse par rapport à d’autres méthodes basées sur le marquage, telles que l’infection virale et la génération de lignées de souris transgéniques, car l’expression des constructions souhaitées peut être réalisée sur un calendrier rapide, et la méthode cible une petite population de cellules, utile pour étudier les effets autonomes cellulaires. Cette méthode a été utilisée dans des études antérieures pour étudier le développement morphologique des CGN; Cependant, ces études se sont concentrées sur un seul point temporel ou une courte fenêtre de temps 9,10,11,12,13. Cette méthode de marquage a été associée à une analyse d’images pour documenter les changements dans la morphologie CGN qui se produisent tout au long de la différenciation CGN au cours des trois premières semaines de la vie postnatale. Ces données révèlent la dynamique du développement des dendrites CGN qui sous-tend la construction des circuits cérébelleux.

Protocole

REMARQUE: Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Duke (IACUC).

1. Préparation de l’ADN pour l’électroporation in vivo ou IVE (1 jour avant la chirurgie)

1. Rassemblez les matériaux suivants : ADN purifié (0,5-25 μg par animal), acétate de sodium 3 M, éthanol, colorant vert rapide, eau distillée ultrapure, solution tampon phosphate (PBS) (voir le tableau des matériaux).
   NOTE: Pour l’ADN, une construction exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous un promoteur humain de l’ubiquitine a été obtenue à partir d’Addgene (FUGW, https://www.addgene.org/14883/). Toute construction exprimant la GFP ou une autre protéine fluorescente sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire devrait fonctionner. L’étiquetage spécifique à CGN avec cette technique ne dépend pas de la construction, mais plutôt de l’électroporation.
2. Préparer l’ADN pour l’électroporation en mélangeant la quantité désirée d’ADN, 10% en volume d’acétate de sodium 3 M et 250% en volume d’éthanol glacé à 100%. Notez que l’ADN précipitera immédiatement hors de la solution.
3. Continuer à précipiter le mélange d’ADN pendant une nuit à -20 °C ou pendant une heure à -80 °C.
4. La pastille précipitait l’ADN dans une centrifugeuse de table à 16 000 > × g et lavait deux fois avec de l’éthanol à 70%.
5. Laisser sécher complètement la pastille d’ADN et reconstituer dans une solution 1x PBS + 0,02% Fast Green.

Figure 1 : Limitation de la profondeur d’injection à 1,5 mm à l’aide d’une entretoise. (A) Un segment de 11,2 mm est coupé d’une pipette de chargement à l’aide d’une lame de rasoir. (B) L’entretoise est fixée à l’extrémité de la seringue Hamilton (longueur totale de 1,27 cm ou 0,5 po) et fixée à l’aide d’adhésif ou de parafilm. La pointe exposée doit avoir une longueur de 1,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Électroporation in vivo de progéniteurs de neurones granulaires chez des souris postnatales âgées de sept jours

REMARQUE: Toutes les chirurgies d’électroporation ont été effectuées dans une salle d’opération stérile et hautement ventilée, et tout le personnel portait un équipement de protection individuelle complet, y compris des gants, un masque facial, un bonnet à cheveux, une blouse et des couvre-chaussures. Alternativement, les chirurgies peuvent être effectuées dans une hotte ventilée et stérile.

1. Rassemblez le matériel suivant : ADN pour l’électroporation, petits ciseaux chirurgicaux, petites pinces chirurgicales, seringue Hamilton personnalisée, applicateur à embout de coton, coussin chauffant, bétadine, éthanol à 70 %, 1x PBS, parafilm, adhésif tissulaire (cyanoacrylate de n-butylester), isoflurane, électroporateur et électrodes de type pince à épiler (voir le tableau des matériaux).
2. Couper une entretoise d’un embout de chargement stérilisé pour l’adapter à la seringue Hamilton afin de limiter la profondeur d’injection à 1,5 mm (figure 1A,B). Fixez l’entretoise avec de l’adhésif ou du parafilm.
3. Anesthésier le chiot P7 dans une chambre d’isoflurane à un débit de 0,8 L/min. Confirmer l’anesthésie complète en surveillant la diminution de la respiration de l’animal et l’absence de pincement de l’orteil ou de la queue (figure 2A).
4. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, placez les petits sur un piédestal muni d’un cône nasal, délivrant constamment de l’isoflurane à 4 % à un débit de 0,8 L/min. Nettoyez le dessus de la tête du chiot 3 fois avec un tampon stérile de bétadine puis d’éthanol à 70%, en alternant entre les deux, pour préparer le site. Laisser sécher la solution avant de continuer.
5. À l’aide d’une paire de ciseaux stérilisés, faites une petite incision avec une coupe qui s’étend du haut à la base des oreilles pour révéler le cerveau postérieur (figure 2B).
6. Localisez le cervelet (figure 2C), insérez l’embout exposé de la seringue Hamilton dans le crâne, perpendiculairement au cerveau, et injectez 1,5 μL de mélange d’ADN dans le parenchyme cérébelleux en poussant lentement le piston arrière de la seringue. Après la livraison du mélange d’ADN, tirez lentement l’aiguille vers l’arrière pour éviter les déversements et laissez la solution d’ADN se diffuser pendant 30 s.
7. Éteignez l’isoflurane et placez le chiot sur un coussin chauffant à 37 °C. Préparez l’électrode de type pince à épiler pour l’électroporation en plongeant les deux extrémités dans 1x PBS stérile.
   REMARQUE: Le mouillage de l’électrode de type pince à épiler empêchera les brûlures de contact sur la peau du chiot pendant l’administration des impulsions électriques.
8. Orientez l’électrode de la pince à épiler au-dessus du site d’injection, l’extrémité plus étant orientée vers le bas et l’extrémité négative au-dessus de la tête de l’animal (figure 2D). Administrez cinq impulsions électriques de l’électroporateur avec les réglages suivants : intervalle d’impulsions de 50 ms, 130 V et 950 ms.
   REMARQUE : Au besoin, effectuer une injection d’essai pour s’assurer que le site d’injection est situé sur le vermis cérébelleux (figure 2E).
9. Pincez l’incision fermée et scellez la plaie avec un adhésif tissulaire cyanoacrylate de n-butylester non toxique. Nettoyez la plaie avec de l’éthanol à 70%, car toute trace de sang augmente la probabilité d’infanticide parental et de cannibalisme.
10. Laissez l’animal récupérer sur un coussin chauffant à 37 °C avant de le remettre au dirigé. Surveillez le(s) chiot(s) toutes les 30 minutes pendant au moins 2 heures après la chirurgie pour assurer un rétablissement complet.
    NOTE: L’infanticide par l’un ou l’autre parent est assez courant. Pour éviter le cannibalisme, logez le père dans une cage différente avant de commencer l’électroporation et retournez toujours les chiots nettoyés et récupérés (c.-à-d. pas de tache de sang, complètement mobiles) dans la cage d’origine sur la litière d’origine. Les chiots peuvent également être essuyés avec les excréments de la cage d’origine pour minimiser l’odeur de sang. L’utilisation d’une mère porteuse peut être nécessaire si la mère d’origine continue de cannibaliser ses petits.

Figure 2 : Électroporation cérébelleuse in vivo de progéniteurs de neurones granulaires chez des bébés souris de type sauvage P7. (A) Les petits sont anesthésiés avec de l’isoflurane à 4% délivré à un taux de 0,8 L / min pour assurer l’anesthésie tout au long de l’injection de la solution d’ADN. L’isoflurane est délivré à un taux de 0,8 L/min. (B) Après avoir stérilisé la souris 3 fois avec de la bétadine et de l’éthanol à 70%, une incision est pratiquée qui s’étend sur la distance des oreilles, révélant le cerveau postérieur. (C) Image agrandie d’une démarcation blanche sur le crâne, point de repère pour le site d’injection. La construction de l’ADN doit être injectée à moins de 1 mm au-dessus de la marque; Des lignes pointillées délimitent la démarcation et une flèche noire indique le site d’injection. Les crêtes du vermis cérébelleux peuvent être visibles et peuvent être utiles pour trouver le site d’injection. (D) Orientation de l’électrode de type pince à épiler pour une électroporation efficace. L’extrémité plus (+) doit être orientée vers le bas pour attirer l’ADN chargé négativement dans le parenchyme cérébelleux avant l’administration d’impulsions électriques. (E) L’injection d’essai de 1 μL d’un colorant vert rapide à 0,02 % montre que l’injection est localisée au milieu du vermis cérébelleux entre les lobules 5 à 7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Immunohistochimie des CGN électroporés

1. Rassemblez les matériaux suivants : isoflurane, 1x PBS, 4 % de paraformaldéhyde (PFA), 30 % de saccharose, sérum de chèvre normal, détergent non ionique, lames de verre, lames de verre, couvercles de verre, vernis à ongles, supports de montage, colorant nucléaire Hoechst et anticorps primaires et secondaires appropriés (voir le tableau des matériaux).
2. Anesthésiez l’animal de laboratoire avec de l’isoflurane et confirmez l’anesthésie complète avec un pincement des orteils et de la queue.
3. Effectuer une perfusion transcardique en injectant lentement 1x PBS et 4% PFA dans le ventricule gauche du cœur de l’animal. Laissez le sang s’écouler de l’animal en coupant la veine cave.
4. Fixez le cerveau pendant la nuit en le submergeant dans 4% PFA à 4 ° C. Le lendemain, rincer rapidement le cerveau avec 1x PBS et transférer le cerveau dans 30% de saccharose dans 1x PBS pour la cryoprotection pendant au moins 24 heures.
5. Si nécessaire, couper le cerveau en deux le long de l’axe rostral-caudale et confirmer l’expression de la construction du rapporteur transfecté à l’aide d’un microscope à dissection fluorescent vertical.
   REMARQUE: Gardez le cerveau immergé dans 1x PBS dans un petit plat pour l’empêcher de se dessécher.
6. Montez le cerveau sur un microtome de congélation, coupez des sections sagittales de 25 μm et laissez les sections se dérouler dans un mélange 1:1 de 1x PBS et de glycérol.
   NOTE: Les sections peuvent être stockées dans cette solution cryoprotectrice à -20 ° C pour un stockage à long terme.
7. Laver les sections trois fois dans 1x PBS pendant 10 min chacune pour éliminer le cryoprotecteur, et bloquer le tissu dans 1x PBS + 10% de sérum de chèvre normal + 0,2% de détergent non ionique sur un agitateur orbital à température ambiante pendant 1 h.
8. Préparer la solution d’anticorps primaires: 1x PBS, 10% de sérum de chèvre normal, 0,2% de détergent non ionique et anticorps anti-GFP, et centrifuger la solution pendant 5 minutes à >16 000 × g. Incuber des sections dans la solution d’anticorps à 4 °C sur un agitateur orbital pendant 48 h.
9. Laver la solution d’anticorps primaires pendant 15 min cinq fois avec 1x PBS + 0,2% de détergent non ionique.
10. Préparer une solution d’anticorps secondaires : 1x PBS, 10 % de sérum de chèvre normal, 0,2 % de détergent non ionique et un anticorps secondaire approprié pour détecter la GFP; centrifuger la solution à 16 000 > × g. Incuber des sections dans la solution d’anticorps sur un agitateur orbital à température ambiante pendant 2-3 h. Protégez les sections de l’exposition à la lumière pour éviter le blanchiment.
11. Laver la solution d’anticorps secondaires trois fois avec 1x PBS + 0,2% de détergent non ionique pendant 15 minutes à chaque fois. Incuber les sections dans 1x PBS + Hoechst pendant 5 min pour colorer les noyaux.
12. Lavez la solution Hoechst avec 1x PBS + 0,2% de détergent non ionique et montez sur des lames de verre. Couvrez les sections avec un support de montage, recouvrez les lames et scellez la lame avec du vernis à ongles pour éviter l’évaporation.

4. Analyses morphologiques des CGN - reconstruction tridimensionnelle (3D) et surface et volume cellulaire

1. Image de CGN électroporés simples sur un microscope confocal à objectif 63x avec un zoom 2x, prenant des images z-stack à 0,5 μm par pile. Imagez une cellule par fenêtre d’image pour faciliter l’analyse et la reconstruction de l’image.
2. Installez le plug-in Simple Neurite Tracer pour FIJI en utilisant le lien suivant (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions) pour tracer facilement et efficacement la structure des CGN électroporés dans l’espace tridimensionnel (3D).
   Remarque : Il existe une version mise à jour du plug-in (https://imagej.net/SNT).
3. Analysez la longueur des neurites et la formation de griffes dendritiques en aveugle à l’aide de Simple Neurite Tracer. Téléchargez des images z-stack monocanal de CGN électroporées sur FIJI et cliquez sur Plugins | Segmentation | Traceur de neurite simple (Figure 3D).
4. Accédez au menu déroulant et sélectionnez Créer une visionneuse 3D (Figure 3D).
5. Faites défiler jusqu’à la base d’une dendrite, où elle se connecte à la cellule soma et commencez un chemin en cliquant sur la jonction. Tracez manuellement le chemin en cliquant sur les sections où le signal de remplissage de cellule est le plus lumineux, en appuyant sur [y] pour conserver la trace. Tracez jusqu’à l’extrémité de la dendrite si elle ne contient pas de griffe ou jusqu’à la base de la griffe et confirmez la trajectoire en appuyant sur [f] (Figure 4D).
6. Ensuite, tracez la griffe en commençant un chemin à la base de la structure et en traçant jusqu’à la fin de la neurite la plus longue. Tracez les branches secondaires et tertiaires en maintenant [ctrl] enfoncé sous Windows ou [alt] sous Mac OS et en cliquant sur le chemin. Confirmez le chemin en appuyant sur [f].
7. Observer que les mesures des traces sont visibles sur une fenêtre séparée; Additionnez toutes les mesures des branches de griffe (primaire, secondaire, tertiaire) pour obtenir la longueur totale de chaque griffe.
8. Pour analyser la surface et le volume cellulaire des CGN électroporés, téléchargez le logiciel d’analyse cellulaire Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
   REMARQUE: FIJI peut également être utilisé pour reconstruire des cellules en 3D à partir d’images z-stack à l’aide de plug-ins facilement disponibles et gratuits. De plus, il existe une fonction de rendu volumétrique dans Simple Neurite Tracer, mais Imaris a été utilisé pour les raisons décrites ci-dessous.
9. Téléchargez l’image z-stack d’un CGN électroporé sur Imaris. Accédez à la boîte à outils de reconstruction 3D en appuyant sur Surpasser.
10. Pour reconstruire le CGN, appuyez sur Surfaces et sélectionnez une région d’intérêt qui englobe l’intégralité de la cellule dans la fenêtre d’image. Une fois terminé, appuyez sur la flèche bleue vers l’avant dans le coin inférieur droit sous Créer.
11. Si l’image contient plusieurs canaux pour différents signaux, sélectionnez le canal contenant le CGN électroporé et appuyez sur la flèche bleue vers l’avant.
12. À l’aide du curseur, définissez le seuil souhaité qui correspond le plus précisément au signal de la cellule électroporée. Effectuez un zoom avant plus près de la surface de la cellule pour déterminer avec précision le seuil. Une fois terminé, appuyez sur la double flèche verte pour reconstruire la cellule et obtenir la surface et la taille du volume à partir des métadonnées.

Figure 3 : Analyse immunohistochimique et reconstruction tridimensionnelle de neurones granulaires électroporés. Des souris P7 CD-1 ont été électroporées avec une construction exprimant la GFP. Les cerveaux ont été collectés et soumis à l’immunohistochimie, à la microscopie confocale et à la reconstruction 3D pour l’analyse morphologique. (A) Chronologie entre l’électroporation et le traitement de l’image d’une souris à 10 DPI. B) Image de projection maximale d’une section transversale sagittale du cervelet électroporé 10-DPI; Les lignes blanches délimitent les couches cérébelleuses et la barre d’échelle est de 25 μm. (C) L’image de projection maximale d’un seul neurone granulaire électroporé 10-DPI et la trace 3D correspondante, la barre d’échelle est de 10 μm. (D) Les reconstructions 3D ont été générées à l’aide du plugin FIJI Simple Neurite Tracer. Toutes les mesures ont été tracées à travers la pile z, en suivant le signal de remplissage de cellule. Les mesures de l’arbre et des griffes ont été tracées séparément pour chaque dendrite; La ligne pointillée indique une partie de la dendrite dans le plan actuel. Abréviations : 3D = tridimensionnel; GFP = protéine fluorescente verte; DPI = jours après l’injection; PSD-95 = protéine de densité postsynaptique 95; PNB = progéniteurs de neurones granulaires; PFA = paraformaldéhyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Figure 4 : Analyse de la morphologie des neurones granulaires au cours du développement cérébelleux. A) Images de projection maximale des CGN électroporés de 3 DPI à 14 DPI (âge postnatal P10 à P21), noyaux (bleu) et GFP (vert); Les pointes de flèches indiquent une dendrite individuelle et la barre d’échelle est de 10 μm. (B) Nombre moyen de de...

Discussion

Les neurones granulaires cérébelleux sont les neurones les plus abondants dans le cerveau des mammifères, représentant près de 60 à 70% de la population totale de neurones dans le cerveau des rongeurs ^1,14. Le cervelet a été largement utilisé pour élucider les mécanismes de prolifération cellulaire, de migration, de formation de dendrites et de développement des synapses 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Betadine	Purdue Production	67618-150-17
Cemented 10 µL needle	Hamilton	1701SN (80008)	33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style
Chicken anti-GFP	Millipore Sigma	AB16901	Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration
Cotton-tip applicator
Donkey anti-chicken Cy2	Jackson ImmunoResearch	703-225-155	Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration
Ethanol (200 proof)	Koptec	V1016
Electroporator ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0052
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
FUGW plasmid	Addgene	14883
Glass slides	VWR	48311-703	Superfrost plus
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Heating pad	Softheat
Hoescht 33342 fluorescent dye	Invitrogen	62249
Imaris	Bitplane
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Micro cover glass	VWR	48382-138
Nail polish	Sally Hansen	Color 109
Normal goat serum	Gibco	16210064
O.C.T. embedding compound	Tissue-Tek	4583
Olympus MVX10 Dissecting Scope	Olympus	MVX10
P200 pipette reach tip	Fisherbrand	02-707-138	Used for needle spacer
Parafilm	Bemis	PM-996
PBS pH 7.4 (10x)	Gibco	70011-044
Simple Neurite Tracer	FIJI		https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions
Sucrose	Sigma	S0389
Surgical tools	RWD Life Science		Small scissors and tweezers
Triton X-100	Roche	11332481001	non-ionic detergent
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489	5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Vectashield mounting media	Vectashield	H1000
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Zeiss 780 Upright Confocal	Zeiss	780