ゼブラフィッシュ胚の簡易かつ効果的な移植装置

要約

細胞の駆出や移植などの発生学的操作は、早期の発達を研究するための重要なツールです。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚でこれらの操作を行う簡単で効果的な移植装置を記述する。

要約

細胞の除去や胚の内外への細胞移植などの古典的な胚学的操作は、複雑な発達過程を研究するための強力な技術です。ゼブラフィッシュ胚は、簡単にアクセスでき、サイズが比較的大きく、透明であるため、これらの操作に理想的です。しかし、以前に開発された細胞の除去および移植のための装置は、使用するのが面倒であるか、購入するのに高価である。対照的に、ここで提示される移植装置は経済的で、組み立てやすく、使いやすい。本プロトコルでは、まず、移植装置の取り扱いならびにその組み立てについて、市販品や広く入手可能な部品から紹介する。次に、局所的な供給源からのシグナル分散を研究するための異所性クローンの生成、サイズ縮小胚を生成するための細胞の駆除、および母体ザイゴティック変異体を生成するための生殖細胞移植の3つの用途を提示する。最後に、このツールは、日本の米魚メダカなどの他の種の発生操作にも使用できることを示しています。

概要

胚^軸1の形成を指示する主催者の存在を実証したマンゴールドとスペマンの古典的な実験から、胚間の細胞移植は胚発生を研究するための確立された技術となっている2,3,4,5,6,7,8,90 .移植に一般的に使用されるセットアップは、柔軟なチューブを介してマイクロピペットホルダーに接続されたマイクロメーター駆動制御ガスタイトシリンジと鉱物油で満たされた貯水池12,13で構成されています^12,13。この設定では、シリンジのプランジャーがねじを通って移動します。この方法で発生する圧力は、マイクロピペットに移され、ある胚から細胞を引き出し、別の胚に堆積させるために使用される。しかし、この油圧式装置は多くの部品から成り、最初から組み立てるのは面倒である。同様のデバイスは、通常は手動マイクロインジェクターとして販売される完全なワーキングセットとして購入することができ、これらの商用バージョンは通常1500米ドル以上の費用がかかります。自家製と市販の両方のバージョンでは、胚操作用のマイクロピペットは、油で満たされたチューブを介して圧力発生装置(気密注射器)から分離されます。したがって、マイクロピペットの操作とプランジャーの動きは、異なる手で別々に操作する必要があり、スループットと有用性を低下させます。さらに、チューブは気泡の形成を避けながら油で慎重に充填する必要があるため、移植の準備には手間がかかります。ここでは、安価で組み立てやすく、使いやすい細胞の除去および移植のための代替空気圧操作装置について説明する。

ここに示す装置はマイクロピペットのホールダーが付く25 μLのガスタイトなシリンジから成り、費用は80米ドル以下である。装置はLuerロックの付属品によってシリンジにマイクロピペットのホールダーを挿入することによって容易に組み立てられる(図1A)。その後、デバイスをマイクロマニピュレーターに直接取り付け、ユーザーはマイクロマニピュレータで直接片手で位置と吸引の両方を制御することができます。これは、ドナーおよび宿主胚を含む移植皿を安定させ、移動させるために他方の手を自由に残すのが便利である。装置は空気と直接吸引によって働き、鉱物油で満たされる必要はない。水とガラス針の壁の間の魅力的な力のために、水位がガラス針の先細り端にある限り、注射器のプランジャーの大きな動きは、針内の水位の小さな動きに変換されます。これにより、吸引細胞の数とその挿入位置を正確に制御できます。

この装置の有用性を実証するために、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)胚に3つの応用を提示する。まず、分泌されたシグナル伝達分子の局所的な発生源を生成する方法を示し、この分子を用いて、勾配形成の研究に使用できる^{2,4,6を示す}。ここで、ドナー胚は、蛍光標識されたシグナル伝達分子をコードするmRNAを注入する。蛍光標識ドナー細胞は、次いで野生型宿主胚に移植され、シグナル勾配の形成を画像化して分析することができる。次に、この装置を使用して、サイズ縮小胚^5,13を生成するために駆除によって細胞を除去する方法を説明する。最後に、胚芽がアブラジレートされた宿主胚に原始胚細胞レポーターを運ぶ細胞を移植することによって、母体-接合体突然変異体を強固に産生する方法を示^す。将来的には、ここで説明する移植装置は、細胞の除去または移植を必要とする他の胚学的操作に容易に適応することができる。

プロトコル

1. 移植装置の組み立てと使用

1. 移植装置を組み立てる。
   1. Luerチップ25 μLガスタイトシリンジとマイクロピペットホルダーをLuerロックフィッティングで接続して、移植装置を組み立てます(図1A)。
      注:水の薄膜でLuerの先端を濡らすと、水の密着と凝集を介して部品を一緒に保持することにより、接続を強化することができます。
   2. デバイスを手動マイクロマニピュレータに直接マウントします(図1B)。装置は支配的な手だけで制御され、他の手を解放して追加の仕事をすることができる。
2. 移植針を準備する。
   1. マイクロピペットプーラーでガラスキャピラリーピペット(フィラメントなし)を引っ張って移植針を作製します。
   2. 鋭い縁が移植中に黄身を掻く可能性を高め、胚にとって致命的であるため、針の先端を可能な限り滑らかに壊します。
      注:先端は、立体顕微鏡下で直線状のカミソリの刃で簡単に壊すことができます。しかし、マイクロフォージを使用すると、所望のサイズの正確な開口部を生成することができます。異所源発生の場合、外径は約50~60μmに適しています。駆出および生殖細胞移植の場合、針の外径は約80〜90μmを測定して移植細胞の数を増やすべきである。
   3. すぐに使用できる針を移植装置に挿入します(図1A)。
3. 移植装置を用いた。
   1. 顕微鏡の横に移植装置を置いてマイクロマニピュレーターを置きます(図1B)。
   2. プランジャーを取り外し、リンガーの溶液(ステップ2.2.1参照)を充填した移植皿に移植針の先端が浸るまで45°の角度で下げます(図1B)。水は毛細血管の作用のために針を急ぐ。
   3. プランジャを約半分に挿入してリンガーの溶液を洗い流し、針の薄い先細りの部分に少量の水しか残しません(図1C)。
      注:これは中立的な位置であり、水位はしばらくの間(>20分)安定しているはずです。水位が不安定な場合は、空気が漏れています。Luerロックフィッティングを再接続するか、シリンジを交換してください。
   4. 移植用の針を初めて使用する場合は、犠牲胚から黄身を引き出し、黄身材料を完全に排出して内側にコーティングします。コーティングは、その後の手順でガラスに細胞の付着を減らすのに役立ちます。
   5. ドナー胚を針の助けを借りてそっと位置決めし、針の開口を胚の表面に直交させる(図1D)。
      注:位置はアッセイによって異なります。異所性シグナル伝達分子の発生源と細胞駆出の場合、これは動物の極の上部になります(図1E)。生殖細胞系列移植の場合、これがマージンになります(図1D、F)。
   6. ゆっくりと慎重にプランジャーを引き上げて、針に細胞を引き込みます。
      メモ:セルの取り込み速度が速すぎると、損傷を受ける可能性があります。正しく行われれば、セルは円筒形の列として出てきます。移植された黄身は宿主胚にとって有毒であるため、卵黄を針に取り込まないようにしてください。
   7. 所望の数の細胞が引き込まれたら、プランジャーを少し押し下げて吸引を止めます。短く、迅速な動きで横に針をけいれんすることによって、胚から針を取り除きます。細胞カラムの両側にRingerの溶液を残し、細胞を針の先細り端部に制限します(図1C,D)。
      注:細胞列の前の液体は、細胞列を堆積させるときに宿主胚の細胞を強制的に離すのに役立ちます。
   8. 残りの黄身や細胞の破片を、針を浸したまま、プランジャーをゆっくりと上下に動かして、リンガーの溶液で細胞を洗い流します。正しく行われれば、損傷を受けていない細胞は、破片が洗い流されている間、柱に一緒に接着されたままになります。
      注:水位は針の先細り端を越えて上昇するので、このステップ中に細心の注意を払う必要があります。これは、細胞を洗浄するために使用することができる水の突然の流入を引き起こす。しかし、水位が先細りの端を通過すると、プランジャーによる細かい制御が減少し、プランジャーをよりゆっくりと慎重に移動する必要があります。
   9. 移植皿を非支配的な手で動かし、宿主胚の表面(動物の棒またはマージン)に直交する針を配置する(図1D-F)。
   10. 穏やかに圧力を加え、そして宿主胚の包み込む層を突き刺すために速く鋭い動きを与える。針で黄身を傷つけないように注意してください。
       注:ウェルの壁に慎重に絞ることによって胚にわずかな圧力をかけると、胚の表面張力が増加し、包み込み層のピアスが容易になります。
   11. 針が中に入ったら、プランジャーを軽く押し込み、細胞の柱を胚に押し出しながら、針をゆっくりと引っ込めます(図1D-F)。
4. 移植針を洗浄する。
   1. 針を脱イオン水に浸しながらプランジャーを上下に動かして針をすすきます。
      注:針が汚れたままの場合は、水で再びすすいする前に、10 Mの水酸化ナトリウム溶液ですすいでください。
   2. さらに使用するために適切なボックスに針を保管してください。

2. ゼブラフィッシュ胚における分泌シグナル伝達分子の異所発生源の生成

1. 宿主およびドナー胚を準備する。
   1. ゼブラフィッシュを交配して、新しく産んだ胚を収集します。
   2. デコリオネート1細胞期ゼブラフィッシュ胚は、小さなガラスペトリ皿で約15分間、プロナーゼ溶液の0.5mg/mLで最大100個の胚をインキュベートすることによって行う(この手順の詳細な説明は、ロジャース、K.W.ら¹⁴によって発表された)。
      注:あるいは、移植直前の高段階で胚がデコリオネートされることもありますが(ステップ2.2)、これは注射されたドナー胚と未注入の宿主胚を別々にデコリオ化する必要があります。
   3. 胚培地中の胚を200 mLビーカーに沈下する。
      注:デコリオネートブラストラとガストルラステージ胚は非常に繊細です。彼らの露出した黄身は、プラスチック表面に付着し、空気と接触すると破裂します。したがって、それらは完全に胚培地に浸漬し、ガラスピペットで移され、アガロースコーティングされた(胚培地の1%)プラスチック皿またはガラスペトリ皿のいずれかに維持されなければならない。
   4. 慎重に胚培地のほとんどを空にし、ゆっくりと新鮮な胚培地でビーカーを満たす。この方法で引き起こされる軽度の攪拌は、弱ったころの除去を促進する。この手順を 2 ~3 回繰り返します。
   5. ガラスパスツールピペットを使用してデコリオネート胚をアガロースコーティングされた注射皿に移します。
      注:ブンゼンバーナー炎に曝してガラスパスツールピペットの先端を燃やすことは、胚への損傷を防ぐのに役立つ、エッジを溶かして滑らかにすることができます。
   6. 蛍光タグ付きタンパク質をコードするmRNAを胚のサブセットに注入する(この手順の詳細な説明は、ロジャース、K.W.ら¹⁴によって公開されています)。ほぼ均質な発現のために、卵黄ではなく細胞にmRNAを注入する。注入された胚はドナーとして機能し、未注入胚は宿主として機能する。
      注:注入されたmRNAの量と種類は、研究されているシグナル伝達分子に依存し、通常20〜^{200 pg2,4,5,6}の範囲(しかし、特定のケースでは1000 pgまで可能です⁴)。
   7. 注射した胚を、胚培地で満たされたアガロースコーティングされた6ウェル皿に移す。胚が初期の球段階に達するまで28°Cでインキュベートする。
2. 細胞を移植して異所性源を生成する。
   1. 移植皿(個々の三角形のくさび形の井戸で、材料表を参照)にリンガーの溶液(116 mM NaCl、2.8 mM KCl、1 mM CaCl2、5 mM HEPES;4°CでHEPESバッファーを保存)を充填します。
      注:リンガーの溶液中のカルシウムは細胞接着を促進し、胚が移植手順から治癒するのを助ける。
   2. 胚を移植皿に移す。
   3. 宿主およびドナー胚を交互のカラムに配置し、それぞれの場合に移植針に向けた動物の極を有する。
   4. セクション1.3に記載されているように移植を行う。異所性の移植のために、動物の極の上からソース細胞を取り出し、宿主胚の同じ位置に預ける(図1E)。
      注:ステップ1.3.8で詳述されているようにRingerの溶液で細胞を洗浄することは、既に分泌されたシグナル伝達分子が宿主に引き継がれていないことを確認するために、異所源生成のために重要です。ソースが分散されていないことを確認するためにあまりにも多くの細胞を移植しないでください。直径約80μm、長さ100μmのカラムは、多くの用途に適しています。
   5. 宿主胚が30分間から1時間リンガーの溶液にとどまるのを許して回復する。
   6. 蛍光体顕微鏡を用いて細胞を移植できたかどうかを調べる(図2)。
   7. 回収後、胚をアガロースコーティングされた6ウェルプレートに移し、28°Cでインキュベートする。

3. 細胞駆出によるサイズ縮小胚の生成

1. 駆出のための胚の準備。
   1. 所望の遺伝子型のゼブラフィッシュから新しく産んだ胚を収集します。
   2. 高い段階に達するまで、28°Cで胚をインキュベートします。
   3. 胚が高い段階に達したときにステップ2.1.2-2.1.5で説明したように胚をデコール化する。
      注: この例では、セルの押し出しは球の段階で実行されます。したがって、胚は約30分〜1時間早くデコリオネートされる。
2. 省略可能: 黄身の同期層 (YSL) のラベリング。
   注:必要に応じて、細胞を外出させる前に蛍光デックストランスをYSLに注入してください。この技術は、正常な胚発生¹⁵にとって重要である細胞除去後にYSLがそのまま残っているかどうかを判断することを可能にする。あるいは、 インビトロで 合成されたmRNAまたはタンパク質も、YSLに注入され得る。
   1. パスツールピペットを使用して、デコール化胚を胚水で満たされたアガロースコーティング注入皿に移します。
   2. 胚を横方向に向け、ブラスタードドルムマージンを注射針に向ける(図3A)。
   3. 1.5 μg/μL 10 kDa Alexa568-DextranをYSLに0.5 nL注入し、胚の直径の約3分の1の深さでブラストドルム細胞と黄身の間の領域を目指します。1行内のすべての胚を注入します。
      注:注射針は絨毛を貫通する必要がないので、小さい(〜4μm)と鋭い開口が有利です。
   4. 胚を180°回転させて、ブラストドルムマージンの反対側が注射針に向かるようにします(図3A)。
   5. ステップ3.2.3に記載されているように、1.5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextranの別の0.5 nLをYSLに注入し、胚当たり1nLの総注入量を得る。
      注:両側から注入すると、YSL内の蛍光デキストランをより均一に分布させることができます。
   6. 蛍光体顕微鏡で注射結果を調べる。正しく行えば、蛍光シグナルはYSL(図3B)に限定され、ブラスタードアルムの細胞間空間には見えません。
3. 押し出し細胞
   1. リンガーの溶液で移植皿を充填する(ステップ2.2.1を参照)。
   2. 胚を移植皿に移す。
   3. 移植針に向けて動物の棒で胚を向ける(図3C)。
   4. ステップ1.3.5-1.3.7に記載されているように、動物の棒領域から細胞を慎重に除去し、それによってブラストドアルムを所望のサイズに減らします。
   5. 移植針からそれらを排出することによって除去された細胞を捨てます.
   6. 処置が完了したら、胚が30分から1時間リンジャーの溶液にとどまるのを許容して回復する。
   7. 任意:蛍光体顕微鏡下でYSLの完全性を調べる(図3D)。
   8. 胚を胚培地で満たされたアガロースコーティングされたプレートに移し、28°Cでインキュベートする。

生殖細胞移植による母体接合変異体の作成

1. 宿主およびドナー胚を準備する。
   1. 突然変異体と野生型のゼブラフィッシュの両方から敷設された新しい胚を収集します。変異型の背景を持つゼブラフィッシュの胚はドナーとして機能し、野生型の背景を持つゼブラフィッシュの胚は宿主として機能する。
      注:生殖細胞移植は、成人期に生き残る生殖細胞移植の成功を確実にするために、多数の開始胚(ドナーの場合は〜50、宿主では〜500個)を必要とします。
   2. パスツールピペットを使用して胚培地でアガロースコーティング注入皿に胚を移す。
      注: 注入は、スループットを高めるためにデコールリオネーションの前に行われます。絨毛膜を通して注射するための針は鈍く、詰まりを防ぐために大きい開口部(約10μm)を有する必要がある。
   3. ドナー胚に100 ng/μL mRNAの1 nLを注入し、 Nos1 3'UTRでGFPをコードします。mRNAを黄身に注入して、スループットを高めます。
      注: nos1 3'UTRは原始生殖細胞のmRNAを安定化させ、1日の受精後に画像化すると生殖細胞が強く蛍光を発する¹⁰。
   4. 宿主胚に0.33 mM(3 μg/μL)の 行き止まり(dnd) モルフォリーノの1 nLを注入します。モルフォリノを黄身に注入して、スループットを向上させます。
      注: dnd モルフォリノは原始胚細胞形成をブロックし、移植後に宿主胚の生殖細胞にドナーからの細胞が排他的に移入されることを保証する¹⁰。
   5. 注入した胚を胚培地でプラスチックペトリ皿に移す。胚が高い段階に達するまで28°Cでインキュベートする。
   6. 胚が高い段階に達したときにステップ2.1.2-2.1.5で説明したように胚をデコール化する。
2. 生殖細胞の移植
   1. リンガーの溶液で移植皿を充填する(ステップ2.2.1を参照)。
   2. デコリオネートされた球体からドームステージの胚に移植皿に移す。
   3. 宿主胚とドナー胚を交互のカラムに配置し、1つのドナー胚から6つの異なる宿主胚に細胞を移植する。これにより、特定の宿主胚の胚が正常に移植される可能性が高まります。
   4. 移植針に向けてマージンを持つ胚を向け、セクション1.3に記載されているように移植を行う。生殖細胞移植(図1D,F)では、元細胞をマージン(原胚細胞が配置されている場所)から取り出し、宿主胚の同じ場所に沈着させる。
      注意:大きなカラム(直径約80μm、長さ600μm)を移植すると、生殖細胞系列移植に成功する可能性が高まります。
   5. 移植が完了したら、胚を30分間から1時間リンガーの溶液に留めて回復させます。
      注:すべてのドナー胚がホモ接合突然変異体であると予想されない場合(例えば、異種性のインクロスに起因する場合)、移植後に移植された将来の生殖細胞系列の遺伝子型を決定するために、移植後に遺伝子型化する必要があります。この場合、取り扱い中に宿主とドナー胚の位置が混ざらないようにしてください。
   6. 蛍光体顕微鏡を使用して、細胞が正常に移植されたかどうかを調べます(図4A、B)。
   7. 胚を24ウェルアガロースコーティングプレートに移します。同じドナーから細胞を受け取ったすべての宿主胚を同じ井戸にグループ化し、それに応じてラベルを付けます。28°Cで翌日までインキュベートします。
   8. 必要に応じて、ドナー胚を標識PCRストリップに移してジェノタイピングを行います。
3. 生殖細胞の移植に成功するためのスクリーニング
   1. 蛍光体後受精(hpf)約30時間の蛍光体顕微鏡下で生殖細胞移植に成功するために宿主胚をスクリーニングする。胚芽細胞は、卵黄伸展の上の溝に見られる(図4C)。
      注:ここで提示されたデバイスと戦略の典型的な実験は、ドナー胚ごとに移植された生殖細胞を運ぶ少なくとも1つの宿主胚を得るために〜60%-80%の成功率を有するであろう。以前の報告書は、〜10%の効率¹⁰を説明した。
   2. 該当する場合は、誤った遺伝子型を持つドナー胚から細胞を受け取った胚を捨てる。正常に正常に成長した生殖細胞を成人期に移植し、標準的な夫の状態と、制度的ガイドラインに従って幼虫を成長させます。

結果

上記3つの用途に対する移植装置の使用における成功及び失敗は、実体顕微鏡下での目視検査によって容易に評価することができる。移植に成功した場合、胚は胚芽に大きな涙を流すことなく、移植されていない胚と形と黄身の透明度が正常で似ているはずです。胚が目に見えて損傷している場合(図4B)、正常に発達しない。理想的には、蛍光マーカーを発現する移植細胞は、蛍光体顕微鏡下で見たときに連続カラムとして現れるべきである(図2A、 図4A)。カラムが断片化している場合、これは細胞が移植針への吸引によって切断されたか、細胞の沈着があまりにも激しく行われたことを示している。これは、プランジャーをよりゆっくりと穏やかに動かすことで防止できます。

移植装置は主に胚芽期^5,6のゼブラフィッシュ胚に用いられているが、日本の米魚メダカのデコリオネート胚(オリジアス・ラティプ)の移植および細胞駆出作業も同様に行われている(図2B)。ポラジンスキー、S.R.ら¹⁷によって記述されている胚のデコール化とは別に、上記と同様の手順に従うことができる。

生殖細胞系列移植の特定の場合、良好な移植は、卵黄のマージンの真上に細胞の長い水平列を有する胚をもたらす(図4A)。しかし、胚芽期におけるGFPの背景発現に起因して、胚細胞が正常に移植されたかどうかは、翌日(図4C-F)にのみ評価できる(図1F)。原始胚芽細胞は、卵黄の伸長のすぐ上の溝に小さな蛍光球として現れます(図4C-E)。正しい場所にこれらの細胞が存在すると、生殖細胞の移植に成功したことを示しています。異なる形状を有する細胞は生殖細胞ではない(例えば、細長い細胞は典型的には筋細胞、図4F)。また、原始胚細胞が溝の外に見つかった場合、これは正常に移行できなかったことを意味し、胚の生殖細胞に寄与することはできません。最後に、移植された胚の一般的な形態は、移植されていない胚に似ているように見えるはずです(図4D)。尾を変形させず、頭を縮めたり、目を見失ったりしてはならない(図4E)。これらの欠陥は、一般的に、過剰に高いモルフォリノ濃度または移植中の胚損傷から生じる。ここで説明する生殖細胞移植実験は、実験者の経験に応じて、通常、ドナー胚の60%〜80%に対して正常に移植された胚6個中1〜2個をもたらす。したがって、40〜50個のホモ接合性ドナー胚の細胞を200〜300個の宿主胚に移植し、突然変異生殖細胞を有する約30個体を飼育する必要がある。

図1:移植装置の組み立てと使用法. (A)移植装置は、Luerロックフィッティングを介してマイクロピペットホルダーとガス密閉シリンジを接続することによって組み立てられる。移植のためのガラス針は、その後、マイクロピペットホルダーに挿入されます。(B)マイクロマニピュレーターに取り付けられた組み立て移植装置の写真(背景とラベルが画像から取り除かれたことに注意してください)。(C)移植装置を使用する場合、移植針の水位がテーパーエンドに残っていることを確認することが重要である。(D)この装置は、移植皿の個々の井戸に入れられたテレオスト胚から細胞を引き出し、挿入するために実体顕微鏡で使用される。(e)異所源の生成のために、細胞はドナー胚(i-ii)の動物極から採取され、宿主胚(iii-vi)の動物極に移される。(f) 生殖細胞移植の場合、生殖細胞が位置するドナー胚(i-ii)の余白から、より多くの細胞が採取される。次に、細胞は宿主胚(iii-vi)のマージンに移される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:細胞移植によるクローンの生成.(A)ゼブラフィッシュドナーからゼブラフィッシュ宿主胚への蛍光細胞(緑色)の順次移植によって生成される二重クローンの例。単一クローンと二重クローンを用いて、分泌されたシグナル伝達分子が、どのように時空間的勾配を形成するかを研究することができます^2,4,5,6.(B)トランスジェニックeGFP発現メダカドナー(ウィンブルドン)¹⁷から野生型メダカ宿主体に細胞を移植して生成した単一クローンの例。スケールバーは100 μmを表します。

図3:細胞駆出によってサイズ縮小胚を生成する(A)駆除によって細胞を除去する前に、YSLをYSLの2つの反対側に蛍光色素を注入することによって標識することができる。(B)YSL注射後の胚の例。(C)サイズ縮小胚を生成するために、動物の極から細胞が駆除⁵によって除去される。(D)細胞駆出後の胚の例。YSL はそのまま残ります。スケールバーは100 μmを表します。

図4:生殖細胞移植(A)宿主の周辺領域へのドナー細胞(緑色)の移植に成功した例。(B) 移植失敗の例宿主胚の黄身はひどく損傷し、胚は正常に発達することができない。(C)30hpfで、正常に移植された胚芽細胞は、黄身拡張の前領域の性腺中胚葉のみに見られる。(D)いくつかのGFP標識ドナー生殖細胞が宿主の将来の生殖腺に住む移植に成功した例。(E) 移植失敗の例生殖細胞は性腺中胚に達しているが、宿主胚は重度に変形し、正常に発達しない。(F) 移植失敗の例。正しい場所に移行できなかった蛍光生殖細胞は、生殖腺を再移植しません。スケールバーは100 μmを表します。D-Fの画像は、約50倍の総倍率で撮影されました。

ディスカッション

移植実験の成功は、実験者の細かい運動能力に強く依存しています。手続きを正常に行うためには、練習が必要です。しかし、ここで紹介する器械は市場の他の人と比較して学び、使用することは比較的容易であり、そして、一般的に、練習の数日しか必要とされる。

移植手順の成功は、いくつかの予防措置を取ることによって強化することができます。1つのステップは、マイクロマニピュレータが良質で、円滑な操作が可能であることを保証することです。立体顕微鏡に高い倍率を持つ眼を加えることは、胚に対して正確に針を配置するのに役立ちます。よく繁殖するゼブラフィッシュやメダカを使用して健康な胚を獲得し、取り扱い中(特にデコールリオネーションステップ中および後)に胚に損傷を与えないことに注意を払って、成功率も向上します。

遅延毒性の問題は、トラブルシューティングが難しくなることがあります。胚が数時間後に死んだが、移植直後ではない場合、黄身は針によって損傷を受けた(例えば、胚に深く入り込むなど)か、細胞があまりにも強引に放出された可能性がある。遅延毒性と胚死はまた、ドナー細胞と一緒に注入された黄身または細胞の破片から生じる可能性があります。別の原因は、リンガーの溶液中のHEPESバッファーを劣化させることがある。これらの問題は、細胞を洗浄することによって(ステップ1.3.8を参照)、または単にバッファーの新鮮なバッチを使用することによって、それぞれ克服することができます。さらに、生殖細胞移植実験における奇形宿胚は、過剰に高いモルフォリノ濃度から生じる可能性がある。宿主の野生型生殖細胞を完全にアブライズし、それによってこれらの細胞が子孫に寄与するのを防ぐのに十分なモルフォリノを使用することが重要であるが、同時に、過度に高いモルフォリノール濃度を避ける必要がある。したがって、注射されたすべての宿主胚(典型的な実験では数百個)にわたる一貫したモルフォリノ量が生殖細胞系列移植の成功の鍵となる。これは、すべての胚が同じ注入量を受け取ることを確実にするために蛍光体型顕微鏡で追跡することができる容易に目に見えるト^{レーサーdye14}でモルフォリノ注入ミックスを補うことによって助けることができる。

このプロトコルで説明されている手順は、ブラスタステージゼブラフィッシュまたはメダカ胚の細胞の操作のみを含むが、将来的には、移植針の直径と形状を変更することによって、異なる段階や種にデバイスを適応させることができる可能性が高い。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament			To make the transplantation needle
1.0 mm glass capillary, ends cut with filament			To make injection needles
200 mL glass beaker			For embryo dechorionation
24-well plastic plate			To be coated with agarose in order to incubate embryos
5 cm diameter glass Petri dish			For embryo dechorionation
6-well plastic plate			To be coated with agarose in order to incubate embryos
Agarose			To coat plastic dishes
dnd1 morpholino	Gene Tools		Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT
Embryo medium			250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source			To assess YSL injections and germ-line transplantations
Glass micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-1000	To make the transplantation needle
Glass pasteur pipette	Kimble Chase (via Fisher)	63A53WT	For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge
Incubator at 28 °C			For incubating zebrafish embryos
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series	Hamilton	Ref: 80201	Part of the transplantation device
Manual micromanipulator with 3 axes of movement	Narishige	M-152	For controlling the transplantation device
Manual pipetting pump	Bio-Tek	Cat. # 641	For use with the glass pipettes to transfer embryos
Metal dissecting probe			For moving and rotating zebrafish embryos
Microforge	Narishige	MF2	To make the transplantation needle
Microinjection apparatus			For injection of mRNA and morpholino into embryos
Microinjection molds, triangular grooves	Adaptive Science Tools	TU-1	To prepare microinjection plates with agarose
Microinjection-molds, single wells	Adaptive Science Tools	PT-1	To prepare transplantation plates with agarose
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary	World Precision Instruments	MPH6S10	Part of the transplantation device
mMessage mMachine Sp6 transcription kit	Life Technologies	AM1340M	To generate capped mRNA for injection into embryos
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR			Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1
Plastic petri dish 100 mm			To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes
Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P5147	For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos
Ringer’s solution			For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration
Stereomicroscope			For injection and transplantation