Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Riepilogo

Le manipolazioni embriologiche come l'estirpazione e il trapianto di cellule sono strumenti importanti per studiare lo sviluppo precoce. Questo protocollo descrive un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per eseguire queste manipolazioni in embrioni di zebrafish.

Abstract

Le manipolazioni embriologiche classiche, come la rimozione di cellule e il trapianto di cellule all'interno o tra gli embrioni, sono tecniche potenti per studiare complessi processi di sviluppo. Gli embrioni di zebrafish sono ideali per queste manipolazioni poiché sono facilmente accessibili, di dimensioni relativamente grandi e trasparenti. Tuttavia, i dispositivi sviluppati in precedenza per la rimozione e il trapianto di cellule sono ingombranti da usare o costosi da acquistare. Al contrario, il dispositivo di trapianto qui presentato è economico, facile da montare e semplice da usare. In questo protocollo, introduciamo innanzitutto la manipolazione del dispositivo di trapianto e il suo assemblaggio da parti commercialmente e ampiamente disponibili. Presentiamo quindi tre applicazioni per il suo utilizzo: generazione di cloni ectopici per studiare la dispersione del segnale da fonti localizzate, estirpazione di cellule per produrre embrioni di dimensioni ridotte e trapianto germinale per generare mutanti materno-zigoti. Infine, mostriamo che lo strumento può essere utilizzato anche per manipolazioni embriologiche in altre specie come il pesce riso giapponese medaka.

Introduzione

Dagli esperimenti classici di Mangold e Spemann che hanno dimostrato l'esistenza di un organizzatore che istruisce la formazione di un asse ^embrionale1, il trapianto di cellule tra embrioni è diventato una tecnica consolidata per studiare lo sviluppo embrionale2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Una configurazione comunemente usata per il trapianto consiste in una siringa a tenuta di gas controllata da micrometri collegata a un supporto per micropipette tramite tubi flessibili e un serbatoio riempito con olio ^{minerale12,13}. In questa configurazione, lo stantuffo della siringa viene spostato attraverso una vite. La pressione generata in questo modo viene trasferita alla micropipetta e utilizzata per estrarre le cellule da un embrione e depositarle in un altro. Tuttavia, questo dispositivo azionato idraulicamente è costituito da molte parti ed è laborioso da assemblare da zero. Dispositivi simili possono anche essere acquistati come set di lavoro completo, di solito venduti come microiniettori manuali, e queste versioni commerciali in genere costano più di 1500 US $. Sia nella versione fatta in casa che in quella commerciale, la micropipetta per la manipolazione degli embrioni viene separata dal dispositivo di generazione della pressione (la siringa a tenuta di gas) attraverso tubi riempiti di olio. La manipolazione della micropipetta e il movimento dello stantuffo, quindi, devono essere azionati separatamente con mani diverse, riducendo la produttività e l'utilità. Inoltre, i dispositivi sono ingombranti da preparare per il trapianto poiché il tubo deve essere accuratamente riempito con olio evitando la formazione di bolle. Qui, descriviamo un dispositivo alternativo ad azionamento pneumatico per la rimozione e il trapianto di cellule che è economico, facile da assemblare e semplice da usare.

Il dispositivo qui presentato comprende una siringa a tenuta di gas da 25 μL dotata di un supporto per micropipette e costa complessivamente meno di 80 DOLLARI. Il dispositivo può essere facilmente assemblato inserendo il supporto della micropipetta nella siringa tramite il raccordo Luer lock (Figura 1A). Il dispositivo viene quindi montato direttamente su un micromanipolatore, consentendo all'utente di controllare sia la sua posizione che l'aspirazione con una sola mano direttamente sul micromanipolatore. Questo lascia convenientemente l'altra mano libera di stabilizzare e spostare il piatto di trapianto contenente embrioni donatori e ospiti. Il dispositivo funziona per aspirazione diretta con aria e non ha bisogno di essere riempito con olio minerale. A causa delle forze attrattive tra l'acqua e le pareti dell'ago di vetro, un grande movimento nello stantuffo della siringa si traduce in un movimento più piccolo nel livello dell'acqua all'interno dell'ago, purché il livello dell'acqua sia nell'estremità affusolata dell'ago di vetro. Ciò consente un controllo preciso sul numero di celle aspirate e sulla posizione del loro inserimento.

Per dimostrare l'utilità di questo dispositivo, presentiamo tre applicazioni negli embrioni di zebrafish (Danio rerio). In primo luogo, mostriamo come generare fonti localizzate di molecole di segnalazione secrete, che possono essere utilizzate per studiare la formazione del gradiente2,4,6. Qui, gli embrioni donatori vengono iniettati con mRNA che codifica una molecola di segnalazione marcata fluorescentemente. Le cellule donatrici marcate con fluorescenza vengono quindi trapiantate in embrioni ospiti wild-type dove la formazione di un gradiente di segnale può essere ripresa e analizzata. In secondo luogo, descriviamo come il dispositivo può essere utilizzato per rimuovere le cellule per estirpazione al fine di generare embrioni di dimensioni ^ridotte5,13. Infine, mostriamo come produrre in modo robusto mutanti materno-zigoti trapiantando cellule portatrici di un reporter di cellule germinali primordiali in embrioni ospiti in cui la linea germinale era stata ablatata6,10. In futuro, il dispositivo di trapianto qui descritto può essere facilmente adattato ad altre manipolazioni embriologiche che richiedono la rimozione o il trapianto di cellule.

Protocollo

1. Assemblaggio e utilizzo del dispositivo di trapianto

1. Assemblaggio del dispositivo di trapianto.
   1. Collegare la siringa a tenuta di gas Luer tip 25 μL e un supporto per micropipette con raccordo Luer lock per assemblare il dispositivo di trapianto (Figura 1A).
      NOTA: Bagnare la punta Luer con un sottile film d'acqua può aiutare a migliorare la connessione tenendo insieme le parti tramite adesione e coesione dell'acqua.
   2. Montare il dispositivo direttamente su un micromanipolatore manuale (Figura 1B). Il dispositivo può essere controllato con la sola mano dominante, liberando l'altra mano per compiti aggiuntivi.
2. Preparazione dell'ago da trapianto.
   1. Produrre un ago da trapianto tirando una pipetta capillare di vetro (senza filamento) con un estrattore di micropipette.
   2. Rompere la punta dell'ago nel modo più fluido possibile, poiché i bordi taglienti aumentano la possibilità di graffiare il tuorlo durante il trapianto, che è fatale per l'embrione.
      NOTA: la punta può essere facilmente rotta con una lama di rasoio a bordo dritto sotto uno stereomicroscopio. Tuttavia, l'utilizzo di un microforge consente di generare un'apertura precisa della dimensione desiderata. Per la generazione di sorgenti ectopiche, è appropriato un diametro esterno di circa 50-60 μm. Per le estirpazioni e il trapianto germinale, il diametro esterno dell'ago deve misurare circa 80-90 μm per aumentare il numero di cellule trapiantate.
   3. Inserire l'ago pronto all'uso nel dispositivo di trapianto (Figura 1A).
3. Utilizzando il dispositivo di trapianto.
   1. Posizionare il micromanipolatore con il dispositivo di trapianto accanto a uno stereomicroscopio (Figura 1B).
   2. Rimuovere lo stantuffo e abbassare l'ago da trapianto nella capsula da trapianto riempita con la soluzione di Ringer (vedere punto 2.2.1) con un angolo di 45° fino a quando la punta dell'ago non è immersa (Figura 1B). L'acqua farà scorrere l'ago a causa dell'azione capillare.
   3. Inserire lo stantuffo circa a metà strada per scovare le soluzioni del Ringer, lasciando solo un piccolo volume d'acqua nella parte sottile e affusolata dell'ago (Figura 1C).
      NOTA: Questa è la posizione neutra e il livello dell'acqua dovrebbe essere stabile lì per un po '(>20 min). Se il livello dell'acqua è instabile, l'aria perde; ricollegare il raccordo Luer lock o sostituire la siringa.
   4. Quando si utilizza un ago da trapianto per la prima volta, rivestirlo all'interno disegnando il tuorlo da un embrione sacrificato e quindi espellendo completamente il materiale del tuorlo. Il rivestimento contribuirà a ridurre l'aderenza delle cellule al vetro durante le procedure successive.
   5. Posizionare delicatamente l'embrione donatore con l'aiuto dell'ago e quindi posizionare l'apertura dell'ago ortogonale alla superficie dell'embrione (Figura 1D).
      NOTA: la posizione sarà diversa per i diversi test. Per la generazione di sorgenti molecolari di segnalazione ectopica ed estirpazioni cellulari, questa sarà la parte superiore del polo animale (Figura 1E); per il trapianto germinale, questo sarà il margine (Figura 1D,F).
   6. Lentamente e con attenzione tirare su lo stantuffo per attirare le cellule nell'ago.
      NOTA: se le cellule vengono prelevate troppo rapidamente, possono essere danneggiate. Se fatto correttamente, le celle dovrebbero uscire come una colonna cilindrica. Evitare di prendere il tuorlo nell'ago, poiché il tuorlo trapiantato è tossico per l'embrione ospite.
   7. Arrestare l'aspirazione spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso leggermente una volta che il numero desiderato di celle viene aspirato. Rimuovere l'ago dall'embrione spingendo l'ago di lato con un movimento breve e rapido. Lasciare una soluzione di Ringer su entrambi i lati della colonna cellulare e limitare le cellule all'estremità affusolata dell'ago (Figura 1C,D).
      NOTA: Il liquido davanti alla colonna cellulare aiuterà a forzare le cellule degli embrioni ospiti durante il deposito della colonna cellulare.
   8. Eliminare eventuali tuorli o detriti cellulari rimanenti muovendo lentamente lo stantuffo su e giù - mentre l'ago rimane immerso - per lavare le cellule con la soluzione di Ringer. Se fatto correttamente, le cellule non danneggiate rimarranno aderenti insieme in una colonna mentre i detriti vengono lavati via.
      NOTA: Durante questa fase è necessario prestare molta attenzione poiché il livello dell'acqua salirà oltre l'estremità affusolata dell'ago. Ciò causerà un improvviso afflusso di acqua, che può essere utilizzata per lavare le cellule. Tuttavia, una volta che il livello dell'acqua ha superato l'estremità affusolata, il controllo fine con lo stantuffo sarà ridotto e lo stantuffo deve essere spostato più lentamente e con attenzione.
   9. Spostare la capsula da trapianto con la mano non dominante per posizionare l'ago ortogonale sulla superficie (polo animale o margine) dell'embrione ospite (Figura 1D-F).
   10. Applicare delicatamente una leggera pressione, quindi dare un movimento rapido e brusco per perforare lo strato avvolgente dell'embrione ospite. Fare attenzione a non graffiare il tuorlo con l'ago.
       NOTA: L'applicazione di una leggera pressione sull'embrione schiacciandolo con cura contro le pareti del pozzo aumenta la tensione superficiale dell'embrione e facilita così il piercing dello strato avvolgente.
   11. Una volta che l'ago è all'interno, spingere delicatamente lo stantuffo per estrudere la colonna di cellule nell'embrione mentre si ritrae lentamente l'ago allo stesso tempo (Figura 1D-F).
4. Pulizia dell'ago da trapianto.
   1. Risciacquare l'ago spostando lo stantuffo su e giù mentre l'ago è immerso in acqua deionizzata.
      NOTA: Se l'ago rimane sporco, sciacquarlo con 10 M di soluzione di idrossido di sodio prima di risciacquarlo nuovamente con acqua.
   2. Conservare l'ago in una scatola appropriata per un ulteriore utilizzo.

2. Generazione di sorgenti ectopiche di molecole di segnalazione secrete in embrioni di zebrafish

1. Preparazione degli embrioni dell'ospite e del donatore.
   1. Raccogli embrioni appena deposti accoppiando il pesce zebra.
   2. Deciona embrioni di zebrafish allo stadio di 1 cellula incubando fino a 100 embrioni in 0,5 mg/mL di soluzione di pronasi per circa 15 minuti in una piccola capsula di Petri di vetro (una descrizione dettagliata di questa procedura è stata pubblicata da Rogers, K. W. et ^al.14).
      NOTA: In alternativa, gli embrioni possono anche essere decorionati nella fase alta appena prima del trapianto (fase 2.2), ma ciò richiede che gli embrioni donatori iniettati e gli embrioni ospiti non iniettati siano decorionati separatamente.
   3. Immergere gli embrioni in terreno embrionale in un becher da 200 ml.
      NOTA: Gli embrioni di blastula decorionata e gastrula sono molto delicati. Il loro tuorlo esposto aderisce alle superfici plastiche e si rompe a contatto con l'aria. Quindi, devono rimanere completamente immersi nel mezzo embrionale, trasferiti con un pipetto di vetro e mantenuti in piatti di plastica rivestiti di agarosio (1% in mezzo embrionale) o piastre di Petri di vetro.
   4. Svuotare con cura la maggior parte del mezzo embrionale e riempire lentamente il becher con un mezzo embrionale fresco. La lieve agitazione causata in questo modo faciliterà la rimozione dei cori indeboliti. Ripeti questo passaggio 2-3 volte.
   5. Trasferire gli embrioni decorionati utilizzando una pipetta pasteur di vetro in una piastra per iniezione rivestita di agarosio.
      NOTA: Infiammare la punta della pipetta Pasteur di vetro esponendola a una fiamma del bruciatore Bunsen può sciogliere e levigare il bordo, contribuendo a prevenire danni agli embrioni.
   6. Iniettare l'mRNA che codifica la proteina marcata fluorescentemente in un sottoinsieme di embrioni (una descrizione dettagliata di questa procedura è stata pubblicata da Rogers, K. W. et ^al.14). Iniettare l'mRNA nella cellula, non nel tuorlo, per un'espressione quasi omogenea. Gli embrioni iniettati serviranno come donatori, mentre gli embrioni non iniettati serviranno come ospiti.
      NOTA: La quantità e il tipo di mRNA iniettato dipenderanno dalla molecola di segnalazione studiata e di solito varia da 20 a 200 ^pg2,4,5,6 (ma può arrivare fino a 1000 pg in alcuni ^casi4).
   7. Trasferire gli embrioni iniettati in un piatto a sei pozzetti rivestito di agarosio riempito con terreno embrionale. Incubare a 28 °C fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio iniziale della sfera.
2. Trapianto di cellule per generare fonti ectopiche.
   1. Riempire una capsula da trapianto (con singoli pozzetti triangolari a forma di cuneo, vedere Tabella dei materiali) con la soluzione di Ringer (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; conservare il tampone HEPES a 4 °C).
      NOTA: Il calcio nella soluzione di Ringer favorisce l'adesione cellulare e aiuta l'embrione a guarire dalla procedura di trapianto.
   2. Trasferire gli embrioni nel piatto di trapianto.
   3. Posizionare gli embrioni ospiti e donatori in colonne alternate, in ogni caso con il palo animale orientato verso l'ago del trapianto.
   4. Effettuare il trapianto come descritto al paragrafo 1.3. Per il trapianto di origine ectopica, prelevare le cellule sorgente dalla parte superiore del polo animale e depositarle nella stessa posizione nell'embrione ospite (Figura 1E).
      NOTA: Il lavaggio delle cellule con la soluzione di Ringer come descritto nel passaggio 1.3.8 è importante per la generazione di sorgenti ectopiche per assicurarsi che le molecole di segnalazione già secrete non vengano trasportate all'ospite. Non trapiantare troppe cellule per garantire che la fonte non sia dispersa. Una colonna di circa 80 μm di diametro e 100 μm di lunghezza è adatta per molte applicazioni.
   5. Lasciare che l'embrione ospite rimanga nella soluzione di Ringer per 30 minuti a 1 ora per recuperare.
   6. Esaminare se le cellule sono state trapiantate con successo utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 2).
   7. Dopo il recupero, trasferire gli embrioni in una piastra a sei pozzetti rivestita di agarosio riempita con terreno embrionale e incubarli a 28 °C.

3. Generazione di embrioni con dimensioni ridotte mediante estirpazione cellulare

1. Preparare gli embrioni per l'estirpazione.
   1. Raccogli embrioni appena deposti da zebrafish del genotipo desiderato.
   2. Incubare gli embrioni a 28 °C fino a raggiungere lo stadio più alto.
   3. Decoerniare gli embrioni come descritto nelle fasi 2.1.2-2.1.5 quando gli embrioni raggiungono lo stadio più alto.
      NOTA: in questo esempio, l'estirpazione delle celle viene eseguita nella fase della sfera. Di conseguenza, gli embrioni vengono deconizionati circa 30 minuti a 1 ora prima.
2. Facoltativo: etichettatura dello strato sinciziale del tuorlo (YSL).
   NOTA: Se lo si desidera, iniettare dextrans fluorescente nell'YSL prima di estirpare le cellule. Questa tecnica consente di determinare se l'YSL rimane intatto dopo la rimozione delle cellule, che è importante per la normale embriogenesi15. In alternativa, gli mRNA o le proteine sintetizzati in vitro possono anche essere iniettati nell'YSL.
   1. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire gli embrioni decorionati in una piastra di iniezione rivestita di agarosio riempita con acqua embrionale.
   2. Orientare gli embrioni lateralmente, con il margine del blastoderma rivolto verso l'ago da iniezione (Figura 3A).
   3. Iniettare 0,5 nL di 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran nella YSL, mirando a una regione tra le cellule del blastoderma e il tuorlo ad una profondità di circa un terzo del diametro dell'embrione. Iniettare tutti gli embrioni all'interno di una riga.
      NOTA: Poiché l'ago per iniezione non ha bisogno di perforare il corion, un'apertura piccola (~ 4 μm) e affilata è vantaggiosa.
   4. Ruotare gli embrioni di 180° in modo che il lato opposto del margine del blastoderma sia rivolto verso l'ago per iniezione (Figura 3A).
   5. Iniettare altri 0,5 nL di 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran nella YSL come descritto nel passaggio 3.2.3, ottenendo un volume totale di iniezione di 1 nL per embrione.
      NOTA: l'iniezione da due lati consente una distribuzione più uniforme del destrano fluorescente all'interno dell'YSL.
   6. Esaminare il risultato dell'iniezione sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Se fatto correttamente, il segnale fluorescente sarà limitato alla YSL (Figura 3B) e non sarà visibile nello spazio intercellulare del blastoderma.
3. Estirpazione delle cellule
   1. Riempire una capsula da trapianto con la soluzione di Ringer (vedere il passaggio 2.2.1).
   2. Trasferire gli embrioni nella piastra di trapianto.
   3. Orientare gli embrioni con il palo animale verso l'ago del trapianto (Figura 3C).
   4. Rimuovere con attenzione le cellule dalla regione del polo animale come descritto nei passaggi 1.3.5-1.3.7, riducendo così il blastoderma alla dimensione desiderata.
   5. Scartare le cellule rimosse espellendole dall'ago del trapianto.
   6. Una volta completata la procedura, lasciare che gli embrioni rimangano nella soluzione di Ringer per 30 minuti a 1 ora per recuperare.
   7. FACOLTATIVO: Esaminare l'integrità dell'YSL in uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 3D).
   8. Trasferire gli embrioni in una piastra rivestita di agarosio riempita con terreno embrionale e incubarli a 28 °C.

4. Creazione di mutanti materno-zigoti mediante trapianto germinale

1. Preparazione di embrioni ospiti e donatori.
   1. Raccogli embrioni appena deposti da pesci zebra sia mutanti che selvatici. Gli embrioni di zebrafish con uno sfondo mutante serviranno come donatori, mentre gli embrioni di zebrafish con uno sfondo di tipo selvatico serviranno come ospiti.
      NOTA: Il trapianto germinale richiede un numero elevato di embrioni iniziali (~ 50 per i donatori, ~ 500 per gli ospiti) per garantire un buon numero di trapianti germinali di successo che sopravvivono fino all'età adulta.
   2. Trasferire gli embrioni in una capsula per iniezione rivestita di agarosio con mezzo embrionale utilizzando una pipetta Pasteur.
      NOTA: le iniezioni vengono eseguite prima della deconionezione per aumentare la produttività. Gli aghi per iniezione attraverso il corion devono essere smussati e avere un'apertura più grande (~ 10 μm) per evitare l'intasamento.
   3. Iniettare gli embrioni donatori con 1 nL di mRNA 100 ng/μL codificante GFP con un nos1 3'UTR. Iniettare l'mRNA nel tuorlo per aumentare la produttività.
      NOTA: Il nos1 3'UTR stabilizzerà l'mRNA nelle cellule germinali primordiali, causando una forte fluorescenza delle cellule germinali quando fotografate 1 giorno dopo la ^{fecondazione10}.
   4. Iniettare gli embrioni ospiti con 1 nL di 0,33 mM (3 μg/μL) di morfolino senza uscita (dnd ). Iniettare il morfolino nel tuorlo per aumentare la produttività.
      NOTA: Il morfolino dnd blocca la formazione di cellule germinali primordiali, il che garantisce che la linea germinale dell'embrione ospite sarà popolata esclusivamente con cellule del donatore dopo il ^trapianto10.
   5. Trasferire gli embrioni iniettati in piastre di Petri di plastica con mezzo embrionale. Incubare a 28 °C fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio più alto.
   6. Decoerniare gli embrioni come descritto nelle fasi 2.1.2-2.1.5 quando gli embrioni raggiungono lo stadio più alto.
2. Trapianto di cellule germinali
   1. Riempire una capsula da trapianto con la soluzione di Ringer (vedere il passaggio 2.2.1).
   2. Trasferire gli embrioni decorionati in fase di cupola nella piastra di trapianto.
   3. Posizionare gli embrioni ospiti e gli embrioni donatori in colonne alternate per trapiantare le cellule da un embrione donatore a sei diversi embrioni ospiti. Ciò aumenta la possibilità che le cellule germinali di un determinato embrione ospite vengano trapiantate con successo.
   4. Orientare gli embrioni con il margine verso l'ago del trapianto ed effettuare il trapianto come descritto al paragrafo 1.3. Per i trapianti germinali (Figura 1D, F), prendere le cellule sorgente dal margine (dove si trovano le cellule germinali primordiali) e depositarle nella stessa posizione nell'embrione ospite.
      NOTA: il trapianto di una colonna di grandi dimensioni (circa 80 μm di diametro e 600 μm di lunghezza) aumenterà la possibilità di ottenere un trapianto germinale di successo.
   5. Lasciare che l'embrione rimanga nella soluzione di Ringer per 30 minuti a 1 ora per recuperare una volta completato il trapianto.
      NOTA: Se non ci si aspetta che tutti gli embrioni donatori siano mutanti omozigoti - ad esempio, se derivano da un incrocio eterozigote - devono essere genotipizzati dopo il trapianto per determinare il genotipo della futura linea germinale trapiantata dell'ospite. In questo caso, assicurarsi che le posizioni degli embrioni ospiti e donatori non siano confuse durante la manipolazione.
   6. Utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza per esaminare se le cellule sono state trapiantate con successo (Figura 4A,B).
   7. Trasferire gli embrioni in una piastra rivestita di agarosio a 24 pozzetti. Raggruppare tutti gli embrioni ospiti che hanno ricevuto cellule dallo stesso donatore nello stesso pozzo ed etichettarli di conseguenza. Incubarli fino al giorno successivo a 28 °C.
   8. Se necessario, trasferire gli embrioni donatori in strisce PCR etichettate per la genotipizzazione.
3. Screening per trapianti germinali di successo
   1. Esaminare gli embrioni ospiti per trapianti germinali di successo sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza di circa 30 ore dopo la fecondazione (hpf). Le cellule germinali si trovano nel solco sopra l'estensione del tuorlo (Figura 4C).
      NOTA: Gli esperimenti tipici con il dispositivo e la strategia qui presentati avranno un tasso di successo di ~ 60% -80% per ottenere almeno un embrione ospite che trasporta cellule germinali trapiantate per embrione donatore. Un rapporto precedente descriveva un'efficienza del ~ 10%¹⁰.
   2. Se del caso, scartare gli embrioni che hanno ricevuto cellule da embrioni donatori con un genotipo errato. Coltiva larve con cellule germinali trapiantate con successo fino all'età adulta secondo le condizioni di allevamento standard e seguendo le linee guida istituzionali.

Risultati

Il successo e il fallimento nell'uso del dispositivo di trapianto per le tre applicazioni sopra descritte possono essere facilmente valutati mediante ispezione visiva sotto uno stereomicroscopio. Nei trapianti di successo, l'embrione dovrebbe apparire normale e simile nella forma e nella chiarezza del tuorlo agli embrioni non trapiantati, senza grandi lacrime nel blastoderma. Se l'embrione è visibilmente danneggiato (Figura 4B), non si svilupperà normalmente. Idealmente, le cellule trapiantate che esprimono un marcatore fluorescente dovrebbero apparire come una colonna continua se viste sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 2A, Figura 4A). Se la colonna è frammentata, ciò indica che le cellule sono state tranciate dall'aspirazione nell'ago del trapianto o che la deposizione delle cellule è stata eseguita troppo vigorosamente. Questo può essere evitato spostando lo stantuffo più lentamente e delicatamente.

Sebbene il dispositivo di trapianto sia stato utilizzato principalmente su embrioni di zebrafish in fase di ^blastula5,6, il trapianto e l'estirpazione cellulare funzionano altrettanto bene per gli embrioni decorionati allo stadio di blastula del pesce riso giapponese medaka (Oryzias latipes) (Figura 2B). Oltre alla decorionazione embrionale, che è stata descritta da Porazinski, S. R. et ^al.17, possono essere seguite le stesse procedure sopra descritte.

Nel caso specifico del trapianto germinale, un buon trapianto si tradurrà in un embrione con una lunga colonna orizzontale di cellule direttamente sopra il margine del tuorlo (Figura 4A). Tuttavia, se le cellule germinali sono state trapiantate con successo può essere valutato solo il giorno successivo (Figura 4C-F) a causa dell'espressione di fondo della GFP negli stadi di blastula (Figura 1F). Le cellule germinali primordiali appariranno come piccole sfere fluorescenti nel solco direttamente sopra l'estensione del tuorlo (Figura 4C-E). La presenza di queste cellule nella posizione corretta indica il successo del trapianto germinale. Le cellule con una forma diversa non sono cellule germinali (ad esempio, le cellule allungate sono tipicamente cellule muscolari, Figura 4F). Inoltre, se le cellule germinali primordiali si trovano al di fuori del solco, ciò significa che non sono riuscite a migrare correttamente e non saranno in grado di contribuire alla linea germinale dell'embrione. Infine, la morfologia generale degli embrioni trapiantati dovrebbe apparire simile agli embrioni non trapiantati (Figura 4D); la coda non deve essere deformata e la testa non deve essere rimpicciolita o manca di occhi (Figura 4E). Questi difetti derivano generalmente da concentrazioni di morfolino eccessivamente elevate o da danni agli embrioni durante il trapianto. Gli esperimenti di trapianto germinale come descritto qui si tradurranno in genere in 1-2 su 6 embrioni ospiti con cellule germinali trapiantate con successo per il 60% -80% degli embrioni donatori, a seconda dell'esperienza dello sperimentatore. Pertanto, le cellule di 40-50 embrioni donatori omozigoti devono essere trapiantate in 200-300 embrioni ospiti per allevare circa 30 individui con cellule germinali mutanti.

Figura 1: Assemblaggio e utilizzo del dispositivo di trapianto. (A) Il dispositivo di trapianto viene assemblato collegando una siringa a tenuta di gas con un supporto per micropipette tramite raccordo Luer lock. L'ago di vetro per il trapianto viene quindi inserito nel supporto della micropipetta. (B) Fotografia del dispositivo di trapianto assemblato montato su un micromanipolatore (si prega di notare che lo sfondo e le etichette sono stati rimossi dall'immagine). (C) Quando si utilizza il dispositivo di trapianto, è importante assicurarsi che il livello dell'acqua nell'ago da trapianto rimanga all'estremità affusolata. (D) Il dispositivo è utilizzato sotto uno stereomicroscopio per prelevare e inserire cellule da e verso embrioni di teleostei collocati in singoli pozzetti di una parabola da trapianto. (E) Per la generazione di sorgenti ectopiche, le cellule sono prelevate dal polo animale di un embrione donatore (i-ii) e trasferite nel polo animale di un embrione ospite (iii-vi). (F) Per il trapianto germinale, un numero maggiore di cellule viene prelevato dal margine di un embrione donatore (i-ii), dove si trovano le cellule germinali. Le cellule vengono quindi trasferite nel margine degli embrioni ospiti (iii-vi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Generazione di cloni mediante trapianto di cellule. (A) Esempio di un doppio clone generato mediante trapianto sequenziale di cellule fluorescenti (verdi) da un donatore di zebrafish in un embrione ospite di zebrafish. Cloni singoli e doppi possono essere utilizzati per studiare come le molecole di segnalazione secrete formano gradienti spaziotemporali2,4,5,6. (B) Esempio di un singolo clone generato dal trapianto di cellule da un donatore medaka transgenico che esprime eGFP (Wimbledon)¹⁷ in un ospite medaka wild-type. Le barre di scala rappresentano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Generazione di embrioni di dimensioni ridotte mediante estirpazione cellulare. (A) Prima di rimuovere le cellule per estirpazione, l'YSL può essere etichettato iniettando coloranti fluorescenti in due lati opposti della YSL. (B) Esempio di embrione dopo iniezione di YSL. (C) Per generare embrioni di dimensioni ridotte, le cellule del polo animale vengono rimosse mediante estirpazione5. (D) Esempio di embrione dopo estirpazione cellulare. Si noti che l'YSL rimane intatto. Le barre di scala rappresentano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Trapianto germinale. (A) Esempio di trapianto riuscito di cellule donatrici (verdi) nella zona marginale dell'ospite. (B) Esempio di trapianto fallito. Il tuorlo dell'embrione ospite è stato gravemente danneggiato e l'embrione non sarà in grado di svilupparsi normalmente. (C) A 30 hpf, le cellule germinali trapiantate con successo si troveranno esclusivamente nel mesoderma gonadico nella regione anteriore dell'estensione del tuorlo. (D) Esempio di un trapianto riuscito in cui diverse cellule germinali di donatori marcate GFP hanno popolato la futura gonade dell'ospite. (E) Esempio di trapianto fallito. Sebbene le cellule germinali abbiano raggiunto il mesoderma gonadico, l'embrione ospite è gravemente deformato e non si svilupperà normalmente. (F) Esempio di trapianto fallito. Le cellule germinali fluorescenti che non sono riuscite a migrare nella posizione corretta non ripopoleranno le gonadi. Le barre della scala rappresentano 100 μm. Le immagini in D-F sono state scattate con un ingrandimento totale di circa 50x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il successo di un esperimento di trapianto si basa fortemente sulle capacità motorie dello sperimentatore. Per eseguire con successo le procedure, è necessaria la pratica. Tuttavia, lo strumento qui presentato è relativamente facile da imparare e utilizzare rispetto ad altri sul mercato e, in generale, sono necessari solo pochi giorni di pratica.

Il successo della procedura di trapianto può essere migliorato prendendo diverse precauzioni. Un passo è garantire che il micromanipolatore sia di buona qualità e in grado di funzionare senza intoppi. L'aggiunta di un oculare con ingrandimento più elevato allo stereomicroscopio può aiutare a posizionare con precisione l'ago rispetto all'embrione. L'uso di zebrafish o medaka ben allevati per acquisire embrioni sani e fare attenzione a non danneggiare gli embrioni durante la manipolazione (specialmente durante e dopo la fase di decoriorazione) migliorerà anche il tasso di successo.

I problemi con la tossicità ritardata possono essere più difficili da risolvere. Se un embrione muore dopo poche ore - ma non immediatamente dopo il trapianto - il tuorlo potrebbe essere stato danneggiato dall'ago (ad esempio, entrando nell'embrione troppo in profondità), o forse le cellule sono state espulse con troppa forza. La tossicità ritardata e la morte embrionale possono anche derivare da tuorlo o detriti cellulari iniettati insieme alle cellule donatrici; un'altra causa può essere il deterioramento del buffer HEPES nella soluzione di Ringer. Questi problemi possono essere superati lavando le celle (vedi punto 1.3.8) o semplicemente utilizzando un nuovo lotto di tampone, rispettivamente. Inoltre, gli embrioni ospiti deformati negli esperimenti di trapianto germinale potrebbero derivare da concentrazioni di morfolino eccessivamente elevate. È fondamentale utilizzare abbastanza morfolino per ablare completamente la linea germinale selvatica dell'ospite, impedendo così a queste cellule di contribuire alla prole - ma allo stesso tempo, è necessario evitare concentrazioni di morfolino eccessivamente elevate. Quantità consistenti di morfolino in tutti gli embrioni ospiti iniettati (poche centinaia in un esperimento tipico) sono quindi la chiave per il successo dei trapianti di linea germinale. Questo può essere aiutato integrando la miscela di iniezione di morfolino con un colorante tracciante facilmente ^visibile14, che può essere monitorato sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza per garantire che tutti gli embrioni ricevano lo stesso volume di iniezione.

Le procedure descritte in questo protocollo comportano esclusivamente manipolazioni di cellule in embrioni di zebrafish o medaka allo stadio di blastula, ma in futuro sarà probabilmente possibile adattare il dispositivo a diversi stadi e specie modificando il diametro e la forma dell'ago del trapianto.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament			To make the transplantation needle
1.0 mm glass capillary, ends cut with filament			To make injection needles
200 mL glass beaker			For embryo dechorionation
24-well plastic plate			To be coated with agarose in order to incubate embryos
5 cm diameter glass Petri dish			For embryo dechorionation
6-well plastic plate			To be coated with agarose in order to incubate embryos
Agarose			To coat plastic dishes
dnd1 morpholino	Gene Tools		Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT
Embryo medium			250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source			To assess YSL injections and germ-line transplantations
Glass micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-1000	To make the transplantation needle
Glass pasteur pipette	Kimble Chase (via Fisher)	63A53WT	For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge
Incubator at 28 °C			For incubating zebrafish embryos
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series	Hamilton	Ref: 80201	Part of the transplantation device
Manual micromanipulator with 3 axes of movement	Narishige	M-152	For controlling the transplantation device
Manual pipetting pump	Bio-Tek	Cat. # 641	For use with the glass pipettes to transfer embryos
Metal dissecting probe			For moving and rotating zebrafish embryos
Microforge	Narishige	MF2	To make the transplantation needle
Microinjection apparatus			For injection of mRNA and morpholino into embryos
Microinjection molds, triangular grooves	Adaptive Science Tools	TU-1	To prepare microinjection plates with agarose
Microinjection-molds, single wells	Adaptive Science Tools	PT-1	To prepare transplantation plates with agarose
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary	World Precision Instruments	MPH6S10	Part of the transplantation device
mMessage mMachine Sp6 transcription kit	Life Technologies	AM1340M	To generate capped mRNA for injection into embryos
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR			Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1
Plastic petri dish 100 mm			To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes
Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P5147	For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos
Ringer’s solution			For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration
Stereomicroscope			For injection and transplantation