Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Özet

Hücrelerin ekstirpasyonu ve nakli gibi embriyolojik manipülasyonlar erken gelişimi incelemek için önemli araçlardır. Bu protokol, zebra balığı embriyolarında bu manipülasyonları gerçekleştirmek için basit ve etkili bir transplantasyon cihazını tanımlar.

Özet

Hücrelerin çıkarılması ve embriyoların içinde veya arasında hücrelerin nakledilmeleri gibi klasik embriyolojik manipülasyonlar, karmaşık gelişimsel süreçleri incelemek için güçlü tekniklerdir. Zebra balığı embriyoları bu manipülasyonlar için idealdir, çünkü kolayca erişilebilir, nispeten büyük ve şeffaftırlar. Bununla birlikte, hücre kaldırma ve transplantasyon için daha önce geliştirilen cihazların kullanımı hantal veya satın alınması pahalıdır. Buna karşılık, burada sunulan transplantasyon cihazı ekonomik, montajı kolay ve kullanımı kolaydır. Bu protokolde ilk olarak transplantasyon cihazının elleçlemesinin yanı sıra ticari ve yaygın olarak bulunan parçalardan montajını da tanıtıyoruz. Daha sonra kullanımı için üç uygulama sunuyoruz: lokalize kaynaklardan sinyal dağılımını incelemek için ektopik klonların üretimi, boyut azaltılmış embriyolar üretmek için hücrelerin ekstürpasyonu ve maternal-zigotik mutantlar üretmek için germline nakli. Son olarak, aracın Japon pirinç balığı medaka gibi diğer türlerde embriyolojik manipülasyonlar için de kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Giriş

Mangold ve Spemann'ın embriyonik eksen oluşumunu öğreten bir organizatörün varlığını gösteren klasik ^{deneylerinden1}, embriyolar arasındaki hücrelerin nakli embriyonik gelişimi incelemek için yerleşik bir teknik haline gelmiştir2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Transplantasyon için yaygın olarak kullanılan bir kurulum, esnek borular aracılığıyla bir mikropipette tutucuya bağlı mikrometre tahrik kontrollü gaz geçirmez şırınga ve mineral yağ ile dolu bir ^{rezervuardan oluşur12,13}. Bu kurulumda, şırınnanın pistonu bir vidadan taşınır. Bu şekilde oluşan basınç mikropipte aktarılır ve hücreleri bir embriyodan çıkarmak ve diğerine yatırmak için kullanılır. Bununla birlikte, hidrolik olarak çalıştırılan bu cihaz birçok parçadan oluşur ve sıfırdan montajı zahmetlidir. Benzer cihazlar, genellikle Manuel Mikroinjektörler olarak satılan eksiksiz bir çalışma seti olarak da satın alınabilir ve bu ticari sürümler genellikle 1500 US$'dan daha pahalıdır. Hem ev yapımı hem de ticari versiyonda, embriyo manipülasyonu için mikropipette, yağ dolu borular aracılığıyla basınç üreten cihazdan (gaz geçirmez şırınga) ayrılır. Mikropipette manipülasyonu ve pistonun hareketi, bu nedenle, verimi ve faydayı azaltarak farklı ellerle ayrı ayrı çalıştırılmalıdır. Ayrıca, tüplerin kabarcık oluşumunu önlerken dikkatlice yağ ile doldurulması gerektiğinden, cihazlar transplantasyona hazırlanmak için hantaldır. Burada, hücre çıkarma ve transplantasyon için ucuz, montajı kolay ve kullanımı kolay alternatif bir pnömatik olarak çalıştırılır cihazı tarif ediyoruz.

Burada sunulan cihaz, bir mikropipette tutucu ile donatılmış 25 μL gaz geçirmez şırıngadan oluşur ve toplam 80 US $ 'dan daha düşük maliyetlidir. Cihaz, mikropipette tutucu luer kilit bağlantı elemanı ile şırıngaya yerleştirilerek kolayca monte edilir (Şekil 1A). Cihaz daha sonra doğrudan bir mikromanipülatöre monte edilir ve kullanıcının hem konumunu hem de emmeyi doğrudan mikromanipülatörde tek bir elle kontrol etmesini sağlar. Bu, diğer eli donör ve konak embriyoları içeren transplantasyon çanağını stabilize etmek ve hareket ettirmek için rahat bir şekilde serbest bırakır. Cihaz hava ile doğrudan emiş ile çalışır ve mineral yağ ile doldurulması gerekmez. Su ile cam iğnenin duvarları arasındaki çekici kuvvetler nedeniyle, şırınganın pistonunda bulunan büyük bir hareket, su seviyesi cam iğnenin konik ucunda olduğu sürece, iğne içindeki su seviyesinde daha küçük bir harekete çevrilir. Bu, aspire edilmiş hücrelerin sayısı ve yerleştirmelerinin konumu üzerinde hassas kontrol sağlar.

Bu cihazın yararını göstermek için zebra balığı (Danio rerio) embriyolarında üç uygulama sunuyoruz. İlk olarak, gradyan oluşumunu incelemek için kullanılabilecek salgılanan sinyal moleküllerinin lokalize kaynaklarının nasıl üretileceğini gösteriyoruz2,4,6. Burada donör embriyolara floresan etiketli bir sinyal molekülüne mRNA kodlaması enjekte edilir. Floresan etiketli donör hücreler daha sonra bir sinyal gradyanı oluşumunun görüntülenebildiği ve analiz edilebildiği vahşi tip konak embriyolara nakledilür. İkinci olarak, cihazın boyut küçültülmüş embriyolar oluşturmak için ekstirpasyonla hücreleri çıkarmak için nasıl kullanılabileceğini ^{açıklıyoruz5,13}. Son olarak, ilkel bir mikrop hücresi muhabiri taşıyan hücreleri, mikrop hattının ablated edildiği konak embriyolara naklederek anne-zigotik mutantların nasıl sağlam bir şekilde üretilmeyeceğimizi ^{gösteriyoruz6,10}. Gelecekte, burada açıklanan transplantasyon cihazı, hücrelerin çıkarılmasını veya naklini gerektiren diğer embriyolojik manipülasyonlara kolayca uyarlanabilir.

Protokol

1. Transplantasyon cihazının montajı ve kullanılması

1. Transplantasyon cihazının montajı.
   1. Luer ucunu 25 μL gaz geçirmez şırınga ve bir mikropipette tutucuyu, transplantasyon cihazını monte etmek için Luer kilit bağlantı elemanı ile bağlayın (Şekil 1A).
      NOT: Luer ucunu ince bir su filmi ile ıslatmak, parçaları su yapışıklığı ve uyum yoluyla bir arada tutarak bağlantıyı artırmaya yardımcı olabilir.
   2. Cihazı doğrudan manuel bir mikromanipülatöre monte etme (Şekil 1B). Cihaz sadece baskın elle kontrol edilebilir ve diğer eli ek görevler için serbest bırakır.
2. Transplantasyon iğnesi hazırlanıyor.
   1. Bir mikropipette çekme ile cam kılcal pipet (filamentsiz) çekerek bir transplantasyon iğnesi üretin.
   2. Keskin kenarlar, embriyo için ölümcül olan nakil yaparken yumurta sarısını çizme şansını artırdığından, iğnenin ucunu mümkün olduğunca pürüzsüz bir şekilde kırın.
      NOT: Ucu stereomikroskop altında düz kenarlı bir jiletle kolayca kırılabilir. Bununla birlikte, bir mikroforge kullanmak, istenen boyutta hassas bir açıklık oluşturulmasını sağlar. Ektopik kaynak üretimi için yaklaşık 50-60 μm dış çap uygundur. Ekstürpasyonlar ve germline nakli için, iğnenin dış çapı, nakledilen hücre sayısını artırmak için yaklaşık 80-90 μm ölçülmelidir.
   3. Kullanıma hazır iğneyi transplantasyon cihazına takın (Şekil 1A).
3. Transplantasyon cihazını kullanarak.
   1. Mikromanipülatörü transplantasyon cihazı ile birlikte stereomikroskopun yanına yerleştirin (Şekil 1B).
   2. Pistonu çıkarın ve transplantasyon iğnesini, iğnenin ucu batırılana kadar 45° açıyla Ringer çözeltisi ile dolu transplantasyon kabına 45° açıyla 2.2.1'e üfleyin (Şekil 1B). Kılcal damar etkisi nedeniyle su iğneye hücum edecektir.
   3. Zilin çözeltilerini temizlemek için pistonu yaklaşık yarıya kadar yerleştirin ve iğnenin ince, konik kısmında sadece küçük bir su bırakın (Şekil 1C).
      NOT: Bu nötr konumdur ve su seviyesi orada bir süre sabit olmalıdır (>20 dk). Su seviyesi dengesizse, hava sızıyor; Luer kilit montajını yeniden bağlayın veya şırınnayı değiştirin.
   4. İlk kez bir transplantasyon iğnesi kullanırken, kurban edilen bir embriyodan yumurta sarısı çekerek ve daha sonra yumurta sarısı malzemesini tamamen dışarı atarak içini kapla. Kaplama, sonraki prosedürler sırasında hücrelerin cama yapışmasını azaltmaya yardımcı olacaktır.
   5. Donör embriyoyu iğne yardımıyla hafifçe konumlandırın ve ardından iğne açıklığı ortogonalini embriyonun yüzeyine yerleştirin (Şekil 1D).
      NOT: Pozisyon farklı tahliller için farklı olacaktır. Ektopik sinyal molekülü kaynak üretimi ve hücre ekstirpasyonları için, bu hayvan direğinin üst kısmı olacaktır (Şekil 1E); germline nakli için bu marj olacaktır (Şekil 1D,F).
   6. Hücreleri iğneye çekmek için yavaşça ve dikkatlice pistonu yukarı çekin.
      NOT: Hücreler çok hızlı bir şekilde alınırsa, zarar görebilirsiniz. Doğru yapılırsa, hücreler silindirik bir sütun olarak çıkmalıdır. Nakledilen yumurta sarısı konak embriyo için toksik olduğundan, iğneye yumurta sarısı almaktan kaçının.
   7. İstenilen sayıda hücre çekildikten sonra pistonu hafifçe aşağı iterek emiş yapmayı durdurun. İğneyi kısa ve hızlı bir hareketle yana doğru mastürbasyon yaparak embriyodan çıkarın. Ringer'ın çözümünü hücre sütununun her iki tarafına bırakın ve hücreleri iğnenin konik ucuyla sınırlayın (Şekil 1C,D).
      NOT: Hücre kolonunun önündeki sıvı, hücre sütununu biriktirirken konak embriyoların hücrelerini ayırmaya yardımcı olacaktır.
   8. Hücreleri Ringer'ın çözeltisiyle yıkamak için pistonu yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirerek kalan yumurta sarısı veya hücre kalıntılarını temizleyin - iğne daldırılmış olarak kalırken. Doğru yapılırsa, hasarsız hücreler enkaz yıkanırken bir sütunda birbirine yapışmış olarak kalacaktır.
      NOT: Su seviyesi iğnenin konik ucundan yükseleceğinden, bu adım sırasında büyük özen verilmelidir. Bu, hücreleri yıkamak için kullanılabilecek ani bir su akışına neden olacaktır. Bununla birlikte, su seviyesi konik ucu geçtikten sonra, pistonla ince kontrol azaltılır ve pistonun daha yavaş ve dikkatli bir şekilde hareket ettirilmesi gerekir.
   9. İğne ortogonalini konak embriyonun yüzeyine (hayvan direği veya marjı) konumlandırmak için transplantasyon çanağını baskın olmayan elle hareket ettirin (Şekil 1D-F).
   10. Hafifçe basınç uygulayın ve ardından konak embriyonun saran tabakasını delmek için hızlı ve keskin bir hareket verin. Yumurta sarısını iğneyle çizmemeye dikkat edin.
       NOT: Embriyoyu kuyunun duvarlarına dikkatlice sıkarak hafif basınç uygulamak embriyonun yüzey gerilimini arttırır ve böylece saran tabakanın delinmesine kolaylaşır.
   11. İğne içeri girdikten sonra, iğneyi aynı anda yavaşça geri alırken hücre sütununu embriyoya ekstrüde etmek için pistonu hafifçe itin (Şekil 1D-F).
4. Transplantasyon iğnesini temizlemek.
   1. İğne deiyonize suya batırılırken pistonu yukarı ve aşağı hareket ettirerek iğneyi durulayın.
      NOT: İğne kirli kalırsa, tekrar suyla durulamadan önce 10 M sodyum hidroksit çözeltisi ile durulayın.
   2. İğneyi daha fazla kullanım için uygun bir kutuda saklayın.

2. Zebra balığı embriyolarında salgılanan sinyal moleküllerinin ektopik kaynaklarının oluşturulması

1. Konak ve donör embriyolarının hazırlanması.
   1. Zebra balıklarını çift veya çift yaparak taze yerleştirilmiş embriyoları toplayın.
   2. 1 hücreli evre zebra balığı embriyolarını, küçük bir cam Petri kabında yaklaşık 15 dakika boyunca 0,5 mg/mL pronaz çözeltisinde 100 embriyoya kadar kuluçkaya yatırarak deforionat edin (bu prosedürün ayrıntılı bir açıklaması Rogers, K. W. ve ^ark.14 tarafından yayınlanmıştır).
      NOT: Alternatif olarak, embriyolar nakilden hemen önce yüksek aşamada da dekoryone edilebilir (adım 2.2), ancak bu enjekte edilen donör embriyoların ve seçilmemiş konak embriyoların ayrı ayrı dehorionasyonunu gerektirir.
   3. Embriyoları embriyo ortamına 200 mL'lik bir beherde batırın.
      NOT: Dekonsiyonlu blastula ve gastrula evre embriyoları çok hassastır. Maruz kaldıkları yumurta sarısı plastik yüzeylere yapışacak ve hava ile temas halinde yırtılacaktır. Bu nedenle, tamamen embriyo ortamına daldırılmış, cam pipetle aktarılmış ve agarose kaplı (embriyo ortamında% 1) plastik kaplarda veya cam Petri kaplarında tutulmalıdırlar.
   4. Embriyo ortamının çoğunu dikkatlice boşaltın ve kabı yavaşça taze embriyo ortamıyla doldurun. Bu şekilde oluşan hafif ajitasyon zayıflamış koronların giderilmesini kolaylaştıracaktır. Bu adımı 2-3 kez tekrarlayın.
   5. Aforizyonlu embriyoları cam pastör pipet kullanarak agarose kaplı bir enjeksiyon kabına aktarın.
      NOT: Cam Pasteur pipet ucunu Bir Bunsen brülör alevine maruz kalarak alev almak, embriyoların zarar görmesini önlemeye yardımcı olarak kenarı eritebilir ve pürüzsüz hale getirebilir.
   6. Floresan etiketli proteini kodlayan mRNA'yı embriyoların bir alt kümesine enjekte edin (bu prosedürün ayrıntılı bir açıklaması Rogers, K. W. ve ^ark.14 tarafından yayınlanmıştır). Neredeyse homojen ifade için mRNA'yı yumurta sarısına değil hücreye enjekte edin. Enjekte edilen embriyolar donör, seçilmemiş embriyolar ise konak olarak görev yapacaktır.
      NOT: Enjekte edilen mRNA miktarı ve türü çalışılan sinyal molekülüne bağlı olacaktır ve genellikle 20 ila 200 ^pg2,4,5,6 arasında değişmektedir (ancak belirli durumlarda 1000 pg kadar yüksek ^olabilir4).
   7. Enjekte edilen embriyoları embriyo ortamı ile dolu agarose kaplı altı kuyulu bir tabağa aktarın. Embriyolar erken küre aşamasına gelene kadar 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
2. Ektopik kaynaklar üretmek için hücrelerin nakledilmeleri.
   1. Bir transplantasyon kabını (üçgen kama şeklindeki kuyularla, bkz. Malzeme Masası) Ringer çözeltisi (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES ile doldurun; HEPES tamponunu 4 °C'de saklayın).
      NOT: Ringer'ın çözeltislerindeki kalsiyum hücre yapışıklıklarını teşvik eder ve embriyonun transplantasyon prosedüründen iyileşmesine yardımcı olur.
   2. Embriyoları transplantasyon kabına aktarın.
   3. Konak ve donör embriyoları, her durumda hayvan kutbu transplantasyon iğneye doğru yönlendirilmiş olarak alternatif kolonlara yerleştirin.
   4. Transplantasyonu bölüm 1.3'te açıklandığı gibi gerçekleştirin. Ektopik kaynak nakli için kaynak hücreleri hayvan direğinin tepesinden alın ve konak embriyoda aynı yere yatırın (Şekil 1E).
      NOT: Hücrelerin 1.3.8 adımında ayrıntılı olarak açık olduğu gibi Ringer çözeltisi ile yıkanması, ektopik kaynak üretimi için zaten salgılanan sinyal moleküllerinin ana bilgisayara taşınmamasını sağlamak için önemlidir. Kaynağın dağılmamasını sağlamak için çok fazla hücre nakletmeyin. Yaklaşık 80 μm çapında ve 100 μm uzunluğunda bir sütun birçok uygulama için uygundur.
   5. Konak embriyonun iyileşmesi için Ringer'ın çözeltisinde 30 dakika ila 1 saat kalmasına izin verin.
   6. Hücrelerin floresan stereomikroskop kullanılarak başarıyla nakledilip nakledilmediğini inceleyin (Şekil 2).
   7. İyileştikten sonra, embriyoları embriyo ortamı ile dolu agarose kaplı altı kuyulu bir plakaya aktarın ve 28 ° C'de kuluçkaya yatırın.

3. Hücre ekstürpasyonu ile boyut küçültülmüş embriyolar üretmek

1. Embriyoların ekstirpasyona hazırlanması.
   1. İstenilen genotipin zebra balıklarından taze yerleştirilmiş embriyoları toplayın.
   2. Embriyoları yüksek aşamaya ulaşana kadar 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
   3. Embriyolar yüksek aşamaya ulaştığında 2.1.2-2.1.5 adımlarında açıklandığı gibi embriyoları kaynatın.
      NOT: Bu örnekte, hücre ekspasyonu küre aşamasında gerçekleştirilir. Buna göre, embriyolar yaklaşık 30 dk ila 1 saat daha erken kaynatılır.
2. İsteğe bağlı: Sarısı senktial katmanın (YSL) etiketlanması.
   NOT: İsterseniz, hücreleri dışarı çıkarmadan önce YSL'ye floresan dekstrans enjekte edin. Bu teknik, normal ^{embriyogenez15} için önemli olan hücre çıkarıldıktan sonra YSL'nin bozulmadan kalıp kaldığını belirlemeye izin verir. Alternatif olarak, in vitro sentezlenmiş mRNA'lar veya proteinler de YSL'ye enjekte edilebilir.
   1. Dekonsiyone embriyoları embriyo suyu ile dolu agarose kaplı bir enjeksiyon kabına aktarmak için bir Pasteur pipet kullanın.
   2. Blastoderm marjı enjeksiyon iğnesini işaret ederek embriyoları yanal olarak yönlendirin (Şekil 3A).
   3. YSL'ye 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran'ın 0,5 nL'sini enjekte edin, bu da blastoderm hücreleri ile yumurta sarısı arasında embriyonun çapının yaklaşık üçte biri derinliğinde bir bölgeyi hedefleyin. Tüm embriyoları bir sıraya enjekte edin.
      NOT: Enjeksiyon iğnesinin koroyonu delmesi gerekmediğinden, küçük (~4 μm) ve keskin bir açıklık avantajlıdır.
   4. Embriyoları 180° döndürün, böylece blastoderm marjının karşı tarafı enjeksiyon iğnesini işaret eder (Şekil 3A).
   5. 3.2.3 adımında açıklandığı gibi YSL'ye 1.5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran'ın 0.5 nL'lik bir kısmını enjekte ederek embriyo başına toplam 1 nL enjeksiyon hacmi elde edin.
      NOT: İki taraftan enjekte etmek, YSL içinde floresan dektranın daha eşit bir şekilde dağıtılmasını sağlar.
   6. Floresan stereomikroskop altında enjeksiyonun sonucunu inceleyin. Doğru yapılırsa, floresan sinyal YSL (Şekil 3B) ile sınırlanacak ve blastoderm'in hücreler arası alanında görünmez.
3. Hücreleri dışarı çıkarma
   1. Bir transplantasyon kabını Ringer'ın çözeltisiyle doldurun (bkz. adım 2.2.1).
   2. Embriyoları transplantasyon kabına aktarın.
   3. Embriyoları hayvan kutbu ile transplantasyon iğnesi doğru yönlendirin (Şekil 3C).
   4. 1.3.5-1.3.7 adımlarında açıklandığı gibi hücreleri hayvan direği bölgesinden dikkatlice çıkarın, böylece blastodermi istenen boyuta düşürür.
   5. Çıkarılan hücreleri transplantasyon iğnesinden atarak atın.
   6. İşlem tamamlandıktan sonra, embriyoların iyileşmesi için Ringer'ın çözeltisinde 30 dakika ila 1 saat kalmasına izin verin.
   7. İsteğE BAĞLI: Floresan stereomikroskop altında YSL'nin bütünlüğünü inceleyin (Şekil 3D).
   8. Embriyoları embriyo ortamı ile dolu agarose kaplı bir plakaya aktarın ve 28 °C'de kuluçkaya yatırın.

4. Germline transplantasyonu ile maternal-zigotik mutantların oluşturulması

1. Konak ve donör embriyolarının hazırlanması.
   1. Hem mutant hem de vahşi tip zebra balıklarından taze yerleştirilmiş embriyoları toplayın. Mutant geçmişi olan zebra balıklarından elde edilen embriyolar donör, vahşi tip geçmişe sahip zebra balıklarından elde edilen embriyolar ise konak görevi görecek.
      NOT: Germline transplantasyonu, yetişkinliğe kadar hayatta kalan çok sayıda başarılı germline nakli sağlamak için yüksek sayıda başlangıç embriyosu (donörler için ~ 50, konaklar için ~ 500) gerektirir.
   2. Embriyoları pastör pipet kullanarak embriyo ortamına sahip agarose kaplı bir enjeksiyon kabına aktarın.
      NOT: Enjeksiyonlar, verimi artırmak için kaynatmadan önce yapılır. Korondan enjeksiyon için iğnelerin kör olması ve tıkanmasını önlemek için daha büyük bir açıklığa (~ 10 μm) sahip olması gerekir.
   3. Donör embriyolara 100 ng/μL mRNA kodlama GFP'si 1 nL ile nos1 3'UTR enjekte edin. Aktarım hızını artırmak için mRNA'yı sarısına enjekte edin.
      NOT: Nos1 3'UTR, ilkel mikrop hücrelerindeki mRNA'yı stabilize edecek ve döllenme sonrası 1 gün görüntülendiğinde mikrop hücrelerinin güçlü bir şekilde floresan olmasına neden ^olacaktır10.
   4. Konak embriyolara 1 nL 0,33 mM (3 μg/μL) çıkmaz (dnd) morfoliino enjekte edin. Verimi artırmak için morfolini sarısına enjekte edin.
      NOT: Dnd morfotin, konak embriyonun germline'sının transplantasyondan sonra sadece donörden gelen hücrelerle doldurulmasını sağlayan ilkel mikrop hücresi oluşumunu ^engeller10.
   5. Enjekte edilen embriyoları embriyo ortamına sahip plastik Petri kaplarına aktarın. Embriyolar yüksek aşamaya ulaşana kadar 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
   6. Embriyolar yüksek aşamaya ulaştığında 2.1.2-2.1.5 adımlarında açıklandığı gibi embriyoları kaynatın.
2. Mikrop hücrelerinin nakli
   1. Bir transplantasyon kabını Ringer'ın çözeltisiyle doldurun (bkz. adım 2.2.1).
   2. Kafeinsiz küreyi kubbe evresi embriyolarına transplantasyon kabına aktarın.
   3. Hücreleri bir donör embriyodan altı farklı konak embriyoya nakletmek için konak embriyoları ve donör embriyoları alternatif kolonlara yerleştirin. Bu, belirli bir konak embriyodaki mikrop hücrelerinin başarıyla nakledilme şansını arttırır.
   4. Embriyoları kenar boşluğu ile transplantasyon iğneye doğru yönlendirin ve bölüm 1.3'te açıklandığı gibi nakli gerçekleştirin. Germline transplantasyonları için (Şekil 1D,F), kaynak hücreleri marjdan alın (ilkel mikrop hücrelerinin bulunduğu yer) ve konak embriyoda aynı yere biriktirin.
      NOT: Büyük bir kolonun (yaklaşık 80 μm çapında ve 600 μm uzunluğunda) nakledilmesi başarılı bir germline nakli elde etme şansını artıracaktır.
   5. Nakil tamamlandıktan sonra embriyonun iyileşmesi için Ringer'ın çözeltisinde 30 dakika ila 1 saat kalmasına izin verin.
      NOT: Tüm donör embriyoların homozigöz mutantlar olması beklenmiyorsa - örneğin, heterozipöz bir inkrostan kaynaklanıyorsa - konakçının nakledilen gelecekteki mikrop hattının genotipini belirlemek için transplantasyondan sonra genotiplenmeleri gerekir. Bu durumda, ele alma sırasında konak ve donör embriyoların pozisyonlarının karıştırılmasından emin olun.
   6. Hücrelerin başarıyla nakledilip nakledilmediğini incelemek için floresan stereomikroskop kullanın (Şekil 4A,B).
   7. Embriyoları 24 kuyulu agarose kaplı bir tabağa aktarın. Aynı donörden hücre alan tüm konak embriyoları aynı kuyuda gruplayın ve buna göre etiketlenin. Onları ertesi güne kadar 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
   8. Gerekirse, donör embriyoları genotipleme için etiketli PCR şeritlerine aktarın.
3. Başarılı germline nakilleri için tarama
   1. Floresan stereomikroskop altında başarılı germline nakilleri için konak embriyoları tarayın yaklaşık 30 h post-fertilizasyon (hpf). Mikrop hücreleri yumurta sarısı uzantısının üzerindeki olukta bulunur (Şekil 4C).
      NOT: Burada sunulan cihaz ve strateji ile yapılan tipik deneyler, donör embriyo başına nakledilen mikrop hücrelerini taşıyan en az bir konak embriyo elde etmek için ~% 60-% 80 başarı oranına sahip olacaktır. Önceki bir raporda ~%10 ^{verimlilik10 açıklanmıştır}.
   2. Varsa, donör embriyolardan yanlış genotip ile hücre alan embriyoları atın. Larvaları, standart hayvancılık koşullarına göre ve kurumsal yönergeleri izleyerek yetişkinliğe başarıyla nakledilen mikrop hücreleri ile yetiştirin.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan üç uygulama için transplantasyon cihazının kullanımındaki başarı ve başarısızlık, stereomikroskop altında görsel muayene ile kolayca değerlendirilebilir. Başarılı transplantasyonlarda, embriyo, blastodermde büyük yırtılmalar olmadan, çevrilmemiş embriyolara şekil ve yumurta sarısı berraklığında normal ve benzer görünmelidir. Embriyo gözle görülür şekilde hasar görürse (Şekil 4B), normal olarak gelişmez. İdeal olarak, floresan işaretleyiciyi ifade eden nakledilen hücreler floresan stereomikroskop altında bakıldığında sürekli bir sütun olarak görünmelidir (Şekil 2A, Şekil 4A). Sütun parçalanmışsa, bu, hücrelerin emme ile transplantasyon iğnesine yamulduğunu veya hücrelerin birikmesinin çok güçlü bir şekilde yapıldığını gösterir. Bu, pistonu daha yavaş ve hafif hareket ettirerek önlenebilir.

Transplantasyon cihazı esas olarak blastula aşamalarında zebra balığı embriyolarında ^{kullanılmıştır5,6}, transplantasyon ve hücre eksizyon çalışmaları japon pirinç balığı medaka (Oryzias latipes) deforionlu blastula evre embriyoları için de çalışır (Şekil 2B). Porazinski, S. R. ve ^ark.17 tarafından tanımlanan embriyo dekonsiyonunun yanı sıra, yukarıda açıklanan prosedürler takip edilebilir.

Spesifik germline transplantasyonu durumunda, iyi bir nakil, yumurta sarısı kenar boşluğunun hemen üzerinde uzun bir yatay hücre sütununa sahip bir embriyo ile sonuçlanacaktır (Şekil 4A). Bununla birlikte, mikrop hücrelerinin başarılı bir şekilde nakledilip nakledilmediği, GFP'nin blastula aşamalarında arka plan ekspresy edilmesi nedeniyle sadece ertesi gün (Şekil 4C-F) değerlendirilebilir (Şekil 1F). İlkel mikrop hücreleri, yumurta sarısı uzantısının hemen üzerindeki olukta küçük floresan küreler olarak görünecektir (Şekil 4C-E). Bu hücrelerin doğru yerde bulunması başarılı germline nakline işaret eder. Farklı bir şekle sahip hücreler mikrop hücresi değildir (örneğin, uzun hücreler tipik olarak kas hücreleridir, Şekil 4F). Ayrıca, oluğun dışında ilkel mikrop hücreleri bulunursa, bu düzgün göç edemedikleri ve embriyonun mikrop çizgisine katkıda bulunamayacakları anlamına gelir. Son olarak, nakledilen embriyoların genel morfolojisi tercüme edilmemiş embriyolara benzer görünmelidir (Şekil 4D); kuyruk deforme olmamalı ve kafa küçülmemeli veya eksik gözler olmamalıdır (Şekil 4E). Bu kusurlar genellikle aşırı yüksek morfotin konsantrasyonlarından veya transplantasyon sırasında embriyo hasarından kaynaklanır. Burada açıklandığı gibi germline transplantasyon deneyleri tipik olarak, deneycinin deneyimine bağlı olarak, donör embriyoların% 60-80'i için başarılı bir şekilde nakledilen mikrop hücrelerine sahip 6 konak embriyodan 1-2'siyle sonuçlanacaktır. Bu nedenle, mutant mikrop hücrelerine sahip yaklaşık 30 birey yetiştirmek için 40-50 homozigöz donör embriyodan hücrelerin 200-300 konak embriyoya nakledililmesi gerekir.

Şekil 1: Transplantasyon cihazının montajı ve kullanımı. (A) Transplantasyon cihazı, luer kilit bağlantısı ile gaz geçirmez bir şırınganın mikropipette tutucu ile bağlanmasıyla monte edilir. Transplantasyon için cam iğne daha sonra mikropipette tutucuya yerleştirilir. (B) Bir mikromanipülatöre monte edilmiş monte transplantasyon cihazının fotoğrafı (lütfen arka plan ve etiketlerin resimden kaldırıldığını unutmayın). (C) Transplantasyon cihazını kullanırken, transplantasyon iğneslerindeki su seviyesinin konik uçta kalmasını sağlamak önemlidir. (D) Cihaz, bir transplantasyon çanağının bireysel kuyularına yerleştirilen teleost embriyolarından hücreleri çekmek ve içine sokmak için stereomikroskop altında kullanılır. (E) Ektopik kaynakların üretilmesi için hücreler donör embriyonun hayvan kutbundan (i-ii) alınır ve konak embriyonun hayvan kutbuna (iii-vi) aktarılır. (F) Germline nakli için, mikrop hücrelerinin bulunduğu donör embriyonun (i-ii) marjından daha fazla sayıda hücre alınır. Hücreler daha sonra konak embriyoların marjına aktarılır (iii-vi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hücre nakli ile klonların üretilmesi. (A) Zebra balığı bağışçısından zebra balığı konak embriyosuna floresan hücrelerin (yeşil) ardışık nakliyle oluşturulan çift klon örneği. Tek ve çift klonlar, salgılanan sinyal moleküllerinin mekansal gradyanları nasıl oluşturduğunu incelemek için kullanılabilir2,4,5,6. (B) Transgenik eGFP ifade eden bir medaka donörden (Wimbledon)^17'den vahşi tip bir medaka konağına hücre nakliyle oluşturulan tek bir klon örneği. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder.

Şekil 3: Hücre ekstürpasyonu ile boyut küçültülmüş embriyolar üretmek. (A) Hücreleri ekstürpasyonla çıkarmadan önce, YSL'nin iki karşı tarafına floresan boyalar enjekte edilerek etiketlenebilir. (B) YSL enjeksiyonundan sonra embriyo örneği. (C) Boyut küçültülmüş embriyolar üretmek için hayvan kutbundaki hücreler ekstirpasyonla ^{çıkarılır5}. (D) Hücre ekstirpasyonundan sonra embriyo örneği. YSL'nin bozulmadan kaldığını unutmayın. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder.

Şekil 4: Germline transplantasyonu. (A) Donör hücrelerin (yeşil) konağın marjinal bölgesine başarılı bir şekilde nakli örneği. (B) Başarısız transplantasyon örneği. Konak embriyonun sarısı ciddi şekilde hasar gördü ve embriyo normal şekilde gelişemeyecek. (C) 30 hpf'de, başarıyla nakledilen mikrop hücreleri sadece yumurta sarısı uzantısının ön bölgesindeki gonadal mezoderminde bulunur. (D) Birkaç GFP etiketli donör mikrop hücresinin konağın gelecekteki gonadını doldurduğu başarılı bir transplantasyon örneği. (E) Başarısız transplantasyon örneği. Mikrop hücreleri gonadal mezoderm'e ulaşmış olmasına rağmen, konak embriyo ciddi şekilde deforme olur ve normal gelişmez. (F) Başarısız transplantasyon örneği. Doğru yere göç edemeyen floresan mikrop hücreleri gonadları yeniden doldurmaz. Ölçek çubukları 100 μm'dir. D-F'deki görüntüler yaklaşık 50x'lik toplam büyütmede çekildi .

Tartışmalar

Bir transplantasyon deneyinin başarısı, deneycinin ince motor becerilerine dayanır. Prosedürleri başarıyla yürütmek için pratik yapmak gerekir. Bununla birlikte, burada sunulan enstrümanın piyasadaki diğerlerine kıyasla öğrenilmeleri ve kullanılması nispeten kolaydır ve genel olarak sadece birkaç günlük uygulamaya ihtiyaç vardır.

Transplantasyon prosedürünün başarısı çeşitli önlemler alınarak arttırılabilir. Bir adım, mikromanipülatörün kaliteli ve sorunsuz çalışma yeteneğine sahip olduğundan emin olmaktır. Stereomikroskopa daha yüksek büyütmeye sahip bir oküler eklemek, iğnenin embriyoya göre hassas bir şekilde yerleştirilmesine yardımcı olabilir. Sağlıklı embriyolar elde etmek için iyi üreyen zebra balığı veya medaka kullanmak ve elleçleme sırasında (özellikle azil adımı sırasında ve sonrasında) embriyolara zarar vermemeye özen etmek de başarı oranını artıracaktır.

Gecikmiş toksisite ile ilgili sorunların giderilmesi daha zor olabilir. Bir embriyo birkaç saat sonra ölürse - ancak transplantasyonu hemen takip etmiyorsa - yumurta sarısı iğneden zarar görmüş olabilir (örneğin, embriyoya çok derinlemesine girerek) veya belki de hücreler çok zorla dışarı atılmış olabilir. Gecikmiş toksisite ve embriyonik ölüm de donör hücrelerle birlikte enjekte edilen yumurta sarısı veya hücre kalıntılarından da sonuçlanabilir; başka bir neden, Ringer'ın çözeltisindeki HEPES tamponu bozulabilir. Bu sorunlar, hücrelerin yıkanmasıyla (bkz. adım 1.3.8) veya sırasıyla yeni bir tampon grubu kullanılarak aşılabilir. Ayrıca, germline transplantasyon deneylerinde deforme olmuş konak embriyolar aşırı yüksek morfinino konsantrasyonlarından kaynaklanabilir. Konağın vahşi tip mikrop hattını tamamen alevlendirmek için yeterli morfotin kullanmak çok önemlidir, böylece bu hücrelerin yavrulara katkıda bulunmalarını önlemek - ancak aynı zamanda aşırı yüksek morfotin konsantrasyonlarından kaçınılması gerekir. Bu nedenle, enjekte edilen tüm konak embriyolarda (tipik bir deneyde birkaç yüz) tutarlı morfosin miktarları germline transplantasyonlarının başarısının anahtarıdır. Bu, morfolino enjeksiyon karışımını, tüm embriyoların aynı enjeksiyon hacmini aldığından emin olmak için floresan stereomikroskop altında izlenebilen kolayca görülebilen bir izleyici ^boyası14 ile destekleyerek yardımcı olabilir.

Bu protokolde açıklanan prosedürler sadece blastula evre zebra balığı veya medaka embriyolarındaki hücrelerin manipülasyonlarını içerir, ancak gelecekte, transplantasyon iğnesinin çapını ve şeklini değiştirerek cihazı farklı aşamalara ve türlere uyarlamak muhtemel olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament			To make the transplantation needle
1.0 mm glass capillary, ends cut with filament			To make injection needles
200 mL glass beaker			For embryo dechorionation
24-well plastic plate			To be coated with agarose in order to incubate embryos
5 cm diameter glass Petri dish			For embryo dechorionation
6-well plastic plate			To be coated with agarose in order to incubate embryos
Agarose			To coat plastic dishes
dnd1 morpholino	Gene Tools		Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT
Embryo medium			250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source			To assess YSL injections and germ-line transplantations
Glass micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-1000	To make the transplantation needle
Glass pasteur pipette	Kimble Chase (via Fisher)	63A53WT	For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge
Incubator at 28 °C			For incubating zebrafish embryos
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series	Hamilton	Ref: 80201	Part of the transplantation device
Manual micromanipulator with 3 axes of movement	Narishige	M-152	For controlling the transplantation device
Manual pipetting pump	Bio-Tek	Cat. # 641	For use with the glass pipettes to transfer embryos
Metal dissecting probe			For moving and rotating zebrafish embryos
Microforge	Narishige	MF2	To make the transplantation needle
Microinjection apparatus			For injection of mRNA and morpholino into embryos
Microinjection molds, triangular grooves	Adaptive Science Tools	TU-1	To prepare microinjection plates with agarose
Microinjection-molds, single wells	Adaptive Science Tools	PT-1	To prepare transplantation plates with agarose
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary	World Precision Instruments	MPH6S10	Part of the transplantation device
mMessage mMachine Sp6 transcription kit	Life Technologies	AM1340M	To generate capped mRNA for injection into embryos
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR			Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1
Plastic petri dish 100 mm			To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes
Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P5147	For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos
Ringer’s solution			For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration
Stereomicroscope			For injection and transplantation