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要約

この記事では、マウス妊娠中の鉄輸送の研究のために、トランスフェリン結合非放射性同位体鉄を調製および投与する方法を示します。胎児胎盤区画中の同位体鉄を定量するためのアプローチも記載されている。

要約

鉄は妊娠中の母体と胎児の健康に不可欠であり、健康な妊娠を維持するために人間には約1gの鉄が必要です。胎児の鉄の供給は胎盤を横切る鉄の移動に完全に依存しており、この移動の摂動は妊娠に悪影響を与える可能性があります。マウスでは、胎盤を横切る鉄フラックスの測定は、伝統的に放射性鉄同位体に依存していましたが、これは非常に敏感ですが負担の大きいアプローチでした。安定鉄同位体(57Feおよび 58Fe)は、ヒトの妊娠研究で使用するための非放射性の代替物を提供します。

生理学的条件下では、トランスフェリン結合鉄は胎盤に取り込まれる鉄の主な形態です。したがって、 58Fe-トランスフェリンを調製し、妊娠中のダムに静脈内注射して、胎盤鉄輸送を直接評価し、交絡変数として母親の腸内鉄吸収をバイパスしました。同位体鉄は、誘導結合血漿質量分析(ICP-MS)によって胎盤およびマウス胚組織において定量された。これらの方法は、生理学または疾患の他の動物モデル系において、 in vivo 鉄動態を定量化するためにも使用することができる。

概要

鉄は、成長と発達、エネルギー生産、酸素輸送など、さまざまな代謝プロセスに不可欠です1。鉄の恒常性の維持は、動的で調整されたプロセスです。鉄は十二指腸で食物から吸収され、鉄輸送タンパク質トランスフェリン(Tf)に結合して循環して体内を輸送されます。これは、酵素プロセスのためにすべての細胞によって利用され、新生赤血球のヘモグロビンに取り込まれ、マクロファージによって老化赤血球からリサイクルされます。鉄は過剰になると肝臓に貯蔵され、出血や細胞脱落によって体から失われます。循環中の鉄の量は、鉄の消費と供給のバランスの結果であり、後者は鉄の恒常性の中心的な調節因子である肝ホルモンヘプシジン(HAMP)によって厳しく調節されています1。ヘプシジンは、ユビキチン化を閉塞または誘導し、鉄輸出者フェロポーチン(FPN)を分解することにより、血中の鉄バイオアベイラビリティを制限する働きをします2。機能性FPNの減少は、食事中の鉄吸収の減少、肝臓での鉄隔離、およびマクロファージからの鉄リサイクルの減少につながります1。

ヘプシジンは、鉄の状態、炎症、赤血球生成ドライブ、および妊娠によって調節されている(3でレビュー)。鉄の恒常性は非常に動的であることを考えると、鉄プールと鉄の分布と回転率の合計を理解して測定することが重要です。動物実験は伝統的に放射性鉄同位体に依存していましたが、これは鉄のダイナミクスを測定するための非常に感度が高くて負担の大きいアプローチです。しかし、ここで紹介した研究4を含む最近の研究では、非放射性の安定な鉄同位体(58Fe)が妊娠中の鉄輸送を測定するために利用されています5,6,7,8,9。安定同位体は、栄養代謝を研究するための貴重なツールです(10でレビュー)。ヒトの研究における安定鉄同位体の使用は、i)妊娠の終わりに向かって鉄吸収が増加する5,6、ii)胎児への食事性鉄の移動は母親の鉄の状態に依存する7、iii)母親が摂取したヘム鉄は非ヘム鉄8よりも胎児に取り込まれやすい、iv)胎児への鉄の移動は母親のヘプシジンレベル8と負の相関があることを示した。9.これらの実験では、血清中の鉄同位体または赤血球への鉄同位体の取り込みを測定しました。ただし、赤血球に取り込まれた鉄の測定だけでは、真の鉄吸収を過小評価する可能性があります9。現在の研究では、ヘム鉄と非ヘム鉄の両方が組織で測定されています。

妊娠中、鉄は母体の赤血球量の拡大をサポートし、胎児の成長と発達をサポートするために胎盤を横切る移動に必要です11。胎児の鉄の供給は、胎盤を横切る鉄の輸送に完全に依存しています。ヒト12およびげっ歯類4,13の妊娠中、ヘプシジンレベルは劇的に減少し、胎児への移送のための血漿鉄の利用可能性を増加させる。

胎盤鉄輸送の基礎は、1950年代から70年代に放射性トレーサー(59Feおよび55Fe)を使用して最初に特徴付けられました。これらの研究により、胎盤を横切る鉄輸送は一方向であり14,15、二鉄トランスフェリンは胎盤と胎児の主要な鉄源であると判断されました16,17。胎盤鉄輸送の現在の理解はより完全ですが、いくつかの重要な鉄輸送体と調節メカニズムは不明のままです。マウスモデルは、主要な輸送体とメカニズムが非常に類似しているため、鉄の調節と輸送を理解するために不可欠でした18。ヒト胎盤とマウス胎盤の両方が血脈性であり、すなわち、母体血は胎児絨毛膜19と直接接触している。ただし、いくつかの顕著な構造上の違いがあります。

合胞体栄養膜は、母体と胎児の循環を分離し、鉄や他の栄養素を積極的に輸送する胎盤細胞層です20。ヒトでは、合胞体栄養膜は融合細胞の単層です。対照的に、マウス胎盤は、2つの合胞体栄養膜層21、Syn-IおよびSyn-IIからなる。しかしながら、Syn−IおよびSyn−IIの界面におけるギャップ結合は、層22、23間の栄養素の拡散を可能にする。したがって、これらの層は、ヒトの合胞体栄養膜と同様の単一の合胞体層として機能する。ヒト胎盤とマウス胎盤のさらなる類似点と相違点は、RossantとCross21によってレビューされています。胎盤鉄輸送は、母体血からシンシチオトロフォブラスト24の頂端側に局在するトランスフェリン受容体(TfR1)への鉄-Tfの結合によって引き起こされる。この相互作用は、クラスリンを介したエンドサイトーシスを介して鉄-Tf/TfR1のインターナリゼーションを誘導します25。その後、鉄は酸性エンドソーム26のTfから放出され、未決定のフェリレダクターゼによって第一鉄に還元され、まだ決定されていないトランスポーターによってエンドソームから細胞質に輸出されます。鉄が合胞体栄養膜内でどのようにシャペロン化されるかもまだ説明されていません。鉄は最終的に、合胞体栄養膜の基底面または胎児に面した表面に局在する鉄輸出者FPNによって胎児側に輸送される(27でレビュー)。

TfR1、FPN、およびヘプシジンの生理学的および病理学的調節が胎盤の鉄輸送にどのように影響するかを理解するために、安定鉄同位体を利用して、母体循環から胎盤および胚への鉄輸送をin vivoで定量しました4。この論文では、妊娠マウスへの同位体鉄トランスフェリンの調製と投与、ICP-MSのための組織の処理、および組織内の鉄濃度の計算方法を紹介します。in vivoでの安定鉄同位体の使用は、生理学的および病理学的鉄調節を調査するために、異なる動物モデルにおける鉄の調節および分布を調べるために適応させることができる。

プロトコル

すべての動物のプロトコルと実験手順は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 58Fe-Tfの調製

注:プロトコルは 58Feを使用します。ただし、 57Feにも同じプロトコルを使用できます。どちらの同位体も、追加の予防措置なしに標準的な鉄化学物質として使用および廃棄できます。

  1. 58 Fe を 50μL の HCl/mg の 12 N HCl に溶解します。
    1. ベンダーから提供されたガラスバイアルの金属にHClを追加し、キャップを緩く交換します。鉄を溶解するには、 58Fe / HCl溶液を60°Cに1時間温めます。それでも溶解しない場合は、溶液をヒュームフード内で室温で一晩放置して溶解します。
      注:溶解した 58Fe / HCl溶液は黄橙色です。
      Fe3O 4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl 3(aq) + 4H2 O
  2. 残ったFe(II)Cl2 を酸化してFe(III)Cl3 溶液を生成します。
    1. 酸化を促進するために、キャップを外した状態で 58Fe/ HCl溶液を60°Cに温めます。
    2. 酸化をさらに促進するために、58 Fe/HCl溶液50μLあたり1 μLの35%H2O2を追加します。
      Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
  3. 塩化第二鉄(58Fe(III)Cl3)溶液を調製します。
    1. キャップを外した状態でフード内の塩化第二鉄溶液を60°Cのままにして、サンプルを蒸発させます。
      注意: 蒸発には1日から数日かかる場合があります。
    2. 58Fe(III)Cl3を超高純度H 2 Oで100 mMに再構成し、ステップ1.1で使用した初期金属量に基づいて必要な超高純度H 2 Oの量を計算します(58Fe(III)Cl3の分子量は162.2です)。
  4. 20 mM NaHCO 3の存在下で58 Fe(III)Cl3とNTAを1:5のモル比でインキュベートすることにより、58Fe(III)-ニトリロ三酢酸(NTA)を調製します。
    1. 1 N NaOH中に500 mM NTAを調製します。
    2. 5xトランスフェリンローディングバッファー(0.5 M HEPES、pH 7.5; 0.75 M NaCl)を調製します。
    3. 超高純度H2O中で1M NaHCO3を調製する。
    4. 15 mLのコニカルチューブに、100 mM 58Fe(III)Cl 3溶液150 μL(ステップ1.3.2から)、1 N NaOHで調製した500 mM NTA150 μL、超高純度H2O480 μL、5xトランスフェリンローディングバッファー200 μL、および1 M NaHCO3溶液20 μLを加えます。
    5. 混合物を室温で5分間インキュベートする。
  5. アポ-Tfに58 Fe(III)-NTAをロードして、58Fe-Tfを形成します。
    注:このプロトコルは、マッカーシーとコスマン28から適応されました。
    1. 500 mgのアポ-Tfを4 mLの1xTfローディングバッファーに溶解します。
    2. 1 mLの 58Fe(III)-NTA溶液を含むステップ1.4.4の15 mLコニカルチューブに、4 mLのapo-Tf溶液を加えます。
      注:これは、アポ-Tfを含む58Fe-NTAの3:1モル比です。各Tfは2つのFe結合部位を含む。Tfが完全にロードされていることを確認するために、過剰な58Fe-NTAが追加されました。
    3. アポ-Tfに 58Fe-NTAを最大負荷できるようにするには、溶液がpH 7.5であることを確認し、必要に応じてNaHCO3 またはHClでpHを調整します。
    4. 室温で2.5時間インキュベートします。
  6. 余分なアンバウンド58Fe(III)-NTAを除去し、NTAを放出した。
    1. 58Fe-Tf溶液を分子量カットオフカラム(30 kDaカットオフ)に移し、室温で15分間、2,500 × gで遠心分離します。
    2. カラムを10 mLの1xトランスフェリンローディングバッファーで洗浄し、室温で15分間2,500 × g で遠心分離します。洗浄と遠心分離を繰り返し、生理食塩水10 mLで生理食塩水洗浄を行い、室温で2,500 × g で15分間遠心分離します。
  7. 58Fe-Tfの濃度を計算します。
    注:ステップ1.5.2で過剰の 58Feが追加されたため、すべてのトランスフェリンが二鉄であると仮定します。500 mgのアポ-Tfを用いたため、ステップ1.5.4で~500 mg の58Fe-Tfが生成した。
    1. ステップ1.6.2で生理食塩水洗浄後の遠心分離から回収された体積を測定する。
    2. 500 mgを回収した容量で割って、 58Fe-Tf溶液の濃度(mg / mL)を決定します。
  8. 0.22 μmシリンジフィルターを使用して 58Fe-Tf溶液を滅菌します。使用する準備ができるまで4°Cで保管してください。
    注: 58Fe-Tf溶液は、調製後1〜4週間の間に使用されました。

2.時限マウス妊娠を設定します

  1. 6〜8週齢の雌マウスを使用してください。交尾する前に、動物を低鉄食(4 ppm鉄)または標準飼料(185 ppm鉄)に2週間置き、妊娠中はそれぞれの食事で動物を維持します。
  2. オプション01:E7.5での体重増加によって妊娠を確認します。
    1. 複数の飼育ケージを設置します。ケージごとに、2人の女性と1人の男性を一晩組み合わせます。動物が分離された翌日は、胚の日(E)0.5と見なされます。妊娠しているかどうかを判断するために、E7.5で女性の体重を量ります。体重が増えなかった女性と男性を再び交尾させます。
      注:WT C57BL / 6では、E7.5で1 gの体重増加が妊娠の良い指標です。この方法は、着床が特定の16時間以内に行われることを保証し、同じ交配期間中に妊娠したすべての動物の同期治療を可能にします。
  3. オプション02:プラグチェックで妊娠を確認します。
    1. 2匹のメスと1匹のオスを組み合わせ、交尾が起こったかどうかを判断するために毎日プラグチェックを実行します。
      注:この方法は時差妊娠をもたらす可能性があり、プラグの存在は妊娠を保証するものではありません。

3. E17.5妊娠マウスに 58Fe-Tfを静脈内投与する

  1. 注入のためにステップ1.8から 58Fe-Tfを準備します。
    1. 生理食塩水中で35 mg / mLで 58Fe-Tf溶液を調製します。マウスあたり100μLを注入します。
    2. インスリン注射器に100 μLの 58Fe-Tf溶液を充填します。
      注:各用量には、3.5 mgのヒト 58Fe-Tf(5 μgの 58Fe)が含まれています。.
  2. イソフルランを使用して妊娠中のマウスを麻酔する。
    1. チャンバー付きのイソフルランレギュレーターを使用してください。
    2. 次の設定を使用します:5%イソフルラン、2 L / mLのO 2、2分。
    3. つま先のつまみに対する反応の欠如を探して、マウスが麻酔をかけられていることを確認します。
    4. 目の潤滑剤を目の表面に塗布し、マウスを加熱パッドの上に置きます。
  3. 58Fe-Tf溶液を後眼窩洞にゆっくりと慎重に注入します。
  4. マウスが麻酔から回復するのを待ちます。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。.
  5. 注射後6時間、イソフルランの過剰摂取によりE17.5妊婦を安楽死させる。
    1. 二次安楽死の一形態としてマウスを放血するために心臓穿刺を行う。
    2. 安定させるために針で足を固定します。
  6. 胎盤と胚の肝臓を集めます。
    1. 滅菌鉗子と解剖ハサミを使用して、妊娠中のマウスから子宮を慎重に取り除きます。子宮の一部に囲まれた羊膜嚢内の単一の胎児と胎盤で構成される胎盤胎児胎盤ユニットを切り取ります。
    2. 胎児と胎盤を乱すことなく、子宮と羊膜嚢を慎重に切ります。
    3. 羊膜嚢をはがし、胎児と胎盤を取り除きます。
    4. へその緒を切る。
    5. 胎児と胎盤をきれいなタスクワイプで拭き取り、余分な羊水を取り除きます。
    6. 胎盤全体の体重を記録します。
    7. 各胎盤をかみそりの刃で半分に切り、各半分を2.0 mLチューブに入れ、液体窒素でスナップフリーズします。
      注:58 Feは特別な取り扱い上の注意や廃棄を必要としないため、胎盤の半分は58Feの測定に使用でき、残りの半分はウェスタンブロッティングとqPCRによるトランスフェリン受容体(TFR1)とフェロポーチン(FPN)発現の定量を含むその他の分析に使用できます。
    8. 胚の肝臓を収集するには、胚を犠牲にします:かみそりの刃を使用して胚を迅速に斬首します。
      注:E17.5では、子宮内のすべての胚は、研究で使用されなくても、個別に安楽死させる必要があります。
    9. 安定化のために胚を固定し、腹部を露出させたままにします。
    10. 解剖ハサミを用いて、へその緒が取り付けられていた箇所を小さく切開し、解剖ハサミの一端を切開部に挿入し、冠状面に向かって約1/4インチ正中面カットを行います。次に、横面カットを行って胎児の肝臓を露出させます。
    11. 鉗子を使用して胎児の肝臓を取り除きます。
    12. 胚肝臓全体の重量を記録します。
    13. 胚肝臓全体を2 mLチューブに入れ、液体窒素で急速凍結します。
      注:あるいは、追加の分析が必要な場合は、胚肝臓の一部のみを 58Fe測定に使用できます。2.0 mLチューブを使用すると、1.5 mLチューブよりも優れた組織均質化が可能になります。
  7. 組織を-80°Cで無期限に保管します。

4. ICP-MSによる定量的鉄分析のためのプロセス組織

  1. 非ヘム鉄の定量のために胎盤と胎児の肝臓を処理します。
    1. 胎盤の半分と胎児の肝臓全体を解凍し、胎盤の半分の重量を量ります(胎児の肝臓の重量を記録するには、ステップ3.6.12を参照してください)。
    2. 400 μLのタンパク質沈殿溶液(0.53 N HCl、5.3% TCA)を加えます。
    3. 電気ホモジナイザーを使用して組織を均質化します。
    4. サンプルを100°Cで1時間インキュベートします。
    5. サンプルを室温の水で2分間冷却します。
    6. キャップを開いて圧力を解放し、チューブを再度閉じます。
    7. 17,000 × g で室温で10分間遠心分離し、組織破片をペレット化します。
    8. 上清を新しいラベル付きチューブに慎重に移します。
    9. ICP-MS分析のためにサンプルを送信します。
  2. ヘム鉄の定量のために胎盤と胎児の肝臓を処理します。
    注:ステップ1で非ヘム鉄を抽出した後、ペレットに残っている鉄は主にヘムです。
    1. ステップ4.1.7から各ペレットの重量を記録します。
    2. ペレットを10 mLの濃縮70%HNO3で消化し、1 mLの30%H 2O 2を添加します。
      注:ICP-MSコアまたはセンターに相談して、特定の研究のためにHNO3 の量を最適化してください。体積は部分的にサンプル重量に依存します。
    3. サンプルを200°Cに15分間加熱します。
    4. ICP-MS分析のためにサンプルを送ります。
      注:ヘム鉄源と非ヘム鉄源を区別する必要がなく、総鉄のみが測定される場合は、最初のステップとしてHNO3 で組織全体を消化できます。

5.データ分析

注:ICP-MSからのデータは、ng / mLまたはmg、ppbで 56Feおよび 58Fe濃度として提供されています(表1)。 56名Feは自然界で最も豊富な鉄同位体であり、その測定値は妊娠全体にわたる胎盤/胚への鉄の蓄積を反映していますが、 58Feの測定は注射後6時間に転移した鉄を反映しています。

  1. 測定された58Fe値から58Feの自然存在量(総Feの0.28%)を引きます。
  2. 総非ヘム 58Feを計算します。
    1. 最初にステップ5.1で計算された鉄濃度(ng / mL)にステップ4.1.2の初期処理中の体積(mL)を掛けて合計 58Feを推定することにより、胚肝臓の総非ヘム鉄(ng)を計算します。
    2. ステップ3.6.6で測定した胎盤の総重量をステップ4.1.1で処理した胎盤の重量で割って、胎盤全体の鉄の量を計算します。この値にステップ5.2.1で計算した総非ヘム鉄(ng)を掛けて、胎盤の総非ヘム 58Fe含有量を求めます。
  3. 総ヘム 58Feを計算します。
    1. 最初にステップ5.1で計算された鉄濃度(ng / mg)にステップ4.2.1で測定されたペレットの重量(mg単位)を掛けることによって、総ヘム 58Feを計算します。
    2. 次に、ステップ3.5.1で測定した胎盤の総重量を、ステップ4.2.1で測定した胎盤ペレットの重量で割ります。この値にステップ5.3.1で計算した総ヘム鉄(ng)を掛けて、胎盤の総ヘム 58Fe含有量を求めます。
  4. 計算した非ヘム値とヘム 58Fe値を合計し、各組織の総鉄含有量を求めた。

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図1:プロトコルの手順の視覚的な要約。 (a)58Fe-トランスフェリンの調製。(b)58Fe-トランスフェリンのインビボ投与。(C)組織の収集と保管。(D)ICP-MSによる金属種の定量のための胎盤および胚肝臓の処理。略語:Fe =鉄;NTA =ニトリロ三酢酸;Tf =トランスフェリン;PPS =タンパク質沈殿溶液;Sup =上清;TCA = トリクロロ酢酸;ICP-MS = 誘導結合プラズマ質量分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

鉄輸送を測定するために安定鉄同位体を使用した以前の研究では、母体の鉄欠乏が胎盤鉄輸出者であるFPN4のダウンレギュレーションをもたらすことが示されました。FPNは唯一の既知の哺乳類鉄輸出物質であり、発生中にFPNが存在しないと、E9.5より前に胚死が発生します29。観察されたFPN発現の減少が胎盤鉄輸送の減少に機能的に翻訳されるかどうかを判断...

ディスカッション

鉄は多くの生物学的プロセスにとって重要であり、体内でのその動きと分布は非常に動的で調節されています。安定鉄同位体は、鉄恒常性のダイナミクスを評価するための放射性同位元素の一貫した便利な代替品を提供します。プロトコルの重要なステップは、すべての組織の重量と体積を追跡することです。鉄は元素であるため、合成も分解もできません。したがって、すべての重量と体?...

開示事項

ENは、Intrinsic LifesciencesとSilarus Pharmaの科学共同創設者であり、Protagonist、Vifor、RallyBio、Ionis、Shield Therapeutics、Disc Medicineのコンサルタントです。VS は競合を宣言しません。

謝辞

著者らは、UCLAのCNSIにあるUCナノテクノロジー環境影響センター内のICP-MS施設が、 58Fe測定のプロトコルの最適化を支援するために使用されていることを認めています。この研究は、NIH国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)(K01DK127004、VSへ)およびNIH国立小児保健人間発達研究所(NICHD)(R01HD096863、EN)の支援を受けた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
58Fe-iron metalTrace Sciences InternationalFe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoffMillipore SigmaUFC903024
Centrifuge tubes, 15 mLFisher Scientific14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mLMillipore SigmaCLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 MicrocentrifugeFisher Scientific75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipersFisher Scientific06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron)Envigo TekladTD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron)PicoLab5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edgeVWR25870-002
Forceps 4-1/2 inch lengthMcKesson157-469
HEPESFisher ScientificBP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200PROScientific01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf)Celliance4452-01no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in waterCole-ParmerEW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100Fisher Scientific14-826-79
IsofluraneVETone502017
Isoflurane vaporizorSummit Anesthesia Solutions
Metal heat blockFisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-capVWR16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retentionFisher Scientific02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retentionFisher Scientific02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilizedMillipore SigmaSLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA)Sigma72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general useFisher Scientific14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0Fisher Scientific13-640-519
Razor blades 0.22 mmVWR55411-050
Scale (g)Mettler ToledoPB1502-S
Scale (mg)Mettler ToledoBalance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS5761-500G
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ScientificSS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL)Fisher Scientific309659
Trichloroacetic acid (TCA)Fisher ScientificA322-500
Software
ImageLabBio-Rad
SigmaPlotSystat

参考文献

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