マウスの腎臓移植のための修正外科的技術

要約

このプロトコルは、修正された動脈吻合戦略に焦点を当てたマウス腎臓移植の新しい外科的技術を提示する。簡便で安全な尿管・膀胱吻合法を含む血管縫合技術も提示される。これらの改変は、手術時間を短縮し、マウス腎臓移植手順の成功率を向上させる。

要約

マウスの腎臓移植は、複雑で困難な手術手順です。この操作の主要な手順を示す出版物はほとんどありません。したがって、この記事では、この技術を紹介し、この操作に関連する外科的警告を指摘します。加えて、従来の手順と比較して重要な修正が実証される。まず、腹部大動脈のパッチを切断し、尿管動脈を含む腎動脈の近位分岐部がドナー腎臓 エンブロック と共にトランステクトされるように調製する。これは、尿管壊死のリスクを軽減し、尿路閉塞の発症を回避します。第二に、血管吻合の新しい方法は、腎移植再灌流が既に開始された後にオペレータが吻合のサイズを柔軟に増減することを可能にすることが実証される。これにより、血管狭窄および腹腔内出血の発症が回避される。第三に、外傷を引き起こさない繊細なドナー尿管およびレシピエント膀胱の吻合を可能にする技術が示されている。このプロトコルを採用することで、手術時間を短縮し、レシピエントの膀胱への損傷を軽減し、レシピエントマウスの手術成功率を大幅に高めることができる。

概要

Sakowitzらが1973年に腎臓移植のマウスモデルを初めて開発して以来¹、移植虚血傷害および同種免疫拒絶反応のメカニズムを研究し、同種移植生存を延長し、おそらく免疫学的耐性を達成することを目的とした新しい治療法を開発するための重要な実験ツールであることが証明されている。しかし、外科的技術は複雑で非常に要求が厳しく、時には腎前非免疫学的腎臓移植不全²につながる血管吻合狭窄、虚血およびその後の移植尿管の壊死によって引き起こされる腎後不全、移植尿管の吻合の狭窄および/または尿流出の破壊につながるレシピエントの尿膀胱などの合併症を有することが証明されている。これらはすべて、マウスにおける腎移植がさらに開発されておらず、したがって広く使用されていない理由である。血管および尿路合併症のない効果的かつ長期的に安定したマウス腎臓移植モデルを確立することは、腎免疫媒介性だけでなく感染症にも焦点を当てた移植分野の多くの研究にとって、依然としてかけがえのない意義を有する³。さらに、肺、心臓、腸移植などのマウスモデルにおける他の臓器移植と比較して^4,5、マウス腎臓移植モデルは、主要な組織適合性抗原格差^3,6の設定においても長期生存を研究する機会を提供する。また、ドナー−レシピエント株の組み合わせの同じ設定において、心臓または腎臓などの異なる臓器移植は、異なる動態および同種移植片拒絶反応の発症によって特徴付けられることも示されている³。さらに、腎臓学的観点からは、単純な皮膚移植実験よりも急性および慢性拒絶反応事象の文脈における実質媒介性免疫調節機構を研究するためのより適切なモデルである。

マウス3,7,8,9における腎臓移植の外科的技術に関する以前の報告に基づいて、我々はここで、我々のグループ^10,11,12内で過去¹⁰年間に首尾よく適用された以下の信頼できる改善を実証する:まず、腎動脈がブロックで切除されるので、尿管動脈は安全に保存されている 腹部大動脈のそれぞれの部分と一緒に。第二に、吻合の最終ステッチが伝統的なアプローチのように上部の結び目の端と結ばれず、自由なままである結び目のない血管吻合の新しい、シンプルで迅速な技術。この技術は、血管狭窄および腹腔内出血を避けるために、腎再灌流後の吻合のサイズを増減することを可能にする。第三に、ドナー尿管をレシピエントの膀胱壁に移植し、レシピエントの膀胱への損傷を軽減し、狭窄のない吻合の形成を容易にするために、21Gおよび30Gのシリンジ針を補助穿刺ガイドツールとして使用した。

この報告では、従来広く用いられている技術と、当研究室で確立されている改変技術とを比較したところ、腎尿細管萎縮や腎臓移植間質組織線維化の程度に有意差は認められませんでした。以前の研究では、局所出血、血栓症、血管吻合を行う時間および生存率の観点から、この新しい技術の結果を従来の方法とさらに比較した。局所血栓症イベントの有意な減少(1.1%対6.6%)、吻合手順の短縮、再現性の高い腎臓同系移植片の長期生存(古典的なアプローチでは95%対84%)などの改善が見出されました¹⁰。

プロトコル

すべての動物実験は、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州議会の指令2010/63/EUのガイドラインに従って実施されました(動物倫理カード:ニーダーザクセン州食品医薬品安全省、#33.9-42502-04-11/0492)。滅菌手術器具および消耗品(オートクレーブ処理)を使用して処置を行い、手術領域をできるだけ無菌に保つようにしてください。

注:C57BL/6J雄マウスはドナーおよびレシピエント(同系移植モデル)として、Balb/cマウスは腎臓同種移植片レシピエント(急性同種移植片拒絶モデル⁹)として役立った。マウスを8〜12週間齢にし、移植時に〜25〜30gの体重を量り、標準的な条件下で飼育した。この原稿で報告されたデータは、マウス手術で経験した4人の外科医によって生成された。

1. 準備手順

1. 手術には、マイクロはさみ、マイクロ鉗子、針ホルダー、マイクロ止血クランプ、電気外科ペンなどの顕微鏡機器のセットを使用してください。7/0er、10/0er、または4/0erナイロンモノフィラメントを使用して縫合を行います。
2. 麻酔のために、無意識を誘発するために約40〜60秒間イソフルラン(2%)を吸入するためにマウスを箱に入れます。
3. マウスを麻酔したら、マウスの重量を量ります。
4. マウスの体重に応じて、ケタミン(100mg / kg)+キシラジン(10mg / kg)+アセプロマジン(2mg / kg)の腹腔内注射を適用してマウス¹³を麻酔する。つま先のピンチに対する反応の欠如を観察して、マウスが麻酔をかけられていることを確認します。
5. 麻酔が効いたら、腹部の毛皮をクリップで留めます。次に、無菌マスキングテープで四肢を緩く固定してマウスを手術台に固定する。
6. マウスを手術台に置いた後、マウスの腹部を消毒する。ヨウ化ポビドン(ヨードフォア)とアルコールの交互のスクラブを使用して消毒を3回行い(同心円状パターンを使用し、腹部の中央でスクラブを開始し、外側に移動する)、次に、フェネストされた手術用タオルを使用してマウスを適切にドレープする。
7. 眼軟膏を塗布し、手順全体を通して無菌性を維持する。
   注:抗生物質は、これらの物質が免疫学的応答に影響を与える可能性があるため、手順全体を通して推奨されません。

2. ドナー操作手順

1. はさみを使用して皮膚を切断し、約3〜4cmの交差腹部切開を行う。腹壁の筋肉を切断する。生理食塩水を吸収したガーゼで内臓を覆い、慎重に遠ざけます。
2. 綿棒を使用して、腸、胃、脾臓を(マウスの観点から)右側に静かに取り除き、生理食塩水を吸収したガーゼで内臓を覆い、慎重に離します。
3. マイクロ鉗子を使用して、左腎臓、大動脈、および下大静脈(IVC)を露出させます。
4. 電気外科用鉛筆を使用して、左腰部静脈(その下層の枝および左副腎血管とともに他の小さな血管を含む)を慎重に焼灼する。
5. マイクロハサミと鉗子を使用して左尿管を解剖し、周囲の組織から慎重に動員します。膀胱の近くできれいにカットしてください。長さ約2mmの左右腎動脈の間の大動脈領域を動員する。
6. マイクロ鉗子を使用して下大静脈(IVC)と大動脈を分離し、湾曲した鉗子を使用して大動脈の下を通過し、この血管の周りに7-0シルク縫合糸の緩いネクタイを配置します。
7. 2つの5mm微小血管クランプを使用して、右腎動脈および下大静脈(IVC)の下の大動脈の領域をクロスクランプする。
8. 大静脈から左腎静脈をトランセクトする。
9. シリンジを使用して、1mLのヘパリン生理食塩水(60U / mL)で大動脈を洗い流す。
10. マイクロ鉗子を使用して、ステップ2.5で適用した合字を締め付けます。次に、結紮の下および近位クランプの下方で大動脈を切断する。これにより、腎動脈の近位分岐部(動脈開口部をきれいに切断しなければならないことに注意してください、さもなければそれは吻合に影響を与えることに注意してください)と尿管動脈が含まれ、 一括してトランスジェクトされます。繊細な尿管動脈が完全に保存されるように、慎重に準備してください。
11. 電気外科用鉛筆と鉗子を使用して、組織を囲むすべての血管を慎重に焼灼することにより、左腎臓および関連する血管を完全に解放します。腎臓を取り出し、4°Cの生理食塩水に保存する。
12. 麻酔をかけられたドナーマウスを断頭により安楽死させる。

3. 受信者操作手順

1. ドナーマウスについて説明したように、最初の外科的ステップ(麻酔および滅菌を含む、ステップ1.1〜1.7を参照)を行う。
2. はさみを使用して中央切開(長さ約2.5cm) を介して 腹部を開き、生理食塩水を使用して腹部器官を湿ったガーゼで覆う。
3. 大動脈下および下大静脈(IVC)を慎重に保存し、すべての大きな血管枝が焼灼されていることを確認してください。電気焼灼も使用して、腎臓骨盤に近い位置で左尿管を慎重に解剖します。その後、左腎臓を取り除きます。
4. マイクロ鉗子と綿棒を使用して腹部大動脈と下大静脈を露出させ、周囲の脂肪組織(長さ約4mm以上)から剥離します。
5. 2つの微小血管クランプを使用し、下大静脈と腹部大動脈の両方に近接および遠位に同時に配置します。
6. マイクロニードルホルダーを使用して、10/0モノフィラメント(滑らかな表面を持つ合成繊維製)縫合針を導き、大動脈壁を通って近位から遠位まで配置します。
7. 縫合糸の緩やかな上向きの牽引力で約1mmの楕円形動脈切除術を達成し、細かい湾曲したはさみで針の下面の真下を切断する。
8. マイクロハサミを使用して、下大静脈(IVC)を約1.5mmの十分な長さで縦方向に切断します。この切開部を大動脈の対応する部分の少し下に置きます。
9. ドナーおよびレシピエント大動脈吻合をエンドツーサイド方式で行う。ドナー腎臓をレシピエントの下大静脈の右側に配置し、ドナーの腹部大動脈の袖口をレシピエントの腹部大動脈の吻合に合わせる。
10. マイクロニードルホルダーと2つの別々の10-0縫合糸を使用して、吻合の近位端と遠位端を縫合します。
11. 結んだ後、針を含む2つの長い縫合糸を所定の位置に置きます。吻合の大動脈壁の左側を、遠位 - 近位方向に等間隔に2本のステッチで連続的に縫い付ける。
12. 最後のステッチの後、縫合糸を上部のステイ縫合糸ネクタイの上の血管壁の部分的な厚さを通して導く。
13. マイクロ鉗子を使用して、下部縫合糸タイの短い端に同時に穏やかな牽引力を発揮します。
    注:この新しい結び目のないテクニックでは、最後のステッチは上のネクタイの短い端に結び付けられていません。
14. マイクロ鉗子を使用して、移植された腎臓を正常な位置にひっくり返します。今度は、大動脈吻合の右壁を近位から遠位まで3本のステッチを用いて連続的に縫い付ける。
    注:従来の外科的技術^7,8と比較して、最後の縫合糸は近くの遠位ネクタイとマージされる。下の縫合糸の端に縛らず、代わりに2〜3mmの自由長を残すように切断してください。
15. 吻合の両側に4〜5本の縫合が必要であるという違いを伴って、前述ののと同じ縫合手順を使用して静脈吻合を行う。最終的なステッチは、上述の大動脈吻合に類似した長さの自由端として残される。
16. 両方の吻合を完了した後、乾燥綿棒を使用して、縫合された領域に向かって約10〜20秒間穏やかな圧力をかける。
17. クリップアプリケーター鉗子を使用して、両方のクランプを取り外します(最初に下側、次に上側)。腹腔を38.0°Cの温度で0.9%塩化ナトリウムですすいでください。
18. 移植された腎臓の再灌流を観察する。

4. 尿管移植

1. マイクロニードルホルダーを使用して、10/0の縫合糸(ストレートニードル)でレシピエントの尿膀胱を貫通し、ガイダンスのために21Gニードルルーメンに挿入します( 補足図1aを参照)。
2. 次に、21 G 針をガイドして、前の針の塗布箇所に穴をあけます (補足図 1b)。
3. 21 G 針を引き出します (補足図 1c)。
4. マイクロニードルホルダーと10/0縫合糸を使用して、トリミングされた尿管端を縫合(ネクタイなし)し、この10/0縫合糸で膀胱をその入り口の場所に再び穿孔します(補足図1d)。
5. マイクロニードルホルダーを使用して、10/0フィラメントと尿管を、構築された穴を通って尿膀胱に牽引します(補足図1e)。
6. マイクロニードルホルダーと別の10/0縫合糸を使用して、ドナーの尿管をレシピエントの尿膀胱に吻合します。ここで、尿管の外膜を膀胱壁の外膜に接続し、3~4本の縫合で間欠縫合を行う。最後に、牽引縫合糸を引き抜く(補足図1f)。
7. 鉗子を使用して腸を腹腔に戻します。4/0フィラメントを使用して腹部創傷を閉じるために2層縫合(最初に腹筋に続いて皮膚)を行う。
8. 移植したマウスを酸素および温度制御されたチャンバーに入れ、手術後に回復させる。
9. 術後鎮痛の場合は、手術後にメタミゾールをosあたり200mg / kgに直接与えてください。
   手術後4時間および16時間後にメタミゾール200mg / kgをosプラスカルプロフェン(5mg / kg)s.c.に与える。さらなる追跡調査では、カルプロフェン(5mg/kg)s.c.を移植マウスに、手術後3日間連続して24時間ごとに投与^する13。不十分な鎮痛の兆候がある場合は、ブプレノルフィン0.05mg / kgを8時間s.c.ごとに追加投与する。

5.対側腎摘出術およびレシピエントマウスの犠牲

注:移植後5日目にレシピエントマウスの対側腎摘出術を行う。

1. 移植後5日目に移植マウスの対側腎摘出術を麻酔下で行う。レシピエントの自家右腎動脈および静脈をリゲートして切断し、右腎臓を除去し、腹腔を閉じる。術後ケアおよび鎮痛は、前述のものと同じである(ステップ4.7参照)。
2. マウスの状態を上げて記録します。移植したマウスの術後鎮痛、食物、および水の供給を提供する。
3. 移植から4週間後、移植したマウスの半分を屠殺し、腎臓移植のためにH&E染色を行う。
4. 移植後12週間、残りのマウスを屠殺し、これらの腎臓移植のマッソンゴールド染色を行った。

結果

移植後4週間後、改変された技術および従来の技術の両方が、天然のレシピエント対側腎臓と比較した場合、腎尿細管萎縮^14,15の中等度の徴候を示した(図1)。腎尿細管萎縮の程度は、2つの異なる技術の間に有意差を示さなかった。移植後12週間の腎臓のマッソン・ゴールドナーのトリクローム染色^14,15<...

ディスカッション

マウスにおける皮膚移植モデルは、同種免疫拒絶反応事象を研究するために単純かつ容易に実施できるが、心臓¹⁶ および腎臓移植¹⁰ 後の同種免疫関連炎症性変化をより具体的に調査するための外科的技術は、複雑かつ非常に要求が厳しいことが証明されている。移植腎臓内科医の視点から見ると、効果的で長期的に安定したマウス腎移植モデルの確立は、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-