Uma técnica cirúrgica modificada para transplante de rim em camundongos

Resumo

Este protocolo apresenta uma nova técnica cirúrgica de transplante de rim de camundongos com foco em uma estratégia de anastomose arterial modificada. Uma técnica de sutura vascular, incluindo um método simples e mais seguro de anastomose ureter-bexiga também é apresentada. Essas modificações reduzem o tempo de operação e melhoram a taxa de sucesso do procedimento de transplante renal do camundongo.

Resumo

O transplante de rim em camundongos é um procedimento cirúrgico complicado e desafiador. Há muito poucas publicações demonstrando os principais passos desta operação. Por isso, este artigo introduz a técnica e aponta as ressalvas cirúrgicas associadas a esta operação. Além disso, modificações importantes em relação ao procedimento convencional são demonstradas. Em primeiro lugar, um pedaço da aorta abdominal é cortado e preparado para que as bifurcações proximais da artéria renal, incluindo a artéria ureteral sejam transectadas juntamente com o rim doador em bloco. Isso reduz o risco de necrose ureter e evita o desenvolvimento de uma oclusão do trato urinário. Em segundo lugar, demonstra-se um novo método de anastomose vascular que permite ao operador aumentar ou diminuir flexívelmente o tamanho da anastomose após a reinfusão do transplante renal. Isso evita o desenvolvimento de restrições de vasos e sangramento intraabdominal. Em terceiro lugar, é mostrada uma técnica que possibilite a anastomose do delicado doador e da bexiga receptora que não causa um trauma. A adoção deste protocolo pode reduzir o tempo de operação e reduzir os danos à bexiga do receptor, aumentando significativamente a taxa de sucesso da operação para os camundongos receptores.

Introdução

Desde que Sakowitz et al. desenvolveram modelos de transplante de rim em 1973 pela primeira vez¹, provou-se como uma importante ferramenta experimental para estudar os mecanismos de lesão isquêmica de transplante e rejeição aoimune, bem como para o desenvolvimento de novos tratamentos destinados a prolongar a sobrevivência do aléxico e possivelmente para alcançar a tolerância imunológica. No entanto, a técnica cirúrgica tem se mostrado complexa e muito exigente, às vezes tendo complicações como restrições anastomóticas vasculares que levam à insuficiência pré-renal não imunológica², falha pós-renal causada por isquemia e necrose subsequente do ureter transplantado, restrições da anastomose do ureter transplantado e/ou bexiga de urina do receptor levando a uma interrupção do fluxo urinário. Todas essas são as razões pelas quais o transplante renal em camundongos não foi desenvolvido e, portanto, não é amplamente utilizado. Estabelecer um modelo eficaz e de longo prazo de transplante de rim de camundongos estáveis sem complicações vasculares e do trato urinário ainda tem significado insubstituível para muitos estudos no campo do transplante com foco nas doenças imunológicas renais mediadas, mas também infecciosas³. Além disso, em comparação com outros transplantes de órgãos em modelos murinos como transplante de pulmão, coração e intestinal ^4,5, o modelo de transplante de rim de camundongos oferece uma chance de estudar a sobrevivência a longo prazo mesmo no cenário de grande disparidade de antígenos de histocompatibilidade ^3,6. Também foi demonstrado que no mesmo cenário de combinações de cepas doador-receptores diferentes transplantes de órgãos, como coração ou rim, são caracterizados por diferentes dinâmicas e inícios de rejeição de alusores³. Além disso, do ponto de vista nefrológico, é um modelo mais adequado para estudar mecanismos de regulação imunológica mediados parênquim no contexto de eventos de rejeição aguda e crônica do que simples experimentos de transplante de pele.

Com base em relatórios anteriores sobre a técnica cirúrgica de transplante de rim em camundongos 3,7,8,9, demonstramos aqui as seguintes melhorias confiáveis que foram aplicadas com sucesso nos últimos 10 anos dentro do nosso grupo 10,11,12: Em primeiro lugar, a artéria ureteral é conservada com segurança à medida que a artéria renal é resseccionada en bloc juntamente com a respectiva parte da aorta abdominal. Em segundo lugar, uma técnica nova, simples e rápida de uma anastomose vascular sem nó em que o ponto final da anastomose não está amarrado com a extremidade da gravata superior como a abordagem tradicional, mas permanece livre. Esta técnica permite aumentar ou diminuir o tamanho da anastomose após a reperfusão renal para evitar a rigidridade do vaso e sangramento intraabdominal. Em terceiro lugar, agulhas de seringa de 21 G e 30 G foram utilizadas como ferramenta auxiliar de orientação de punção para implantar o ureter doador na parede da bexiga do receptor, reduzindo os danos à bexiga do receptor e facilitando a formação de anastomose livre de estritos.

Neste relatório, também comparamos a técnica tradicional e amplamente utilizada com a modificada que está estabelecida em nosso laboratório e não encontrou diferença significativa no grau de atrofia tubular renal e fibrose intersticial de tecido renal. Em estudos anteriores, também comparamos os resultados desta nova técnica com o método convencional em termos de sangramento local, trombose, tempo para a realização da anastomose do vaso e taxa de sobrevivência. Foram encontradas melhorias como reduções significativas de eventos locais de trombose (1,1% versus 6,6%), tempo reduzido para o procedimento de anstomose e sobrevida sintética de enxerto renal altamente reprodutível a longo prazo (95% versus 84% com a abordagem clássica)¹⁰.

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Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes da diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu sobre proteção de animais usados para fins científicos (Cartão de ética animal: Baixo Ministério da Proteção e Segurança de Drogas da Saxônia, nº 33.9-42502-04-11/0492). Realizar procedimentos utilizando instrumentos cirúrgicos e consumíveis estéreis (autoclaved) e tentar manter a área de operação o mais estéril possível.

NOTA: Os camundongos machos C57BL/6J serviram como doadores e receptores (modelo de transplante sintérico), enquanto os camundongos Balb/c serviram como receptores de aoenxerto renal (modelo para estudar o modelo de rejeição de aoenxerto agudo⁹). Os camundongos tinham entre 8 e 12 semanas, pesavam ~25-30 g no transplante e estavam alojados em condições padrão. Os dados relatados neste manuscrito foram gerados por quatro cirurgiões experientes em cirurgia de camundongos.

1. Etapas preparatórias

1. Para cirurgia, use um conjunto de instrumentos microscópicos, incluindo uma micro-tesoura, micro-fórceps, um suporte de agulha, grampos micro hemostáticos e uma caneta eletrocirúrgica. Realize suturas usando monofilamento de nylon 7/0er, 10/0er ou 4/0er.
2. Para anestesia, coloque o rato na caixa para inalação de isoflurane (2%) para cerca de 40-60 s, a fim de induzir a inconsciência.
3. Uma vez que o mouse é anestesiado, pese o mouse.
4. De acordo com o peso do camundongo, aplique uma injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg) para anestesiar o rato¹³. Confirme se o mouse está anestesiado observando a falta de resposta a uma pitada de dedo do dedo do dedo.
5. Quando a anestesia tiver efeito, corte a pele abdominal. Em seguida, fixar o mouse na mesa de operação imobilizando livremente os membros com uma fita de mascaramento estéril.
6. Desinfete o abdômen do rato depois de colocar o rato na mesa de operação. Realize a desinfecção usando um esfoliante alternado de iodeto de povidone (iodophor) e álcool, três vezes (use padrão concêntrico, comece a esfregar no meio do abdômen e se mova para fora), e depois drape corretamente o rato usando uma toalha cirúrgica fenestrada.
7. Aplique pomada ocular e mantenha a esterilidade durante todo o procedimento.
   NOTA: Os antibióticos não são recomendados durante todo o procedimento, pois essas substâncias podem influenciar as respostas imunológicas.

2. Procedimento de operação do doador

1. Use uma tesoura para cortar a pele e realizar uma incisão abdominal cruzada de cerca de 3-4 cm. Corte os músculos da parede abdominal. Cubra e afaste cautelosamente as vísceras com uma gaze salina absorída.
2. Use um cotonete para remover suavemente os intestinos, estômago e baço em direção ao lado direito (do ponto de vista do rato), cubra e afaste cautelosamente as vísceras com uma gaze salina.
3. Use micro fórceps para expor o rim esquerdo, arta e veia cava inferior (IVC).
4. Use um lápis eletrocirúrgico para cauterizar as veias lombares esquerdas, incluindo seus ramos subjacentes e outros pequenos vasos, juntamente com o vaso adrenal esquerdo, cuidadosamente.
5. Use micro tesouras e fórceps para dissecar o ureter esquerdo e mobilizá-lo cautelosamente do tecido circundante. Corte limpo perto da bexiga urinária. Mobilize a região aórtica entre as artérias renais esquerda e direita com aproximadamente 2 mm de comprimento.
6. Use micro fórceps para separar a veia cava inferior infrarenal (IVC) e a aorta, e então use fórceps curvos para passar sob a aorta para colocar uma gravata solta de 7-0 sutura de seda ao redor deste vaso.
7. Fixar cruzadamente a área da aorta abaixo da artéria renal direita e a veia cava inferior (IVC) utilizando dois grampos microvasculares de 5 mm.
8. Transecte a veia renal esquerda da veia cava.
9. Use uma seringa para lavar a aorta com 1 mL de solução salina de heparina (60 U/mL).
10. Use micro fórceps para apertar a ligadura aplicada na etapa 2.5. Em seguida, corte a aorta abaixo da ligadura, bem como abaixo do grampo proximal. Com isso, as bifurcações proximais da artéria renal (por favor, note que a abertura arterial deve ser cortada ordenadamente, caso contrário afetará a anastomose) e a artéria ureteral são incluídas e transectadas em bloco. Prepare-se cuidadosamente, para que a delicada artéria ureteral esteja completamente preservada.
11. Use o lápis eletrocirúrgico e fórceps para libertar o rim esquerdo e os vasos associados completamente cauterizando cautelosamente todo o tecido circundante. Retire o rim e guarde-o em solução salina a 4 °C.
12. Eutanize o rato doador anestesiado por decapitação.

3. Procedimento de operação do destinatário

1. Realize as etapas cirúrgicas iniciais (incluindo anestesia e esterilização, veja as etapas 1.1 a 1.7) conforme descrito para o rato doador.
2. Use uma tesoura para abrir o abdômen através de uma incisão mediana (cerca de 2,5 cm de comprimento) e, em seguida, cubra os órgãos abdominais com uma gaze molhada usando solução salina.
3. Preserve cuidadosamente a aorta infrarenal e a veia cava inferior (IVC) e certifique-se de que todos os grandes ramos do vaso são cauterizados. Use o cautery elétrico também para dissecar o ureter esquerdo cuidadosamente em uma posição proximal à pelve renal. Então, remova o rim esquerdo.
4. Use micro fórceps e brotos de algodão para expor a aorta abdominal e a cava vena inferior e desvinculá-los do tecido adiposo circundante (aproximadamente mais de 4 mm de comprimento).
5. Use dois grampos microvasculares e posicione-os proximicamente e distally tanto na veia cava inferior quanto na aorta abdominal simultaneamente.
6. Use um porta-agulhas micro para guiar uma agulha de sutura de 10/0 (feita de fibra sintética com superfície lisa), que é colocada através da parede da aorta de forma proximal a distal.
7. Obtenha uma arteriotomia elíptica de aproximadamente 1 mm com uma tração suave para cima da sutura, enquanto corta diretamente abaixo da face inferior da agulha com uma tesoura fina e curva.
8. Use micro tesoura para cortar a veia cava inferior (IVC) longitudinalmente com comprimento suficiente de aproximadamente 1,5 mm. Posicione esta incisão ligeiramente abaixo de sua contraparte aórtica.
9. Realize a anastomose aorta do doador e receptor de forma de ponta a ponta. Coloque o rim doador no lado direito da veia cava inferior do receptor alinhando o manguito da aorta abdominal do doador com a anastomose da aorta abdominal do receptor.
10. Use um suporte de micro agulha e duas suturas 10-0 separadas para costurar as extremidades proximal e distal da anastomose.
11. Depois de amarrar, deixe as duas suturas longas, incluindo a agulha, no lugar. Costure o lado esquerdo da parede aortal da anastomose continuamente com dois pontos espaçados uniformemente em uma direção distal-proximal.
12. Após o último ponto, guie a sutura através de uma espessura parcial da parede do vaso acima da gravata sutura superior.
13. Use micro fórceps para exercer simultaneamente tração suave até a extremidade curta da gravata sutura inferior.
    NOTA: Nesta nova técnica sem nó, o último ponto não está amarrado à extremidade curta da gravata superior.
14. Use micro fórceps para entregar o rim transplantado à sua posição normal. Agora, costure continuamente a parede direita da anastomose aortal usando três pontos de forma proximal a distal.
    NOTA: Em comparação com a técnica cirúrgica convencional ^7,8, a última sutura é mesclada com a gravata distal nas proximidades. Não amarre-o ao final da sutura inferior, corte-o para deixar um comprimento livre de 2-3 mm em vez disso.
15. Realize a anastomose venosa utilizando o mesmo procedimento de sutura descrito anteriormente com a diferença de que são necessários quatro a cinco pontos para cada lado da anastomose. O ponto final é deixado como uma extremidade livre de comprimento semelhante à anastomose aortal descrita acima.
16. Depois de completar ambos os anastomoses, use um cotonete seco para exercer pressão suave em direção à área suturada por cerca de 10-20 s.
17. Use um a fórceps aplicador de clipe para remover ambos os grampos, primeiro o inferior e o superior. Enxágüe a cavidade abdominal com cloreto de sódio de 0,9% a uma temperatura de 38,0 °C.
18. Observe a reperfusão do rim transplantado.

4. Implantação ureteral

1. Use um suporte de micro agulha para penetrar através da bexiga de urina do receptor com uma sutura 10/0 (agulha reta) e insira-a em um lúmen de agulha de 21 G para orientação (ver Figura Suplementar 1a).
2. Agora guie a agulha de 21 G para costurar um orifício no local da aplicação anterior da agulha (Figura Suplementar 1b).
3. Retire a agulha de 21 G (Figura Suplementar 1c).
4. Use um suporte de micro agulha e sutura de 10/0 para costurar (sem gravata) a extremidade ureter aparada e perfurar a bexiga com esta sutura 10/0 novamente no local de sua entrada (Figura Suplementar 1d).
5. Use um porta-agulhas micro para rebocar o filamento 10/0 e o ureter na bexiga de urina através do orifício construído (Figura Suplementar 1e).
6. Use um porta-agulhas micro e outra sutura 10/0 para anastomose o ureter do doador na bexiga de urina do receptor. Aqui, conecte a membrana externa do ureter à membrana externa da parede da bexiga, e realize suturas intermitentes com 3 a 4 pontos. Por fim, retire a sutura de tração (Figura Suplementar 1f).
7. Use fórceps para colocar os intestinos de volta na cavidade abdominal. Realizar suturas de duas camadas (primeiro os músculos abdominais seguidos pela pele) para fechar a ferida abdominal usando um filamento 4/0.
8. Coloque os ratos transplantados em uma câmara controlada por oxigênio e temperatura para se recuperar após a cirurgia.
9. Para analgesia pós-operatória, dê diretamente metamizol 200 mg/kg por sistema operacional após a operação.
   Quatro e 16 horas após a operação dão metamizol 200 mg/kg por os mais Carprofen (5mg/kg) s.c. No acompanhamento posterior, aplique Carprofen (5 mg/kg) s.c. nos camundongos transplantados a cada 24 horas por três dias consecutivos após a operação¹³. Se houver qualquer sinal de analgesia insuficiente buprenorfina 0,05 mg/kg é adicionalmente dado a cada 8 h s.c.

5. Nefrectomia contralateral e sacrifício do rato receptor

NOTA: Realize nefrectomia contralateral do camundongo receptor 5 dias após o transplante.

1. Realize a nefrectomia contralateral do camundongo transplantado 5 dias após o transplante sob anestesia. Ligate e corte as artérias e veias renais direitas autólogas do receptor, remova o rim direito e feche a cavidade abdominal. Os cuidados pós-operatórios e a analgesia são os mesmos descritos anteriormente (ver passo 4.7).
2. Levante e regise o estado do rato. Forneça o rato transplantado analgesia pós-operatória, alimentos e abastecimento de água.
3. Quatro semanas após o transplante, sacrifique metade dos camundongos transplantados e realize a coloração de H&E para seus transplantes renais.
4. 12 semanas após o transplante, sacrifique os ratos restantes e realize a coloração de Masson Gold desses transplantes renais.

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Resultados

Quatro semanas após o transplante, tanto a técnica modificada quanto a técnica convencional apresentaram sinais moderados de atrofia tubular renal^14,15 quando comparada aos rins contralaterais receptores nativos (Figura 1). O grau de atrofia dos túbulos renais não demonstrou diferença significativa entre as duas técnicas diferentes. A coloração tricrática de Masson Goldner ^14,15

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Discussão

Embora o modelo de transplante de pele em camundongos seja simples e fácil de realizar para estudar eventos de rejeição aoimune, as técnicas cirúrgicas para investigar mais especificamente as alterações inflamatórias relacionadas ao aoimune após o coração¹⁶ e o transplante de rim¹⁰ tem se mostrado complexo e muito exigente. Do ponto de vista do nefrologista transplantado, o estabelecimento de um modelo de transplante renal de camundongos estável eficaz e de long...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-