Une technique chirurgicale modifiée pour la transplantation rénale chez la souris

Résumé

Ce protocole présente une nouvelle technique chirurgicale de transplantation rénale de souris axée sur une stratégie d’anastomose artérielle modifiée. Une technique de suture vasculaire comprenant une méthode d’anastomose uretère-vessie simple et plus sûre est également présentée. Ces modifications raccourcissent le temps d’opération et améliorent le taux de réussite de la procédure de transplantation rénale de souris.

Résumé

La transplantation rénale chez la souris est une procédure chirurgicale compliquée et difficile. Il existe très peu de publications démontrant les étapes clés de cette opération. Par conséquent, cet article présente la technique et souligne les mises en garde chirurgicales associées à cette opération. En outre, des modifications importantes par rapport à la procédure conventionnelle sont démontrées. Tout d’abord, une plaque de l’aorte abdominale est coupée et préparée de sorte que les bifurcations proximales de l’artère rénale, y compris l’artère urétérale, soient transectées avec le rein du donneur en bloc. Cela réduit le risque de nécrose de l’uretère et évite le développement d’une occlusion des voies urinaires. Deuxièmement, une nouvelle méthode d’anastomose vasculaire est démontrée qui permet à l’opérateur d’augmenter ou de diminuer de manière flexible la taille de l’anastomose après que la reperfusion de transplantation rénale a déjà été initiée. Cela évite le développement de sténoses vasculaires et de saignements intraabdominaux. Troisièmement, une technique qui permet l’anastomose de l’uretère donneur délicat et de la vessie receveuse qui ne provoque pas de traumatisme est montrée. L’adoption de ce protocole peut raccourcir le temps d’opération et réduire les dommages à la vessie du receveur, augmentant ainsi considérablement le taux de réussite de l’opération pour les souris receveuses.

Introduction

Depuis que Sakowitz et al. ont développé des modèles murins de transplantation rénale en 1973 pour la première fois¹, il s’est avéré être un outil expérimental important pour étudier les mécanismes de lésion ischémique de transplantation et de rejet allo-immun ainsi que pour développer de nouveaux traitements visant à prolonger la survie de l’allogreffe et éventuellement à atteindre une tolérance immunologique. Cependant, la technique chirurgicale s’est avérée complexe et très exigeante, présentant parfois des complications telles que des sténoses anastomotiques vasculaires entraînant une insuffisance rénale non immunologique^{prérénale 2}, une insuffisance postrénale causée par une ischémie et une nécrose subséquente de l’uretère transplanté, des sténoses de l’anastomose de l’uretère transplanté et / ou de la vessie urinaire du receveur entraînant une perturbation de l’écoulement urinaire. Toutes ces raisons sont les raisons pour lesquelles la transplantation rénale chez la souris n’a pas été développée et n’est donc pas largement utilisée. L’établissement d’un modèle de transplantation rénale de souris efficace et stable à long terme sans complications vasculaires et urinaires a encore une importance irremplaçable pour de nombreuses études dans le domaine de la transplantation axées sur les maladies rénales à médiation immunitaire mais aussi infectieuses³. En outre, par rapport à d’autres transplantations d’organes dans des modèles murins tels que la transplantation pulmonaire, cardiaque et intestinale ^4,5, le modèle de transplantation rénale de souris offre une chance d’étudier la survie à long terme, même dans le contexte d’une disparité majeure de l’antigène d’histocompatibilité ^3,6. Il a également été démontré que dans le même contexte de combinaisons de souches donneur-receveur, différentes transplantations d’organes telles que le cœur ou le rein sont caractérisées par des dynamiques et des débuts différents de rejet d’allogreffe³. En outre, du point de vue néphrologique, il s’agit d’un modèle plus approprié pour étudier les mécanismes de régulation immunitaire à médiation parenchymateuse dans le contexte d’événements de rejet aigus et chroniques que de simples expériences de greffe de peau.

Sur la base de rapports précédents sur la technique chirurgicale de transplantation rénale chez la souris ^3,7,8,9, nous démontrons ici les améliorations fiables suivantes qui ont été appliquées avec succès au cours des 10 dernières années au sein de notre groupe ^10,11,12: Tout d’abord, l’artère urétérale est conservée en toute sécurité lorsque l’artère rénale est réséquée en bloc avec la partie respective de l’aorte abdominale. Deuxièmement, une nouvelle technique simple et rapide d’anastomose vasculaire sans nœuds dans laquelle le point final de l’anastomose n’est pas lié à l’extrémité de la cravate supérieure comme l’approche traditionnelle, mais reste libre. Cette technique permet d’augmenter ou de diminuer la taille de l’anastomose après une reperfusion rénale pour éviter la sténose des vaisseaux et les saignements intraabdominaux. Troisièmement, des aiguilles de seringue de 21 G et 30 G ont été utilisées comme outil auxiliaire de guidage de ponction afin d’implanter l’uretère du donneur dans la paroi de la vessie du receveur, réduisant ainsi les dommages à la vessie du receveur et facilitant la formation d’anastomose sans sténose.

Dans ce rapport, nous avons également comparé la technique traditionnelle largement utilisée avec la technique modifiée établie dans notre laboratoire et n’avons trouvé aucune différence significative dans le degré d’atrophie tubulaire rénale et de fibrose du tissu interstitiel de transplantation rénale. Dans des études antérieures, nous avons également comparé les résultats de cette nouvelle technique avec la méthode conventionnelle en termes de saignement local, de thrombose, de temps pour effectuer l’anastomose du vaisseau et de taux de survie. Nous avons constaté des améliorations telles que des réductions significatives des événements de thrombose locale (1,1 % contre 6,6 %), une réduction du temps pour la procédure d’anastomose et une survie à long terme du greffon syngénique rénal hautement reproductible (95 % contre 84 % avec l’approche classique)¹⁰.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (Carte d’éthique animale: Ministère de la sécurité des aliments et des médicaments de Basse-Saxe, n ° 33.9-42502-04-11/0492). Effectuez des procédures à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles et de consommables (autoclavés) et essayez de garder la zone opératoire aussi stérile que possible.

REMARQUE : Les souris mâles C57BL/6J ont servi de donneurs et de receveurs (modèle de greffe syngénique) tandis que les souris Balb/c ont servi de receveurs d’allogreffe rénale (modèle d’étude du rejet d’allogreffe aigu modèle⁹). Les souris étaient âgées de 8 à 12 semaines, pesaient environ 25 à 30 g lors de la transplantation et étaient logées dans des conditions standard. Les données rapportées dans ce manuscrit ont été générées par quatre chirurgiens expérimentés dans la chirurgie des souris.

1. Étapes préparatoires

1. Pour la chirurgie, utilisez un ensemble d’instruments microscopiques, y compris un micro-ciseau, une micro-pince, un porte-aiguille, des pinces micro hémostatiques et un stylo électrochirurgical. Effectuez des sutures en utilisant un monofilament de nylon 7/0er, 10/0er ou 4/0er.
2. Pour l’anesthésie, placez la souris dans la boîte pour inhalation d’isoflurane (2%) pendant environ 40 à 60 s afin d’induire une perte de conscience.
3. Une fois la souris anesthésiée, pesez la souris.
4. Selon le poids de la souris, appliquer une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg) + acépromazine (2 mg/kg) pour anesthésier la souris¹³. Confirmez que la souris est anesthésiée en observant un manque de réponse à un pincement d’orteil.
5. Lorsque l’anesthésie a pris effet, coupez la fourrure abdominale. Ensuite, fixez la souris sur la table d’opération en immobilisant lâchement les membres avec un ruban de masquage stérile.
6. Désinfectez l’abdomen de la souris après l’avoir placée sur la table d’opération. Effectuez la désinfection en utilisant un gommage alterné d’iodure de povidone (iodophore) et d’alcool, trois fois (utilisez un motif concentrique, commencez à frotter au milieu de l’abdomen et déplacez-vous vers l’extérieur), puis drapez correctement la souris à l’aide d’une serviette chirurgicale fenestrée.
7. Appliquez une pommade pour les yeux et maintenez la stérilité tout au long de la procédure.
   REMARQUE: Les antibiotiques ne sont pas recommandés tout au long de la procédure car ces substances peuvent influencer les réponses immunologiques.

2. Procédure d’opération du donateur

1. Utilisez des ciseaux pour couper la peau et effectuez une incision abdominale transversale d’environ 3-4 cm. Couper les muscles de la paroi abdominale. Couvrir et éloigner prudemment les viscères avec une gaze saline imbibée.
2. Utilisez un coton-tige pour retirer doucement les intestins, l’estomac et la rate vers le côté droit (du point de vue de la souris), couvrez et éloignez prudemment les viscères avec une gaze saline imbibée.
3. Utilisez des micro-pinces pour exposer le rein gauche, l’aorte et la veine cave inférieure (CIV).
4. Utilisez un crayon électrochirurgical pour cautériser soigneusement les veines lombaires gauches, y compris leurs branches sous-jacentes et autres petits vaisseaux ainsi que le vaisseau surrénalien gauche.
5. Utilisez des micro-ciseaux et des pinces pour disséquer l’uretère gauche et le mobiliser prudemment du tissu environnant. Nettoyez-le près de la vessie. Mobiliser la région aortique entre les artères rénales gauche et droite d’environ 2 mm de longueur.
6. Utilisez des micro-pinces pour séparer la veine cave inférieure infrarénale (IVC) et l’aorte, puis utilisez des pinces incurvées pour passer sous l’aorte pour placer une attache lâche de suture de soie 7-0 autour de ce vaisseau.
7. Serrez transversalement la zone de l’aorte sous l’artère rénale droite et la veine cave inférieure (IVC) à l’aide de deux pinces microvasculaires de 5 mm.
8. Transectez la veine rénale gauche de la veine cave.
9. Utilisez une seringue pour rincer l’aorte avec 1 mL de solution saline d’héparine (60 U/mL).
10. Utilisez des micro-pinces pour resserrer la ligature appliquée à l’étape 2.5. Ensuite, coupez l’aorte sous la ligature ainsi qu’en dessous de la pince proximale. Avec cela, les bifurcations proximales de l’artère rénale (veuillez noter que l’ouverture artérielle doit être coupée proprement, sinon cela affectera l’anastomose) et l’artère urétérale sont incluses et transectées en bloc. Préparez soigneusement, de sorte que l’artère urétérale délicate soit complètement préservée.
11. Utilisez le crayon électrochirurgical et la pince pour libérer complètement le rein gauche et les vaisseaux associés en cautérisant prudemment tous les vaisseaux entourant les tissus. Retirer le rein et le conserver dans une solution saline à 4 °C.
12. Euthanasier la souris donneuse anesthésiée par décapitation.

3. Procédure d’opération du destinataire

1. Effectuer les étapes chirurgicales initiales (y compris l’anesthésie et la stérilisation, voir les étapes 1.1 à 1.7) comme décrit pour la souris donneuse.
2. Utilisez des ciseaux pour ouvrir l’abdomen via une incision médiane (environ 2,5 cm de longueur), puis couvrez les organes abdominaux avec une gaze humide à l’aide d’une solution saline.
3. Conservez soigneusement l’aorte infrarénale et la veine cave inférieure (IVC) et assurez-vous que chaque grande branche du vaisseau est cautérisée. Utilisez également la cautérisation électrique pour disséquer soigneusement l’uretère gauche à une position proximale du bassin rénal. Ensuite, retirez le rein gauche.
4. Utilisez des micro-pinces et des cotons-tiges pour exposer l’aorte abdominale et la veine cave inférieure et détachez-les du tissu adipeux environnant (environ plus de 4 mm de longueur).
5. Utilisez deux pinces microvasculaires et positionnez-les de manière proximale et distale sur la veine cave inférieure et l’aorte abdominale simultanément.
6. Utilisez un porte-micro-aiguille pour guider une aiguille de suture monofilament 10/0 (en fibre synthétique avec une surface lisse), qui est placée à travers la paroi de l’aorte de manière proximale à distale.
7. Obtenez une artériotomie elliptique d’environ 1 mm avec une légère traction vers le haut de la suture, tout en coupant directement sous la face inférieure de l’aiguille avec des ciseaux fins et incurvés.
8. Utilisez des micro-ciseaux pour couper la veine cave inférieure (IVC) longitudinalement avec une longueur suffisante d’environ 1,5 mm. Placez cette incision légèrement en dessous de son homologue aortique.
9. Effectuer l’anastomose de l’aorte du donneur et du receveur de bout en bout. Placer le rein du donneur sur le côté droit de la veine cave inférieure du receveur en alignant la coiffe de l’aorte abdominale du donneur avec l’anastomose de l’aorte abdominale du receveur.
10. Utilisez un porte-micro-aiguille et deux sutures séparées 10-0 pour coudre les extrémités proximale et distale de l’anastomose.
11. Après avoir attaché, laissez les deux longues sutures, y compris l’aiguille, en place. Coudre le côté gauche de la paroi aortale de l’anastomose en continu avec deux points de suture uniformément espacés dans une direction distale-proximale.
12. Après le dernier point, guidez la suture à travers une épaisseur partielle de la paroi du vaisseau au-dessus de l’attache de suture du hauban supérieur.
13. Utilisez des micro-pinces pour exercer simultanément une traction douce jusqu’à l’extrémité courte de la sangle de suture inférieure.
    REMARQUE: Dans cette nouvelle technique sans nœud, le dernier point n’est pas attaché à l’extrémité courte de la cravate supérieure.
14. Utilisez des micro-pinces pour remettre le rein transplanté à sa position normale. Maintenant, cousez continuellement la paroi droite de l’anastomose aortale à l’aide de trois points de suture de manière proximale à distale.
    REMARQUE: Par rapport à la technique chirurgicale conventionnelle ^7,8, la dernière suture est fusionnée avec la liaison distale à proximité. Ne l’attachez pas à l’extrémité de la suture inférieure, coupez-la pour laisser une longueur libre de 2-3 mm à la place.
15. Effectuez l’anastomose veineuse en utilisant la même procédure de suture que celle décrite précédemment, à la différence que quatre à cinq points de suture sont nécessaires pour chaque côté de l’anastomose. Le point final est laissé comme une extrémité libre de longueur similaire à l’anastomose aortale décrite ci-dessus.
16. Après avoir terminé les deux anastomoses, utilisez un écouvillon sec pour exercer une légère pression vers la zone suturée pendant environ 10 à 20 s.
17. Utilisez une pince applicatrice à clip pour retirer les deux pinces, d’abord la partie inférieure puis la pince supérieure. Rincer la cavité abdominale avec du chlorure de sodium à 0,9 % à une température de 38,0 °C.
18. Observez la reperfusion du rein transplanté.

4. Implantation urétérale

1. Utilisez un porte-micro-aiguille pour pénétrer dans la vessie urinaire du receveur avec une suture 10/0 (aiguille droite) et insérez-la dans une lumière d’aiguille de 21 G pour vous guider (voir la figure supplémentaire 1a).
2. Guidez maintenant l’aiguille 21 G pour coudre un trou à l’endroit de l’application précédente de l’aiguille (figure supplémentaire 1b).
3. Retirez l’aiguille de 21 G (figure supplémentaire 1c).
4. Utilisez un porte-micro-aiguille et une suture 10/0 pour coudre (sans attache) l’extrémité de l’uretère coupé et perforer à nouveau la vessie avec cette suture 10/0 à l’endroit de son entrée (Figure supplémentaire 1d).
5. Utilisez un porte-micro-aiguille pour remorquer le filament 10/0 et l’uretère dans la vessie urinaire à travers le trou construit (figure supplémentaire 1e).
6. Utilisez un porte-micro-aiguille et une autre suture 10/0 pour anastomoser l’uretère du donneur à la vessie urinaire du receveur. Ici, connectez la membrane externe de l’uretère à la membrane externe de la paroi de la vessie et effectuez des sutures intermittentes avec 3 à 4 points de suture. Enfin, retirez la suture de traction (figure supplémentaire 1f).
7. Utilisez des pinces pour replacer les intestins dans la cavité abdominale. Effectuez des sutures à deux couches (d’abord les muscles abdominaux suivis de la peau) pour fermer la plaie abdominale à l’aide d’un filament 4/0.
8. Placez les souris transplantées dans une chambre à oxygène et à température contrôlée pour récupérer après la chirurgie.
9. Pour l’analgésie postopératoire, administrer directement metamizol 200 mg/kg par os après l’opération.
   Quatre et 16 h après l’opération, donnez au metamizol 200 mg/kg par os plus carprofène (5 mg/kg) s.c. Dans le suivi ultérieur, appliquer le carprofène (5 mg / kg) s.c. sur les souris transplantées toutes les 24 heures pendant trois jours consécutifs après l’opération¹³. S’il y a des signes d’une analgésie insuffisante, la buprénorphine 0,05 mg / kg est également administrée toutes les 8 heures par an.

5. Néphrectomie controlatérale et sacrifice de la souris receveuse

REMARQUE: Effectuer une néphrectomie controlatérale de la souris receveuse 5 jours après la transplantation.

1. Effectuer la néphrectomie controlatérale de la souris transplantée 5 jours après la transplantation sous anesthésie. Ligaturez et coupez les artères et les veines rénales droites autologues du receveur, retirez le rein droit et fermez la cavité abdominale. Les soins postopératoires et l’analgésie sont les mêmes que ceux décrits précédemment (voir étape 4.7).
2. Levez et enregistrez l’état de la souris. Fournir à la souris transplantée une analgésie postopératoire, de la nourriture et de l’eau.
3. Quatre semaines après la transplantation, sacrifiez la moitié des souris transplantées et effectuez une coloration H & E pour leurs greffes de rein.
4. 12 semaines après la transplantation, sacrifiez les souris restantes et effectuez la coloration Masson Gold de ces greffes de rein.

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Résultats

Quatre semaines après la transplantation, la technique modifiée ainsi que la technique conventionnelle présentaient des signes modérés d’atrophie tubulaire rénale^14,15 par rapport aux reins controlatéraux du receveur natif (figure 1). Le degré d’atrophie des tubules rénaux n’a démontré aucune différence significative entre les deux techniques différentes. La coloration trichrome de Masson Goldner^s...

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Discussion

Alors que le modèle de transplantation cutanée chez la souris est simple et facile à réaliser pour étudier les événements de rejet alloimmun, les techniques chirurgicales pour étudier plus spécifiquement les altérations inflammatoires liées à l’alloimmune après le cœur¹⁶ et la transplantation rénale¹⁰ se sont avérées complexes et très exigeantes. Du point de vue du néphrologue de transplantation, l’établissement d’un modèle de transplantation rén...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-