Модифицированная хирургическая техника для трансплантации почки у мышей

Резюме

Этот протокол представляет собой новую хирургическую технику трансплантации почки мыши, ориентированную на модифицированную стратегию артериального анастомоза. Также представлена методика сосудистого шва, включающая простой и безопасный метод анастомоза мочеточника и мочевого пузыря. Эти модификации сокращают время операции и улучшают вероятность успеха процедуры трансплантации почки мыши.

Аннотация

Трансплантация почки у мышей является сложной и сложной хирургической процедурой. Существует очень мало публикаций, демонстрирующих ключевые этапы этой операции. Поэтому данная статья знакомит с методикой и указывает на хирургические предостережения, связанные с данной операцией. Кроме того, демонстрируются важные изменения по сравнению с обычной процедурой. Во-первых, участок брюшной аорты разрезают и готовят таким образом, чтобы проксимальные бифуркации почечной артерии, включая мочеточниковую артерию, перерезались вместе с донорской почкой в блоке. Это снижает риск некроза мочеточника и позволяет избежать развития окклюзии мочевыводящих путей. Во-вторых, продемонстрирован новый метод сосудистого анастомоза, позволяющий оператору гибко увеличивать или уменьшать размер анастомоза после того, как уже начата реперфузия почечной трансплантации. Это позволяет избежать развития стриктур сосудов и внутрибрюшных кровотечений. В-третьих, показана методика, позволяющая провести анастомоз деликатного донорского мочеточника и мочевого пузыря-реципиента, не вызывающего травмы. Принятие этого протокола может сократить время операции и уменьшить повреждение мочевого пузыря реципиента, тем самым значительно увеличивая вероятность успеха операции для мышей-реципиентов.

Введение

С тех пор, как Саковиц и др. впервые разработали мышиные модели трансплантации почки в 1973 году¹, она зарекомендовала себя как важный экспериментальный инструмент для изучения механизмов трансплантационного ишемического повреждения и аллоиммунного отторжения, а также для разработки новых методов лечения, направленных на продление выживаемости аллотрансплантата и, возможно, достижение иммунологической толерантности. Тем не менее, хирургическая техника оказалась сложной и очень требовательной, иногда имея такие осложнения, как сосудистые анастомотические стриктуры, приводящие к преренальной неиммунологической недостаточности почки², постренальной недостаточности, вызванной ишемией и последующим некрозом трансплантированного мочеточника, стриктуры анастомоза трансплантированного мочеточника и / или мочевого пузыря реципиента, приводящего к нарушению оттока мочи. Все это причины, по которым трансплантация почек у мышей не получила дальнейшего развития и поэтому не получила широкого распространения. Создание эффективной и долгосрочной стабильной модели трансплантации почки мыши без осложнений сосудов и мочевыводящих путей по-прежнему имеет незаменимое значение для многих исследований в области трансплантации с акцентом на почечные иммуноопосредованные, но также инфекционные заболевания³. Кроме того, по сравнению с другими трансплантациями органов в мышиных моделях, таких как трансплантация легких, сердца и кишечника ^4,5, модель трансплантации почки мыши дает шанс для изучения долгосрочной выживаемости даже в условиях большого несоответствия антигенов гистосовместимости ^3,6. Также было показано, что в одних и тех же условиях комбинаций донор-реципиент различные трансплантации органов, таких как сердце или почки, характеризуются различной динамикой и началом отторжения аллотрансплантата³. Кроме того, с нефрологической точки зрения это более подходящая модель для изучения паренхиматозно-опосредованных иммунных регуляторных механизмов в контексте острых и хронических событий отторжения, чем простые эксперименты по пересадке кожи.

Основываясь на предыдущих отчетах о хирургической технике трансплантации почки у мышей 3,7,8,9, мы здесь демонстрируем следующие надежные улучшения, которые были успешно применены в течение последних 10 лет в нашей группе 10,11,12: Во-первых, мочеточниковая артерия безопасно сохраняется, поскольку почечная артерия резецируется в блоке. вместе с соответствующей частью брюшной аорты. Во-вторых, новая, простая и быстрая методика бессучкового сосудистого анастомоза, при которой окончательный стежок анастомоза не завязывается концом верхнего галстука, как традиционный подход, а остается свободным. Данная методика позволяет увеличить или уменьшить размеры анастомоза после реперфузии почек во избежание стриктуры сосудов и внутрибрюшного кровотечения. В-третьих, иглы шприца 21 г и 30 г использовались в качестве вспомогательного инструмента для прокола, чтобы имплантировать донорский мочеточник в стенку мочевого пузыря реципиента, уменьшая повреждение мочевого пузыря реципиента и облегчая образование стриктурного свободного анастомоза.

В этом отчете мы также сравнили традиционную, широко используемую методику с модифицированной, которая установлена в нашей лаборатории, и не обнаружили существенной разницы в степени почечной канальцевой атрофии и интерстициального фиброза ткани трансплантата почки. В предыдущих исследованиях мы дополнительно сравнивали результаты этой новой методики с обычным методом с точки зрения местного кровотечения, тромбоза, времени выполнения анастомоза сосудов и выживаемости. Мы обнаружили такие улучшения, как значительное снижение локальных тромбозных событий (1,1% против 6,6%), сокращение времени для процедуры анастомоза и высоковоспроизводимый сингенный трансплантат почек с долгосрочной выживаемостью (95% против 84% при классическом подходе)¹⁰.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами директивы 2010/63/EU Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях (Карточка этики животных: Министерство безопасности пищевых продуктов и лекарственных средств Нижней Саксонии, #33.9-42502-04-11/0492). Проводите процедуры с использованием стерильных хирургических инструментов и расходных материалов (автоклавных) и старайтесь держать операционную зону как можно более стерильной.

ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы мышей C57BL/6J служили донорами и реципиентами (модель сингенной трансплантации), в то время как мыши Balb/c служили реципиентами аллотрансплантата почек (модель для изучения модели острого отторжения аллотрансплантата⁹). Мыши были в возрасте от 8 до 12 недель, весили ~ 25-30 г при трансплантации и содержались в стандартных условиях. Данные, представленные в этой рукописи, были получены четырьмя хирургами, имеющими опыт работы на мышах.

1. Подготовительные шаги

1. Для хирургии используйте набор микроскопических инструментов, включая микроножниц, микрощипцы, держатель иглы, микрогемостатические зажимы и электрохирургическую ручку. Выполняйте швы с использованием нейлоновой мононити 7/0er, 10/0er или 4/0er.
2. Для анестезии поместите мышь в коробку для вдыхания изофлурана (2%) примерно на 40-60 с, чтобы вызвать потерю сознания.
3. Как только мышь будет обезболена, взвесьте мышь.
4. В зависимости от веса мыши применяют внутрибрюшинную инъекцию кетамина (100 мг/кг) + ксилазина (10 мг/кг) + ацепромазина (2 мг/кг) для анестезии мыши¹³. Убедитесь, что мышь обезболена, наблюдая отсутствие реакции на защемление пальца ноги.
5. Когда анестезия вступит в силу, обрежьте брюшной мех. Затем зафиксируйте мышь на операционном столе, свободно обездвижив конечности стерильной маскировочной лентой.
6. Вылечите брюшную полость мыши после размещения мыши на операционном столе. Выполните дезинфекцию с помощью чередующегося скраба из повидона йодида (йодофора) и спирта, три раза (используйте концентрический рисунок, начните скраб в середине живота и двигайтесь наружу), а затем правильно задрапируйте мышь с помощью фенестрированного хирургического полотенца.
7. Наносите глазную мазь и сохраняйте стерильность на протяжении всей процедуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики не рекомендуются на протяжении всей процедуры, так как эти вещества могут влиять на иммунологические реакции.

2. Процедура работы донора

1. Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу и выполнить поперечный разрез брюшной полости около 3-4 см. Разрезать мышцы брюшной стенки. Накройте крышкой и осторожно отведите внутренние органы солевой впитанной марлей.
2. Используйте ватный тампон, чтобы аккуратно удалить кишечник, желудок и селезенку с правой стороны (с точки зрения мыши), накрыть и осторожно отвести внутренние органы солевой впитанной марлей.
3. Используйте микрощипцы для обнажения левой почки, аорты и нижней полой вены (IVC).
4. Используйте электрохирургический карандаш для тщательного прижигания левых поясничных вен, включая их нижележащие ветви и другие мелкие сосуды вместе с левым сосудом надпочечников.
5. Используйте микроножницы и щипцы, чтобы рассечь левый мочеточник и осторожно мобилизовать его из окружающих тканей. Очистите срежьте его близко к мочевому пузырю. Мобилизовать область аорты между левой и правой почечными артериями длиной около 2 мм.
6. Используйте микрощипцы, чтобы отделить инфраренальную нижнюю полую вену (IVC) и аорту, а затем используйте изогнутые щипцы, чтобы пройти под аорту, чтобы поместить свободный галстук из 7-0 шелкового шва вокруг этого сосуда.
7. Перекрестный зажим области аорты ниже правой почечной артерии и нижней полой вены (IVC) с помощью двух 5 мм микрососудистых зажимов.
8. Трансекция левой почечной вены из полой вены.
9. Используйте шприц для промывки аорты 1 мл солевого раствора гепарина (60 Ед/мл).
10. Используйте микрощипы для подтяжки лигатуры, нанесенной на шаге 2.5. Затем срежьте аорту ниже лигатуры, а также ниже проксимального зажима. При этом проксимальные бифуркации почечной артерии (обратите внимание, что артериальное отверстие необходимо аккуратно перерезать, иначе это повлияет на анастомоз) и мочеточниковой артерии включаются и трансецируются в блок. Готовьтесь тщательно, чтобы нежная мочеточниковая артерия полностью сохранилась.
11. Используйте электрохирургический карандаш и щипцы, чтобы полностью освободить левую почку и связанные с ней сосуды, осторожно прижигая все сосуды, окружающие ткани. Удалить почку и хранить в физиологическом растворе при 4 °C.
12. Усыпить обезболенную донорскую мышь путем обезглавливания.

3. Порядок работы получателя

1. Выполните начальные хирургические этапы (включая анестезию и стерилизацию, см. шаги с 1.1 по 1.7), как описано для мыши-донора.
2. Используйте ножницы, чтобы открыть живот через срединный разрез (около 2,5 см в длину), а затем накройте органы брюшной полости влажной марлей с помощью физиологического раствора.
3. Тщательно сохраняйте инфраренальную аорту и нижнюю полую вену (IVC) и убедитесь, что каждая крупная сосудистая ветвь прижигается. Используйте электрическое прижигание, чтобы тщательно рассечь левый мочеточник в положении, близком к тазу почек. Затем удалить левую почку.
4. Используйте микрощипцы и ватные палочки, чтобы обнажить брюшную аорту и нижнюю полую вену и отделить их от окружающей жировой ткани (примерно более 4 мм в длину).
5. Используйте два микрососудистых зажима и расположите их проксимально и дистально как на нижней полой вене, так и на брюшной аорте одновременно.
6. Используйте держатель микроиглы для направления 10/0 мононити (изготовленной из синтетического волокна с гладкой поверхностью) шовной иглы, которая помещается через стенку аорты проксимальным и дистальным образом.
7. Добейтесь эллиптической артериотомии примерно 1 мм с мягким вытяжением шва вверх, при этом разрезая непосредственно нижнюю часть иглы тонкими, изогнутыми ножницами.
8. Используйте микроножницы, чтобы разрезать нижнюю полую вену (IVC) продольно с достаточной длиной примерно 1,5 мм. Расположите этот разрез немного ниже его аортального аналога.
9. Выполняйте донорский и реципиентный анастомоз аорты сквозным способом. Поместите донорскую почку на правую сторону нижней полой вены реципиента, выравнивая манжету брюшной аорты донора с анастомозом брюшной аорты реципиента.
10. Используйте держатель микроиглы и два отдельных шва 10-0, чтобы сшить проксимальный и дистальный концы анастомоза.
11. После завязывания оставьте два длинных шва, включая иглу, на месте. Пришивают левую сторону стенки аорты к анастомозу непрерывно двумя равномерно расположенными швами в дистально-проксимальном направлении.
12. После последнего шва направьте шов через частичную толщину стенки сосуда над верхним шовным стяжкой.
13. Используйте микрощипцы, чтобы одновременно оказывать мягкое сцепление с коротким концом нижнего шовного галстука.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой новой технике без узлов последний стежок не привязан к короткому концу верхнего галстука.
14. Используйте микрощипцы, чтобы перевернуть пересаженную почку в нормальное положение. Теперь непрерывно пришивают правую стенку аортального анастомоза с помощью трех швов в проксимальном и дистальном порядке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с обычной хирургической техникой ^7,8 последний шов сливается с дистальным галстуком поблизости. Не привязывайте его к концу нижнего шва, обрежьте его, чтобы вместо этого осталась свободная длина 2-3 мм.
15. Выполните венозный анастомоз, используя ту же процедуру наложения швов, что и ранее описанная, с той разницей, что для каждой стороны анастомоза необходимо четыре-пять швов. Конечный стежок оставляется свободным концом аналогичной длины, похожим на аортальный анастомоз, описанный выше.
16. После завершения обоих анастомозов используйте сухой тампон, чтобы оказывать мягкое давление на ушиваемую область в течение примерно 10-20 с.
17. Используйте зажимные аппликаторные щипцы, чтобы снять оба зажима, сначала нижний, затем верхний. Промыть брюшную полость 0,9% хлоридом натрия при температуре 38,0 °C.
18. Наблюдают за реперфузией пересаженной почки.

4. Имплантация мочеточника

1. Используйте держатель микроиглы для проникновения через мочевой пузырь реципиента швом 10/0 (прямая игла) и вставьте его в просвет иглы 21 г для руководства (см. Дополнительный рисунок 1a).
2. Теперь направьте иглу весом 21 г, чтобы сшить отверстие в месте предыдущего применения иглы (дополнительный рисунок 1b).
3. Вытащите иглу весом 21 г (дополнительный рисунок 1c).
4. Используйте держатель микроиглы и шов 10/0, чтобы сшить (без галстука) обрезанный конец мочеточника и снова перфорировать мочевой пузырь этим швом 10/0 в месте его входа (дополнительный рисунок 1d).
5. Используйте держатель микроиглы для буксировки нити 10/0 и мочеточника в мочевой пузырь через построенное отверстие (дополнительный рисунок 1e).
6. Используйте держатель микроиглы и еще один шов 10/0, чтобы анастомозировать мочеточник донора к мочевому пузырю реципиента. Здесь соединяют наружную мембрану мочеточника с наружной мембраной стенки мочевого пузыря, и выполняют прерывистые швы с 3 – 4 швами. Наконец, вытащите тяговый шов (дополнительный рисунок 1f).
7. Используйте щипцы, чтобы поместить кишечник обратно в брюшную полость. Выполните двухслойные швы (сначала мышцы живота, а затем кожу), чтобы закрыть брюшную рану с помощью нити 4/0.
8. Поместите пересаженных мышей в кислородную и температурную камеру для восстановления после операции.
9. Для послеоперационного обезболивания непосредственно вводят Метамизол 200 мг/кг per os после операции.
   Через четыре и 16 ч после операции дают Метамизол 200 мг/кг на ос плюс Карпрофен (5 мг/кг) с.к. При дальнейшем наблюдении применяют карпрофен (5 мг/кг) s.c. к пересаженным мышам каждые 24 часа в течение трех последовательных дней после операции¹³. При наличии признаков недостаточного обезболивания бупренорфин дополнительно назначают 0,05 мг/кг каждые 8 ч. ст.

5. Контралатеральная нефрэктомия и жертвоприношение мыши-реципиента

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните контралатеральную нефрэктомию мыши-реципиента через 5 дней после трансплантации.

1. Выполняют контралатеральную нефрэктомию пересаженной мыши через 5 дней после трансплантации под наркозом. Обрезать и перерезать аутологичные правые почечные артерии и вены реципиента, удалить правую почку и закрыть брюшную полость. Послеоперационный уход и обезболивание такие же, как описано выше (см. шаг 4.7).
2. Поднимите и запишите состояние мыши. Обеспечьте пересаженной мыши послеоперационную анальгезию, питание и водоснабжение.
3. Через четыре недели после трансплантации принесите в жертву половину пересаженных мышей и выполните окрашивание H&E для пересадки почки.
4. Через 12 недель после трансплантации принесите в жертву оставшихся мышей и выполните окрашивание Массоном Голдом этих пересадок почки.

Результаты

Через четыре недели после трансплантации как модифицированный метод, так и обычный метод показали умеренные признаки почечной канальцевой атрофии^14,15 по сравнению с нативным реципиентом контралатеральных почек (рисунок 1). Степень атроф?...

Обсуждение

В то время как модель трансплантации кожи у мышей проста и легка в выполнении для изучения событий аллоиммунного отторжения, хирургические методы более конкретного исследования воспалительных изменений, связанных с аллоиммуном, после сердца¹⁶ и трансплантации почки

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-