一种用于小鼠肾移植的改良手术技术

摘要

该方案提出了一种新的小鼠肾移植手术技术，其重点是改进的动脉吻合术策略。还介绍了一种血管缝合技术，包括一种简单且更安全的输尿管-膀胱吻合术方法。这些修饰缩短了手术时间，提高了小鼠肾移植手术的成功率。

摘要

小鼠肾移植是一种复杂且具有挑战性的手术过程。很少有出版物演示这一行动的关键步骤。因此，本文介绍了该技术并指出了与此操作相关的手术注意事项。此外，还演示了与传统程序相比的重要修改。首先，切除并制备腹主动脉的贴片，以便将包括输尿管动脉在内的肾动脉的近端分叉与供体肾脏整体一起横切 。 这降低了输尿管坏死的风险，并避免了尿路阻塞的发展。其次，展示了一种新的血管吻合术方法，该方法允许操作员在肾移植再灌注已经开始后灵活地增加或减小吻合口的大小。这避免了血管狭窄和腹腔内出血的发展。第三，显示了一种能够吻合脆弱的供体输尿管和受体膀胱的技术，不会引起创伤。采用该方案可以缩短手术时间并减少对受体膀胱的损伤，从而显着提高受体小鼠的手术成功率。

引言

自Sakowitz等人于1973年首次开发肾移植小鼠模型^以来1，它已被证明是研究移植缺血性损伤和同种免疫排斥机制以及开发旨在延长同种异体移植存活并可能实现免疫耐受性的新疗法的重要实验工具。然而，手术技术已被证明是复杂且非常苛刻的，有时具有并发症，例如血管吻合口狭窄导致肾前非免疫性肾移植失败²，肾后衰竭引起的缺血和随后移植输尿管坏死，移植输尿管吻合口狭窄和/或受者的尿囊导致尿流出破坏。所有这些都是小鼠肾移植尚未进一步发展的原因，因此未被广泛使用。建立一种有效且长期稳定的小鼠肾移植模型，不伴血管和尿路并发症，对于移植领域的许多研究仍然具有不可替代的意义，重点是肾免疫介导的，但也包括传染病³。此外，与小鼠模型中的其他器官移植如肺、心和肠移植^4，5相比，小鼠肾移植模型即使在主要组织相容性抗原差异^3，6的情况下也为研究长期生存提供了机会。还表明，在供体 - 受体菌株组合的相同设置中，不同的器官移植（例如心脏或肾脏）具有不同的动力学和同种异体移植物排斥反应的发生³。此外，从肾脏学的角度来看，与简单的皮肤移植实验相比，它是在急性和慢性排斥事件背景下研究实质介导的免疫调节机制的更合适的模型。

根据以前关于小鼠肾移植手术技术的报告^{3，7，8，9}，我们在这里证明了以下可靠的改进，这些改进在过去10年中在我们组内已成功应用^10，11，12:首先，输尿管动脉被安全地保存，因为肾动脉被 整体 切除 与腹主动脉的相应部分一起。其次，一种新的，简单而快速的无结血管吻合术技术，其中吻合术的最终缝合线不像传统方法那样与上领带的末端相连，而是保持自由。该技术能够在肾脏再灌注后增加或减少吻合口的大小，以避免血管狭窄和腹腔内出血。第三，使用21 G和30 G注射器针头作为辅助穿刺引导工具，以便将供体输尿管植入受者的膀胱壁，减少对受者膀胱的损伤并促进无狭窄吻合口的形成。

在这份报告中，我们还将传统的，广泛使用的技术与我们实验室建立的改良技术进行了比较，发现肾小管萎缩和肾移植间质组织纤维化的程度没有显着差异。在以前的研究中，我们还将这种新技术与传统方法在局部出血，血栓形成，进行血管吻合术的时间和存活率方面的结果进行了比较。我们发现改善，例如局部血栓形成事件的显着减少（1.1% vs 6.6%），吻合术时间缩短，以及肾脏同源移植物的长期生存率高度可重复（95% vs 84% 使用传统方法）¹⁰。

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研究方案

所有动物实验均根据欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63 / EU的指南进行（动物伦理卡:下萨克森州食品和药物安全部，#33.9-42502-04-11/0492）。使用无菌手术器械和耗材（高压灭菌）进行手术，并尽量保持手术区域无菌。

注意:C57BL / 6J雄性小鼠作为供体和受体（同源移植模型），而Balb / c小鼠作为肾脏同种异体移植受体（研究急性同种异体移植排斥模型⁹的模型）。小鼠年龄在8-12周之间，移植时体重约为25-30g，并饲养在标准条件下。本手稿中报告的数据是由四位在小鼠手术方面有经验的外科医生生成的。

1. 准备步骤

1. 对于手术，使用一组显微仪器，包括微剪刀，微镊子，针座，微止血钳和电外科笔。使用 7/0er、10/0er 或 4/0er 尼龙单丝进行缝合。
2. 对于麻醉，将小鼠放入盒子中吸入异氟醚（2%）约40-60秒，以诱导意识不清。
3. 一旦鼠标被麻醉，称量鼠标。
4. 根据小鼠的体重，腹腔注射氯胺酮（100mg / kg）+ 甲苯噻嗪（10mg / kg）+醋丙嗪（2mg / kg）以麻醉小鼠¹³。通过观察对脚趾捏合缺乏反应来确认小鼠是否麻醉。
5. 当麻醉效果时，夹住腹部皮毛。然后，用无菌遮蔽胶带松散地固定四肢，将鼠标固定在手术台上。
6. 将鼠标放在手术台上后，对鼠标腹部进行消毒。使用碘化聚维酮（碘伏）和酒精的交替擦洗进行消毒，三次（使用同心图案，开始在腹部中部擦洗并向外移动），然后使用开窗手术巾正确覆盖小鼠。
7. 涂抹眼药膏并在整个过程中保持无菌状态。
   注意:不建议在整个过程中使用抗生素，因为这些物质可能会影响免疫反应。

2. 捐赠者操作程序

1. 使用剪刀切开皮肤并进行约3-4厘米的交叉腹部切口。切开腹壁的肌肉。盖上盖子，小心地用盐水吸入纱布移开内脏。
2. 使用棉签向右侧轻轻去除肠道，胃和脾脏（从小鼠的角度来看），盖上并用盐水吸入纱布小心地移开内脏。
3. 使用微镊子暴露左肾、主动脉和下腔静脉 （IVC）。
4. 使用电外科铅笔仔细烧灼左腰静脉，包括其下部分支和其他小血管以及左侧肾上腺血管。
5. 使用微型剪刀和镊子解剖左输尿管，并谨慎地将其从周围组织中移开。将其靠近膀胱干净地切开。活动左肾动脉和右肾动脉之间的主动脉区域，长度约为2毫米。
6. 使用微镊子分离红外线下腔静脉（IVC）和主动脉，然后使用弯曲的镊子通过主动脉下方，在该血管周围放置7-0丝缝合线的松散领带。
7. 使用两个5mm微血管钳夹交叉钳夹右肾动脉下方的主动脉区域和下腔静脉（IVC）。
8. 从腔静脉切开左肾静脉。
9. 使用注射器用1 mL肝素盐水溶液（60 U / mL）冲洗主动脉。
10. 使用微镊子拧紧在步骤2.5中应用的结扎线。然后，切开结扎下方以及近端钳夹下方的主动脉。这样，肾动脉的近端分叉（请注意，动脉开口必须整齐地切开，否则会影响吻合口）和输尿管动脉被包括在内并 整体横切。精心准备，使脆弱的输尿管动脉完全保存。
11. 使用电外科铅笔和镊子，通过谨慎烧灼所有血管周围组织，完全释放左肾和相关血管。取出肾脏并将其储存在4°C的盐水溶液中。
12. 通过斩首对麻醉的供体小鼠实施安乐死。

3. 收件人操作流程

1. 执行供体小鼠描述的初始手术步骤（包括麻醉和灭菌，参见步骤1.1至1.7）。
2. 使用剪刀 通过 正中切口（长约2.5厘米）打开腹部，然后用盐水溶液用湿纱布覆盖腹部器官。
3. 小心保存红外线主动脉和下腔静脉（IVC），并确保每个大血管分支都经过烧灼。使用电灼术在肾盆近端的位置仔细解剖左输尿管。然后，切除左肾。
4. 使用微镊子和棉签暴露腹主动脉和下腔静脉，并将其与周围的脂肪组织（长度约4毫米以上）分离。
5. 使用两个微血管钳夹，并将它们同时定位在下腔静脉和腹主动脉的近端和远端。
6. 使用微针座引导10/0单丝（由具有光滑表面的合成纤维制成）缝合针，该针以近端到远端的方式穿过主动脉壁放置。
7. 通过对缝合线的轻柔向上牵引，实现约1 mm的椭圆形动脉切开术，同时用细弯曲的剪刀直接在针的下部下方切割。
8. 使用微型剪刀纵向切割下腔静脉（IVC），长度足够约1.5毫米。将此切口定位在略低于其主动脉对应物的位置。
9. 以端到端的方式进行供体和受体主动脉吻合术。将供体肾脏放在受体下腔静脉的右侧，使供体腹主动脉的袖带与受体腹主动脉的吻合口对齐。
10. 使用微型针架和两个单独的10-0缝合线缝合吻合口的近端和远端。
11. 绑扎后，将两条长缝合线（包括针头）留在原位。在远端 - 近端方向上用两条均匀间隔的缝线连续缝合吻合口的主动脉壁的左侧。
12. 最后一次缝合后，引导缝合线穿过上部停留缝合带上方的血管壁的部分厚度。
13. 使用微镊子同时对下缝合带的短端施加轻柔的牵引力。
    注意:在这种新的无结技术中，最后一针不绑在上领带的短端。
14. 使用微镊子将移植的肾脏转到其正常位置。现在，使用三针以近端到远端的方式连续缝制主动脉吻合口的右壁。
    注意:与传统的手术技术^7，8 相比，最后一条缝合线与附近的远端扎带合并。不要将其绑在下缝线的末端，将其切成2-3毫米的自由长度。
15. 使用与前面描述相同的缝合程序进行静脉吻合术，不同之处在于吻合口的每一侧需要四到五针。最后的缝线留作与上述主动脉吻合口相似的长度的自由末端。
16. 完成两次吻合后，使用干拭子对缝合区域施加轻柔的压力约10-20秒。
17. 使用夹子施加器镊子卸下两个夹子，首先是下部，然后是上部。在38.0°C的温度下用0.9%氯化钠冲洗腹腔。
18. 观察移植肾脏的再灌注。

4. 输尿管植入术

1. 使用微型针座用10/0缝合线（直针）穿透接受者的尿囊，并将其插入21G针腔进行指导（参见 补充图1a）。
2. 现在引导21 G针在先前针头应用的位置缝合一个孔（补充图1b）。
3. 拔出21 G针头（补充图1c）。
4. 使用微型针架和10/0缝合线缝合（无扎带）修剪过的输尿管末端，并在其入口处再次用这种10/0缝线穿孔膀胱（补充图1d）。
5. 使用微型针架将10/0丝和输尿管通过构造孔拖入尿囊（补充图1e）。
6. 使用微型针架和另一个10/0缝合线将供体的输尿管与接受者的尿囊吻合。在这里，将输尿管的外膜连接到膀胱壁的外膜，并用3至4针进行间歇缝合。最后，拉出牵引缝合线（补充图1f）。
7. 使用镊子将肠道放回腹腔。进行两层缝合（首先是腹部肌肉，然后是皮肤），使用4/0细丝闭合腹部伤口。
8. 将移植的小鼠放入氧气和温度受控的腔室中，以便在手术后恢复。
9. 术后镇痛，术后直接给予安乃近200mg/kg/o。
   术后4小时和16小时给予安乃近200mg/kg/os加卡洛芬（5mg/kg）s.c。在进一步的随访中，每24小时将卡洛芬（5mg / kg）s.c.应用于移植小鼠，连续三天操作¹³。如果有任何镇痛不足的迹象，丁丙诺啡每8小时额外给予0.05mg / kg。

5.对侧肾切除术和受体小鼠的处死

注意:移植后5天对受体小鼠进行对侧肾切除术。

1. 在麻醉下移植后5天进行移植小鼠的对侧肾切除术。缝合并切除接受者的自体右肾动脉和静脉，切除右肾并关闭腹腔。术后护理和镇痛与之前描述的相同（见步骤4.7）。
2. 抬起并记录鼠标的状态。为移植小鼠提供术后镇痛、食物、供水。
3. 移植后四周，处死一半的移植小鼠，并为它们的肾移植进行H&E染色。
4. 移植后12周，处死剩余的小鼠并对这些肾移植进行Masson Gold染色。

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结果

移植后四周，与天然受体对侧肾脏相比，改良技术和常规技术均显示肾小管萎缩的中度体征^14，15 （图1）。肾小管萎缩的程度显示两种不同技术之间没有显着差异。与正常的非移植肾脏相比，Masson Goldner的三色染色^14，15 的肾脏移植后12周均匀地显示出间质组织纤维化的明显迹象（

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讨论

虽然小鼠的皮肤移植模型对于研究同种免疫排斥事件是简单易行的，但用于更具体地研究心脏¹⁶ 和肾移植¹⁰ 后同种免疫相关炎症改变的手术技术已被证明是复杂且非常苛刻的。从移植肾病学家的角度来看，建立一种有效且长期稳定的小鼠肾移植模型对于许多功能和免疫学研究仍然具有不可替代的意义。此外，与其他器官移植相比，小鼠肾移植模型即使存在一定?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-