마우스의 신장 이식을위한 수정 된 수술 기술

요약

이 프로토콜은 변형 된 동맥 해부학 전략에 초점을 맞춘 마우스 신장 이식의 새로운 수술 기술을 제시합니다. 간단하고 안전한 요관-방광 해부학 방법을 포함하는 혈관 봉합 기술도 제시된다. 이러한 변형은 수술 시간을 단축시키고 마우스 신장 이식 절차의 성공률을 향상시킵니다.

초록

생쥐의 신장 이식은 복잡하고 도전적인 수술 절차입니다. 이 작업의 핵심 단계를 보여주는 간행물은 거의 없습니다. 따라서이 기사에서는 기술을 소개하고이 수술과 관련된 수술주의 사항을 지적합니다. 또한, 종래의 절차와 비교하여 중요한 변형이 입증된다. 첫째, 복부 대동맥의 패치를 절단하고 요관 동맥을 포함한 신장 동맥의 근위 분기가 기증자 신장 en bloc 과 함께 횡단되도록 준비됩니다. 이것은 요관 괴사의 위험을 줄이고 요로 폐색의 발달을 피합니다. 둘째, 혈관 해부학의 새로운 방법이 신장 이식 재관류가 이미 시작된 후 운영자가 해부학의 크기를 유연하게 증가 또는 감소시킬 수 있음을 입증합니다. 이것은 혈관 협착과 복강 내 출혈의 발달을 피합니다. 셋째, 외상을 일으키지 않는 섬세한 공여체 요관과 수용자 방광의 해부학을 가능하게하는 기술이 표시됩니다. 이 프로토콜을 채택하면 수술 시간을 단축하고 수용자의 방광 손상을 줄일 수 있으므로 수용자 마우스의 수술 성공률이 크게 높아질 수 있습니다.

서문

Sakowitz 등은 1973 년에 처음으로 신장 이식의 마우스 모델을 개발^{한 이래로 1} 년 이식 허혈성 손상 및 동종 면역 거부의 메커니즘을 연구하고 동종 이식편 생존을 연장하고 면역 관용을 달성하기위한 새로운 치료법을 개발하는 데 중요한 실험 도구로 입증되었습니다. 그러나 수술 기술은 복잡하고 매우 까다로운 것으로 입증되었으며, 때로는 전신 비 면역 학적 신장 이식 실패로 이어지는 혈관 해부학 적 협착², 허혈로 인한 신부전 및 이식 된 요관의 후속 괴사로 인한 신부전, 이식 된 요관의 해부학 및 / 또는 수혜자의 소변 방광의 협착으로 인해 요로 유출의 중단으로 이어지는 합병증이 있습니다. 이 모든 것이 생쥐의 신장 이식이 더 이상 개발되지 않아 널리 사용되지 않는 이유입니다. 혈관 및 요로 합병증 없이 효과적이고 장기간 안정한 마우스 신장 이식 모델을 확립하는 것은 신장 면역 매개뿐만 아니라 감염성 질환에 초점을 맞춘 이식 분야의 많은 연구에서 여전히 대체할 수 없는 의미를 갖는다³. 또한, 폐, 심장 및 장 이식 ^4,5와 같은 뮤린 모델에서의 다른 장기 이식과 비교하여, 마우스 신장 이식 모델은 주조직 적합성 항원 불균형 ^3,6의 설정에서도 장기 생존을 연구할 기회를 제공한다. 또한, 공여체-수용자 균주 조합의 동일한 설정에서 심장 또는 신장과 같은 상이한 장기 이식은 동종이식편 거부반응의 상이한 역학 및 발병을 특징으로 하는 것으로 나타났다³. 또한, 신장학적 관점에서, 단순한 피부 이식 실험보다 급성 및 만성 거부 사건의 맥락에서 실질 매개 면역 조절 메카니즘을 연구하는 데 더 적합한 모델이다.

생쥐 3,7,8,9에서 신장 이식의 외과 적 기술에 대한 이전 보고서를 바탕으로, 우리는 우리 그룹 10,11,12 내에서 지난 ¹⁰ 년 동안 성공적으로 적용된 다음과 같은 신뢰할 수있는 개선을 보여줍니다 : 첫째^, 신장 동맥이 절제됨에 따라 요관 동맥이 안전하게 보존됩니다. 복부 대동맥의 각 부분과 함께. 둘째, 해부학의 최종 스티치가 전통적인 접근법처럼 상부 넥타이의 끝과 묶이지 않고 자유롭게 유지되는 매듭없는 혈관 해부학의 새롭고 단순하며 신속한 기술입니다. 이 기술은 신장 재관류 후 아나스토모시스의 크기를 늘리거나 줄여 혈관 협착 및 복강 내 출혈을 피할 수 있습니다. 셋째, 21G 및 30G 주사기 바늘을 보조 천자 안내 도구로 사용하여 기증자 요관을 수용자의 방광 벽에 이식하여 수용자의 방광 손상을 줄이고 엄격하지 않은 문합 형성을 촉진했습니다.

이 보고서에서 우리는 또한 전통적이고 널리 사용되는 기술을 우리 실험실에서 확립 된 수정 된 기술과 비교했으며 신장 관상 위축 및 신장 이식 간질 조직 섬유증의 정도에 큰 차이가 없음을 발견했습니다. 이전 연구에서, 우리는이 새로운 기술의 결과를 국소 출혈, 혈전증, 혈관 해부학 수행 시간 및 생존율 측면에서 기존의 방법과 추가로 비교했습니다. 우리는 국소 혈전증 사건의 현저한 감소 (1.1 % 대 6.6 %), 해부학 적 절차를위한 시간 단축, 재현성이 높은 신장 syngeneic 이식편 장기 생존 (고전적 접근법의 경우 95 % 대 84 %)¹⁰과 같은 개선을 발견했습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 의회의 지침 2010/63/EU의 지침에 따라 수행되었습니다 (동물 윤리 카드 : 식품 의약품 안전부의 니어 작센 부, #33.9-42502-04-11/0492). 멸균 수술 도구 및 소모품 (오토클레이브)을 사용하여 절차를 수행하고 수술 영역을 가능한 한 멸균 상태로 유지하십시오.

참고: C57BL/6J 수컷 마우스는 기증자 및 수혜자(syngeneic transplant model)로 사용되었고, Balb/c 마우스는 신장 동종이식편 수용자(급성 동종이식편 거부 모델⁹를 연구하기 위한 모델)로 사용되었다. 마우스는 8-12주 사이에 숙성되었고, 이식시 ∼25-30 g의 무게를 측정하고, 표준 조건 하에서 수용하였다. 이 원고에보고 된 데이터는 생쥐 수술 경험이 풍부한 네 명의 외과 의사에 의해 생성되었습니다.

1. 준비 단계

1. 수술을 위해서는 마이크로 가위, 마이크로 포셉, 바늘 홀더, 미세 지혈 클램프 및 전기 수술 펜을 포함한 현미경 도구 세트를 사용하십시오. 7/0er, 10/0er 또는 4/0er 나일론 모노필라멘트를 사용하여 봉합사를 수행합니다.
2. 마취의 경우, 무의식을 유도하기 위해 약 40-60 초 동안 이소플루란 (2 %)을 흡입하기 위해 마우스를 상자에 넣으십시오.
3. 마우스가 마취되면 마우스의 무게를 측정하십시오.
4. 마우스의 체중에 따라 케타민 (100 mg / kg) + 자일라진 (10 mg / kg) + 아세프로 마진 (2 mg / kg)을 복강 내 주사하여 마우스⁽¹³)를 마취하십시오. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 부족한 것을 관찰하여 마우스가 마취되었는지 확인하십시오.
5. 마취가 효과가 있으면 복부 모피를 자르십시오. 그런 다음 멸균 마스킹 테이프로 팔다리를 느슨하게 고정시켜 수술대에 마우스를 고정시킵니다.
6. 마우스를 수술대에 놓은 후 마우스의 복부를 소독하십시오. 포비돈 요오드화물 (iodophor)과 알코올의 번갈아 가며 소독을 세 번 (동심원 패턴 사용, 복부 중앙에서 스크럽을 시작하고 바깥쪽으로 이동)을 수행 한 다음 fenestated 수술 타월을 사용하여 마우스를 적절하게 드레이프하십시오.
7. 눈 연고를 바르고 절차 전반에 걸쳐 불임을 유지하십시오.
   참고: 항생제는 이러한 물질이 면역학적 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 시술 전반에 걸쳐 권장되지 않습니다.

2. 기증자 운영 절차

1. 가위를 사용하여 피부를 자르고 약 3-4cm의 교차 복부 절개를 수행하십시오. 복벽의 근육을 자르십시오. 뚜껑을 덮고 조심스럽게 식염수 주입 거즈로 내장을 옮깁니다.
2. 면봉을 사용하여 창자, 위 및 비장을 오른쪽으로 부드럽게 제거하고 (마우스의 관점에서 볼 때) 덮고 식염수 흡수 거즈로 장을 조심스럽게 옮깁니다.
3. 마이크로 포셉을 사용하여 왼쪽 신장, 대동맥 및 열등한 정맥 카바 (IVC)를 노출시킵니다.
4. 전기 수술 연필을 사용하여 왼쪽 요추 정맥을 소작하십시오., 그들의 근본적인 가지 및 왼쪽 부신 혈관과 함께 다른 작은 혈관을 포함하여, 조심스럽게 소작하십시오.
5. 마이크로 가위와 포셉을 사용하여 왼쪽 요관을 해부하고 조심스럽게 주변 조직에서 동원하십시오. 깨끗이 비뇨기 방광에 가깝게 잘라. 길이가 약 2mm 인 왼쪽과 오른쪽 신장 동맥 사이의 대동맥 영역을 동원하십시오.
6. 마이크로 포셉을 사용하여 infrarenal inferior vena cava (IVC)와 대동맥을 분리 한 다음 곡선 포셉을 사용하여이 용기 주위에 7-0 실크 봉합사의 느슨한 넥타이를 배치하십시오.
7. 두 개의 5mm 미세혈관 클램프를 사용하여 오른쪽 신장 동맥과 열등한 정맥 카바 (IVC) 아래의 대동맥 영역을 크로스 클램프합니다.
8. 베나 카바에서 왼쪽 신장 정맥을 횡단하십시오.
9. 주사기를 사용하여 대동맥을 헤파린 식염수 1mL(60U/mL)로 세척합니다.
10. 마이크로 포셉을 사용하여 단계 2.5에서 적용된 합자를 조이십시오. 그런 다음 대동맥을 합자 아래뿐만 아니라 근위 클램프 아래로 자릅니다. 이것으로, 신장 동맥의 근위 분기 (동맥 개구부는 깔끔하게 절단되어야하며, 그렇지 않으면 해부학에 영향을 미칠 것입니다)와 요관 동맥이 포함되고 횡단 됩니다. 섬세한 요관 동맥이 완전히 보존되도록 조심스럽게 준비하십시오.
11. 전기 수술 연필과 포셉을 사용하여 모든 혈관 주변 조직을 조심스럽게 소작하여 왼쪽 신장과 관련 혈관을 완전히 풀어줍니다. 신장을 제거하고 4 °C의 식염수에 보관하십시오.
12. 마취된 기증자 마우스를 감금에 의해 안락사시킨다.

3. 수신자 조작 절차

1. 공여체 마우스에 대해 기재된 바와 같이 초기 수술 단계(마취 및 멸균 포함, 단계 1.1 내지 1.7 참조)를 수행한다.
2. 가위를 사용하여 중간 절개 (길이 약 2.5cm)를 통해 복부를 연 다음 식염수를 사용하여 젖은 거즈로 복부 장기를 덮으십시오.
3. 조심스럽게 infrarenal 대동맥과 열등한 정맥 카바 (IVC)를 보존하고 모든 대형 혈관 가지가 소작되었는지 확인하십시오. 전기 소작을 사용하여 신장 골반에 가까운 위치에서 왼쪽 요관을 조심스럽게 해부하십시오. 그런 다음 왼쪽 신장을 제거하십시오.
4. 마이크로 포셉과 면봉을 사용하여 복부 대동맥과 열등한 정맥 카바를 노출시키고 주변 지방 조직 (길이 약 4mm 이상)에서 분리하십시오.
5. 두 개의 미세 혈관 클램프를 사용하여 열등한 정맥 카바와 복부 대동맥에 동시에 근접 및 원위 방향으로 배치하십시오.
6. 마이크로 니들 홀더를 사용하여 10/0 모노필라멘트(매끄러운 표면을 가진 합성 섬유로 제조됨) 봉합사 바늘을 안내하고, 이는 대동맥 벽을 통해 근위-원위 방식으로 배치된다.
7. 봉합사의 부드러운 상향 견인력으로 약 1mm의 타원형 동맥 절제술을 달성하고 미세하고 구부러진 가위로 바늘의 아래쪽 얼굴 바로 아래를 절단하십시오.
8. 마이크로 가위를 사용하여 약 1.5mm의 충분한 길이로 열등한 베나 카바 (IVC)를 세로로 자릅니다. 이 절개를 대동맥 아래 약간 아래에 놓습니다.
9. 기증자 및 수혜자 대동맥 해부학을 종단 간 방식으로 수행하십시오. 기증자 신장을 수혜자의 열등한 정맥 카바 오른쪽에 놓고 기증자의 복부 대동맥의 커프를 수혜자의 복부 대동맥의 해부학과 일치시킵니다.
10. 마이크로 바늘 홀더와 두 개의 분리 된 10-0 봉합사를 사용하여 아나스토마증의 근위 및 원위 끝을 스티치하십시오.
11. 묶은 후 바늘을 포함한 두 개의 긴 봉합사를 제자리에 두십시오. 해부학의 대동맥 벽의 왼쪽을 원위 - 근위 방향으로 두 개의 고르게 이격 된 바늘로 지속적으로 바느질하십시오.
12. 마지막 스티치 후, 상부 스테이 봉합사 타이 위의 용기 벽의 부분 두께를 통해 봉합사를 안내하십시오.
13. 마이크로 포셉을 사용하여 하부 봉합사 타이의 짧은 끝까지 부드러운 견인력을 동시에 발휘하십시오.
    참고 :이 새로운 매듭없는 기술에서 마지막 스티치는 상단 타이의 짧은 끝에 묶여 있지 않습니다.
14. 마이크로 포셉을 사용하여 이식 된 신장을 정상 위치로 뒤집으십시오. 이제 대동맥 해부학의 오른쪽 벽을 근위부터 원위 방향으로 세 개의 바늘을 사용하여 지속적으로 바느질하십시오.
    참고 : 기존의 수술 기술 ^7,8과 비교하여 마지막 봉합사는 근처의 원위 넥타이와 병합됩니다. 하부 봉합사의 끝에 묶지 말고 대신 2-3mm의 자유 길이를 남기도록 자릅니다.
15. 앞에서 설명한 것과 동일한 봉합 절차를 사용하여 정맥 해부학을 수행하고 아나스토마증의 각 측면에 네 개에서 다섯 개의 바늘이 필요하다는 차이점이 있습니다. 최종 스티치는 위에서 설명한 대동맥 해부학과 유사한 유사한 길이의 자유 단부로 남습니다.
16. 두 해부학을 모두 완료 한 후 마른 면봉을 사용하여 봉합 된 부위쪽으로 약 10-20 초 동안 부드러운 압력을 가하십시오.
17. 클립 어플리케이터 포셉을 사용하여 두 클램프를 모두 제거하고, 먼저 아래쪽과 위쪽을 제거합니다. 복강을 38.0°C의 온도에서 0.9% 염화나트륨으로 헹구십시오.
18. 이식 된 신장의 재관류를 관찰하십시오.

4. 요관 이식

1. 마이크로 바늘 홀더를 사용하여 10/0 봉합사 (직선 바늘)로 수용자의 소변 방광을 관통하고 지침을 위해 21G 바늘 루멘에 삽입하십시오 ( 보충 그림 1a 참조).
2. 이제 21G 바늘을 안내하여 이전 바늘 적용 장소에 구멍을 뚫습니다 (보충 그림 1b).
3. 21G 바늘을 꺼냅니다(보충 그림 1c).
4. 마이크로 바늘 홀더와 10/0 봉합사를 사용하여 트리밍된 요관 끝을 스티치(넥타이 없음)하고 입구 위치에서 이 10/0 봉합사로 방광을 다시 천공합니다(보충 그림 1d).
5. 마이크로 바늘 홀더를 사용하여 10/0 필라멘트와 요관을 구성된 구멍을 통해 소변 방광으로 견인하십시오 (보충 그림 1e).
6. 마이크로 바늘 홀더와 다른 10/0 봉합사를 사용하여 기증자의 요관을 수혜자의 소변 방광으로 해부학적으로 분석하십시오. 여기서 요관의 외막을 방광 벽의 외막에 연결하고 3 ~ 4 개의 바늘로 간헐적 봉합사를 수행하십시오. 마지막으로 견인 봉합사를 꺼냅니다 (보충 그림 1f).
7. 포셉을 사용하여 내장을 복강에 다시 넣으십시오. 4/0 필라멘트를 사용하여 복부 상처를 닫기 위해 2 층 봉합사 (먼저 복부 근육 다음에 피부)를 수행하십시오.
8. 이식된 마우스를 수술 후 회복을 위해 산소 및 온도 조절된 챔버에 넣는다.
9. 수술 후 진통제의 경우, 수술 후 Metamizol에게 os 당 200 mg / kg을 직접 투여하십시오.
   수술 후 4 시간 및 16 시간은 Metamizol에게 os 당 200 mg / kg과 Carprofen (5mg / kg) s.c를 제공합니다. 추가 후속 조치에서 Carprofen (5 mg / kg) s.c.를 수술 후 3 일 연속 24 시간마다 이식 된 마우스에 바르십시오¹³. 불충분 한 진통의 징후가있는 경우 buprenorphine 0.05 mg / kg은 8 h s.c마다 추가로 제공됩니다.

5. 수용자 마우스의 대측성 신장절제술 및 희생

참고: 이식 후 5일 후에 수용자 마우스의 대측성 신장절제술을 시행하십시오.

1. 이식 후 이식 5일 후에 이식된 마우스의 대측성 신장절제술을 마취하에 수행한다. 수용자의 자가 우측 신장 동맥과 정맥을 Ligate하고 자르고, 오른쪽 신장을 제거하고 복강을 닫습니다. 수술 후 치료 및 진통제는 이전에 기술된 바와 동일하다(단계 4.7 참조).
2. 마우스의 상태를 올리고 기록합니다. 이식 된 마우스에게 수술 후 진통제, 음식 및 물 공급을 제공하십시오.
3. 이식 후 사주 후, 이식된 마우스의 절반을 희생시키고 신장 이식을 위해 H&E 염색을 수행합니다.
4. 이식 12주 후, 남아있는 마우스를 희생시키고 이들 신장 이식의 Masson Gold 염색을 수행한다.

결과

이식 4주 후, 변형된 기술 뿐만 아니라 종래의 기술 둘 다 천연 수용자 대측성 신장과 비교했을 때 신장 세뇨관 위축의 중간 징후 ^14,15를 나타내었다(도 1). 신장 세뇨관 위축의 정도는 두 가지 다른 기술 사이에 유의미한 차이가 없음을 보여주었습니다. 매슨 골드너의 삼색 염색 12주 후 신장의^14,15

토론

마우스에서의 피부 이식 모델은 동종이면역 거부 사건을 연구하기 위해 간단하고 수행하기 쉬운 반면, 심장(¹⁶ ) 및 신장 이식(¹⁰ ) 후 동종암 관련 염증 변화를 보다 구체적으로 조사하기 위한 수술 기술은 복잡하고 매우 요구되는 것으로 입증되었다. 이식 신장 전문의의 관점에서 볼 때, 효과적이고 장기간 안정적인 마우스 신장 이식 모델의 확립은 많은 기능적...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-