新生児マウスにおける左心室構造、機能、冠動脈流の心エコー特性評価

要約

本プロトコルは、7日齢の新生児マウスにおける左心室の形態、機能、および冠状動脈血流の心エコー検査評価について説明しています。

要約

心エコー検査は、心血管疾患の動物モデルにおける構造的および機能的パラメータの評価を可能にする非侵襲的手順であり、前臨床試験における潜在的な治療の影響を評価するために使用されます。心エコー検査は通常、若年成人マウス(すなわち、4〜6週齢)で行われる。初期の新生児心血管機能の評価は、マウスの子犬のサイズが小さいこととそれに関連する技術的困難のために、通常は行われません。最も重要な課題の1つは、子犬の手足の長さが短いため、心エコー検査プラットフォームの電極に到達できないことです。子犬は体温の変化に非常に敏感であるため、体温はもう一つの課題です。したがって、研究者が早期の病理学的変化を検出し、時間の経過とともに心血管疾患の進行を研究するのに役立つ、小型マウスの子犬で心エコー検査を行うための実用的なガイドを確立することが重要です。現在の研究では、生後7日の若さでマウスの子犬に心エコー検査を行うためのプロトコルについて説明しています。新生児マウスにおける心臓の形態、機能、および冠状動脈の流れの心エコー検査の特徴についても説明します。

概要

このプロトコルの全体的な目標は、心臓の形態、機能、および冠状動脈の流れを調べることです 心エコー検査を使用して、生後7日齢の新生児マウスの子犬。この技術の開発の背後にある理論的根拠は、心臓病のマウスモデルにおける冠動脈の流れと心機能の早期変化を決定することです¹。心エコー検査の非侵襲的性質は、研究者が生理学的条件下で心血管機能を評価することを可能にし、心血管疾患を治療するための標的療法の研究のためのスクリーニングツールを研究者に提供するため、有利です^2,3。伝統的に、心エコー検査は若年成人マウス(4〜6週間)を用いて行われる。しかし、いくつかのマウスモデル(すなわち、遺伝子改変モデル)は、この年齢ですでに病理学的変化および心機能障害を示す。したがって、動物モデルを用いた心臓研究は、主に心機能障害を改善または治療する治療薬に焦点を当ててきました。対照的に、最近では、研究努力は心臓病の予防措置と早期介入に焦点を当てるようにリダイレクトされています⁴。

以前の研究では、新生児マウスの心筋梗塞のモデルで心機能を測定するための心エコー検査の使用が説明されています^5,6;しかし、これらの研究は冠状動脈の流れを測定することができず、最も重要なことに、おそらく電極パッドに到達できなかった子犬の手足のサイズが小さいために、手術中に心電図(ECG)と心拍数(HR)データを記録できませんでした。このプロトコルでは、手足にアルミホイルを取り付けて電極パッドに到達し、ECG回路を作成できるようにすることで、この問題を克服します。さらに、このプロトコルは、新生児マウスにおける冠状動脈の流れを記述し、特徴付ける。

本研究では、構造的および機能的パラメータを測定するために、胸骨傍長軸および短軸図でBモードおよびMモード画像を取得しました^2,3。形態学的パラメータには、左心房寸法、左心室(LV)寸法、LV壁厚、LV質量、および相対壁厚(RWT)が含まれていました。機能パラメータには、駆出率(EF)、分数短縮(FS)、心拍出量(CO)、および円周線維短縮速度(Vcf)が含まれていました。脈波(PW)ドップラーを使用して、胸骨傍短軸(PSAX)ビューで大動脈流を測定し、頂端4室ビューで僧帽弁血流を測定しました。頂端4室図は、僧帽弁輪の中隔部分で組織ドップラーを実行するためにも使用されました。左前下行(LAD)冠動脈の冠動脈流も、修正胸骨傍長軸(PLAX)ビューを使用して調べました。冠動脈流量予備力(CFR)は、イソフルラン濃度の増加によって誘発されたストレスチャレンジの後に計算されました。

本プロトコルは、心エコー検査が新生児マウスの非常に早い年齢で実施できることを示しており、したがって、心臓病の早期認識とLV血行動態の縦断的フォローアップ研究を可能にします 異なるマウスモデルにおけるパラメータ。この技術は、出生後早期の心機能における遺伝的変化または薬理学的介入の役割を研究するために使用することができる。さらに、このプロトコルは、人生の早い段階で心臓病の発症を決定するための貴重なツールを提供し、研究者がさまざまなマウスモデルで心臓病の初期段階の根底にある分子メカニズムを解き明かすことを可能にします。

プロトコル

すべての実験は、イリノイ大学シカゴ校の動物管理および使用委員会によって承認されました。実験には、7日齢のFVB/Nマウスを用いた。プロトコルは、マウスの準備、心エコー検査の画像取得、および画像診断後の動物の世話に分けられます。

1.マウスの準備

1. 飼育ケージから7日齢のマウスを入手します。
   注: この幼い頃、身体検査によって動物の性別を判断することは困難です。
2. ECGゲル( 材料の表を参照)を温めたプラットフォーム電極パッドに置きます。電極パッドの上にアルミホイルストリップ(~1.5インチx 0.25インチ)を配置して電極範囲を広げ、テープで固定します(図1A)。続いて、ECGゲルをアルミホイルストリップの上に置きます。
   注意: 手順中にアルミホイルストリップの下のゲルが乾かないようにしてください。その場合は、導電性を維持するためにゲルを追加します。
3. ニトリル手袋から指を切り取り、片側のイソフルラン/酸素ノーズコーンと反対側のマウスノーズの両方を覆うように取り付けます(図1B)。
4. マウスの子犬をイソフルラン誘導チャンバーに入れ、100%酸素で駆動される2.5%濃度でイソフルランの送達を開始します(図1C)。
5. 麻酔をかけた子犬をイメージングプラットフォームの仰臥位に置き、前足をアルミホイルパッドの上に置き、テープで固定します。電気回路が完全であり、ECGが記録されていることを確認してください。
6. イソフルラン送達を100%酸素駆動の1.5%に減らします。.子犬の鼻の周りの手袋から切り取った指をテープで固定します。子犬の足をつまんで麻酔の深さを確認します。
7. 子犬の上半身の上に予熱した超音波ジェルの厚い層を置きます。2本のガーゼロールを使用して、超音波ゲルを所定の位置に保ちます(図1D)。
8. 加熱ランプを使用して、子犬の正常な体温を維持します(図1E)。
   注:直腸プローブは、子犬のサイズが小さいため、現在の研究では体温を監視するために使用されませんでした。

2. 心エコー画像の取得と解析

1. 成体マウスの心エコー検査プロトコル⁷、⁸、⁹に従って、Bモードの場合は40 MHz^、ドップラーの場合は32 MHzのリニアアレイトランスデューサーを備えた心エコー検査機器を使用して経胸壁心エコー検査を実行します(資料表を参照)。
2. 心エコー画像の取得中にエコートランスデューサーを配置するときは、子犬の胸腔に過度の圧力をかけないでください。
   注意: 子犬のサイズが小さいため、トランスデューサー自体の重量により、心機能の変化や死に至る可能性があります。
3. 左心室流出路と左心房のPLAXビューをキャプチャします。
   1. トランスデューサーをホルダーに入れ、インデックスマークを子犬の右肩に向けて置きます。
   2. トランスデューサーがゲルに接触するまで下げ、左心室流出路をBモードで視覚化します(図2A)。
   3. 大動脈弁尖でMモードを使用して、収縮末期の左心房(LA)の最大直径を測定します(図2B、表1)。 シネストア ボタンを押してデータを記録します。
4. 左心室のPSAXビューをキャプチャして、チャンバーの寸法、壁の厚さ、大動脈の流れ、および肺の流れを測定します。
   1. トランスデューサーをPLAXの時計回りに~90°回転させて、PSAXビューを取得します。
   2. プローブを乳頭筋の高さに配置し、Mモードを使用して、収縮期および拡張期の左心室内径(LVID)、心室中隔の厚さ(IVS)、およびPWを測定します(図3A、表1)。 シネストア ボタンを押してデータを記録します。
   3. 肥大の指標であるRWTを、拡張期チャンバーの寸法を使用して次のように計算します^3,10:
      (拡張末期におけるPW + IVS) / (拡張末部におけるLVID)
   4. トランスデューサーを心臓の基部に向かって動かし、カラードップラーを使用して肺動脈を視覚化します。PWドップラーを押して、肺のピーク流速、肺の流量プロファイル、肺の駆出時間(PET)、および肺の加速時間(PAT)を定量化します^11,12(図3B)。シネストアボタンを押してデータを記録します。
   5. 探触子をさらにベースに向かって動かし、カラードップラーを使用して大動脈の流れを視覚化します(図3C)。PWドップラーを使用して血流を視覚化し、大動脈駆出時間(AET)を測定します。 シネストア ボタンを押してデータを記録します。
   6. 心筋パフォーマンスの指標であるVcf(周回/秒)^13,14を、LVID拡張末期(LVIDd)、LVID収縮末期(LVID)、およびAETを使用して次のように計算します(表1)。
      (LVIDd - LVIDs) / (LVIDd x AET)
5. 頂端の4室のビューをキャプチャします。
   1. プラットフォームをトレンデレンブルグ位置に置き、左に傾け、プローブを調整して4つのチャンバーを視覚化します(図4A)。
   2. カラードップラーを使用して血流を視覚化し、僧帽弁オリフィスの中央にある僧帽弁尖の先端にあるPWドップラーを使用して僧帽弁の流れを記録します。 シネストア を押してデータを記録します。
   3. このビューでは、次のパラメータ^2、3、10 を計算します(図4B および 表1)。
      1. 拡張期(A)の後期の血流の最大速度に対する拡張期(E)の初期の血流の最大速度であるE / A比を計算します。
      2. ピークEから初期拡張期の終わりまでの時間であるE波減速時間(DT)を決定します。
      3. 大動脈弁閉鎖から僧帽弁開放までの時間であるLV等体積緩和時間(IVRT)を計算します。
      4. 僧帽弁閉鎖から大動脈弁開放までの時間であるLV等体積収縮時間(IVCT)を計算します。
   4. 4室ビューの僧帽弁輪の中隔側にある組織ドップラーを使用して、早期拡張期充満(e')および後期拡張期充満(a')のピーク心筋弛緩速度、およびピーク収縮期心筋収縮速度(s')を測定します(図4C および 表1)。 シネストア ボタンを押してデータを記録します。
6. 修正されたPLAXビューをキャプチャして、左前下行冠状動脈を調べます。
   1. 修正されたPLANX^ビュー15を使用して、トランスデューサを横方向に動かし、ビームを前方に向かって傾ける(図5A)。
   2. プローブを動かし、カラードップラーを使用して、大動脈から発生する左主冠状動脈(LCA)の起点を視覚化します。LCAから生成し、左心室前壁と右心室流出路^16,17の間を走るLAD動脈を特定する。この位置で、PWドップラーを適用してLAD流量を測定します(図5B)。シネストアボタンを押してデータを記録します。
   3. 次のLAD冠状動脈流量パラメータを計算します(図5C および 表2):ピーク冠状動脈流速(CFV)、平均CFV、および速度-時間積分(VTI)。
      注:これらのパラメータはすべて、1.5%(ベースライン)の基礎イソフルラン濃度で測定されます。
   4. イソフルラン濃度を2.5%に増やし、最大流量に達するまで5分間待ちます(図5C)。シネストアボタンを押してデータを記録します。ベースライン^18,19,20での拡張期ピークCFVに対する最大流量での拡張期ピークCFVの比率としてCFRを計算します(表2):
      CFR = 拡張期ピークCFV (2.5%) / 拡張期ピークCFV (1.5%)

3.イメージング後の動物のモニタリングとケア

1. 心エコー画像診断が完了したら、子犬を注意深く掃除し、麻酔から約2分間回復させます。
2. 子犬をケージに戻す前に、拒絶反応や共食いを防ぐために、ケージの母親の寝具で子犬を塗ります。
3. 処置後約30分間、母親の行動を観察します。攻撃的な行動が観察された場合は、動物の手順のガイドラインに従って子犬を安楽死させます。

結果

この研究では、7日齢のマウスの子犬を使用して、心臓の形態、機能、および冠状動脈の流れを特徴付けました。マウスの取り扱いは注意して行う必要があり、図1に示すように、マウスプラットフォームは子犬の小さなサイズに適合させる必要があります。PLAXビューの代表的な画像を図2Aと補足ビデオ1に示します。このビューでは、M?...

ディスカッション

予防医学の時代には、心血管機能の変化を早期に評価して、病気の発症を確立し、適切な介入療法を設計する必要があります。マウスは心臓研究の前臨床モデルとしてますます使用されており、心エコー検査は通常、若年成人マウスで行われます。しかし、心疾患の初期段階における遺伝的変化または薬理学的介入の役割を研究するためには、心エコー画像診断を人生の早い段階で開始する?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilating agent	Nair Hair Remover
Electrode gel	Parker Laboratories	15-60
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
Isoflurane	MedVet	RXISO-250
Linear array high frequency transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS550D
Mice breeding pair	Charles River Laboratories	FVB/N	Strain Code 207
Ultrasound Gel	Parker Laboratories	11-08
Vevo Lab Software	FUJIFILM VisualSonics, Inc.		Verison 5.5.1