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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit l’évaluation échocardiographique de la morphologie, de la fonction et du débit sanguin coronaire du ventriculaire gauche chez des souris nouveau-nées âgées de 7 jours.

Résumé

L’échocardiographie est une procédure non invasive qui permet d’évaluer les paramètres structurels et fonctionnels dans des modèles animaux de maladies cardiovasculaires et est utilisée pour évaluer l’impact des traitements potentiels dans les études précliniques. Les études échocardiographiques sont habituellement menées chez de jeunes souris adultes (c.-à-d. âgées de 4 à 6 semaines). L’évaluation de la fonction cardiovasculaire néonatale précoce n’est généralement pas effectuée en raison de la petite taille des petits souris et des difficultés techniques associées. L’un des défis les plus importants est que la courte longueur des membres des chiots les empêche d’atteindre les électrodes de la plate-forme d’échocardiographie. La température corporelle est l’autre défi, car les chiots sont très sensibles aux changements de température. Par conséquent, il est important d’établir un guide pratique pour effectuer des études échocardiographiques chez les petits de petite souris afin d’aider les chercheurs à détecter les changements pathologiques précoces et à étudier la progression des maladies cardiovasculaires au fil du temps. Le présent travail décrit un protocole pour effectuer une échocardiographie chez les bébés souris à l’âge précoce de 7 jours. La caractérisation échocardiographique de la morphologie, de la fonction et du flux coronaire cardiaques chez les souris néonatales est également décrite.

Introduction

L’objectif global de ce protocole est d’examiner la morphologie cardiaque, la fonction et le flux des artères coronaires chez les bébés souris néonatals âgés de 7 jours à l’aide de l’échocardiographie. La raison d’être du développement de cette technique est de déterminer les changements précoces dans le flux coronaire et la fonction cardiaque dans des modèles murins de maladie cardiaque1. Le caractère non invasif de l’échocardiographie est avantageux car il permet aux chercheurs d’évaluer la fonction cardiovasculaire dans des conditions physiologiques et fournit aux chercheurs un outil de dépistage pour l’étude de thérapies ciblées pour traiter les maladies cardiovasculaires 2,3. Traditionnellement, les études échocardiographiques sont menées avec de jeunes souris adultes (4-6 semaines); Cependant, certains modèles de souris (c.-à-d. les modèles génétiquement modifiés) présentent déjà des changements pathologiques et un dysfonctionnement cardiaque à cet âge. Par conséquent, la recherche cardiaque utilisant des modèles animaux s’est concentrée principalement sur les agents thérapeutiques qui améliorent ou traitent le dysfonctionnement cardiaque. En revanche, plus récemment, les efforts de recherche ont été réorientés pour se concentrer sur les mesures préventives et les interventions précoces dans les maladies cardiaques4.

Des études antérieures ont décrit l’utilisation de l’échocardiographie pour mesurer la fonction cardiaque dans des modèles d’infarctus du myocarde chez des souris néonatales 5,6; Cependant, ces études n’ont pas réussi à mesurer le débit coronaire et, surtout, n’ont pas enregistré d’électrocardiogramme (ECG) et de données de fréquence cardiaque (FC) pendant la procédure, probablement en raison de la petite taille des membres des chiots, qui ne pouvaient pas atteindre les électrodes. Nous surmontons ce problème dans ce protocole en attachant une feuille d’aluminium aux membres pour leur permettre d’atteindre les électrodes et de créer un circuit ECG. De plus, ce protocole décrit et caractérise l’écoulement des artères coronaires chez les souris néonatales.

Cette étude a obtenu des images en mode B et en mode M dans des vues parasternales à axe long et court pour mesurer les paramètres structurels et fonctionnels 2,3. Les paramètres morphologiques comprenaient les dimensions auriculaires gauches, les dimensions ventriculaires gauches (VG), l’épaisseur de la paroi BT, la masse BT et l’épaisseur relative de la paroi (RWT). Les paramètres fonctionnels comprenaient la fraction d’éjection (FE), le raccourcissement fractionné (FS), le débit cardiaque (CO) et la vitesse du raccourcissement circonférentiel des fibres (Vcf). Le Doppler à ondes de pouls (PW) a été utilisé pour mesurer le débit aortique dans la vue parasternale à axe court (PSAX) et pour mesurer le débit sanguin mitral dans la vue apicale à quatre chambres. La vue apicale à quatre chambres a également été utilisée pour effectuer un Doppler tissulaire à la partie septale de l’anneau de la valve mitrale. L’écoulement coronaire à l’artère coronaire descendante antérieure gauche (DAL) a également été examiné à l’aide d’une vue parasternale modifiée à long axe (PLAX). La réserve d’écoulement coronaire (CFR) a été calculée après un défi de stress induit par une concentration accrue d’isoflurane.

Le présent protocole démontre que les études échocardiographiques peuvent être réalisées à un âge très précoce chez la souris néonatale, permettant ainsi une reconnaissance précoce des pathologies cardiaques et des études de suivi longitudinal de l’hémodynamique du BT et des paramètres d’écoulement coronaire dans différents modèles de souris. Cette technique peut être utilisée pour étudier le rôle des altérations génétiques ou des interventions pharmacologiques dans la fonction cardiaque aux premiers âges postnatals. De plus, le protocole fournit un outil précieux pour déterminer l’apparition de maladies cardiaques tôt dans la vie, permettant ainsi aux chercheurs de déverrouiller les mécanismes moléculaires sous-jacents aux stades initiaux des maladies cardiaques dans différents modèles murins.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Illinois à Chicago. Pour les expériences, des souris FVB / N âgées de 7 jours ont été utilisées. Le protocole est divisé en préparation de souris, acquisition d’images par échocardiographie et soins post-imagerie des animaux.

1. Préparation de la souris

  1. Obtenez les souris de 7 jours de la cage de reproduction.
    REMARQUE : À cet âge précoce, il est difficile de déterminer le sexe de l’animal par un examen physique.
  2. Placez le gel ECG (voir le tableau des matériaux) sur les électrodes de la plate-forme chauffée. Placez des bandes de papier d’aluminium (~1,5 po x 0,25 po) sur les plaquettes d’électrode pour étendre la portée des électrodes et fixer avec du ruban adhésif (Figure 1A). Ensuite, placez le gel ECG sur les bandes de papier d’aluminium.
    REMARQUE: Assurez-vous que le gel sous les bandes de papier d’aluminium ne sèche pas pendant la procédure. Si cela se produit, ajoutez plus de gel pour maintenir la conductivité.
  3. Découpez un doigt dans un gant en nitrile et ajustez-le pour couvrir à la fois le cône nasal isoflurane/oxygène d’un côté et le nez de souris de l’autre côté (figure 1B).
  4. Placez le chiot de souris dans la chambre d’induction de l’isoflurane et commencez à administrer de l’isoflurane à une concentration de 2,5 % entraînée par 100 % d’oxygène (figure 1C).
  5. Placez le chiot anesthésié en décubitus dorsal sur la plate-forme d’imagerie avec les pattes sur le dessus des feuilles d’aluminium et fixez-le avec du ruban adhésif. Assurez-vous que le circuit électrique est complet et que l’ECG enregistre.
  6. Diminuer l’apport d’isoflurane à 1,5 % entraîné par 100 % d’oxygène. Fixez le doigt découpé du gant autour du nez du chiot avec du ruban adhésif. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les pattes du chiot.
  7. Placez une épaisse couche de gel à ultrasons préchauffé sur le haut du corps du chiot. Utilisez deux rouleaux de gaze pour maintenir le gel à ultrasons en place (Figure 1D).
  8. Utilisez une lampe chauffante pour maintenir la température corporelle normale du chiot (figure 1E).
    REMARQUE: Une sonde rectale n’a pas été utilisée pour surveiller la température corporelle dans la présente étude en raison de la petite taille du chiot.

2. Acquisition et analyses d’images échocardiographiques

  1. Effectuer l’échocardiographie transthoracique à l’aide d’un instrument d’échocardiographie équipé d’un transducteur linéaire à 40 MHz pour le mode B et à 32 MHz pour le Doppler (fréquence d’images 233) (voir le tableau des matériaux), en suivant les protocoles d’échocardiographie de souris adultes 7,8,9.
  2. Évitez d’exercer une pression excessive sur la cavité thoracique du chiot lors de la mise en place du transducteur d’écho pendant l’acquisition d’images échocardiographiques.
    REMARQUE: En raison de la petite taille du chiot, le poids du transducteur lui-même peut entraîner une altération de la fonction cardiaque ou la mort.
  3. Capturez la vue PLAX de la voie d’écoulement ventriculaire gauche et de l’oreillette gauche.
    1. Placez le transducteur dans le support, avec la marque d’index vers l’épaule droite du chiot.
    2. Abaissez le transducteur jusqu’à ce qu’il soit en contact avec le gel et visualisez la voie d’écoulement ventriculaire gauche en mode B (Figure 2A).
    3. Utiliser le mode M au niveau des feuillets aortiques pour mesurer le diamètre maximal de l’oreillette gauche (LA) à l’extrémité de la systole (Figure 2B, Tableau 1). Appuyez sur le bouton Cine Store pour enregistrer les données.
  4. Capturez la vue PSAX du ventricule gauche pour mesurer les dimensions de la chambre, l’épaisseur de la paroi, le débit aortique et le débit pulmonaire.
    1. Faites pivoter le transducteur de ~90° dans le sens des aiguilles d’une montre du PLAX pour obtenir la vue PSAX.
    2. Placez la sonde au niveau des muscles papillaires et utilisez le mode M pour mesurer les diamètres internes du ventricule gauche (LVID), l’épaisseur du septum interventriculaire (IVS) et la PW pendant la systole et la diastole (Figure 3A, Tableau 1). Appuyez sur le bouton Cine Store pour enregistrer les données.
    3. Calculez le RWT, un indice d’hypertrophie, en utilisant les dimensions de la chambre diastolique comme suit 3,10:
      (PW + IVS en fin de diastole) / (LVID en fin de diastole)
    4. Déplacez le transducteur vers la base du cœur et utilisez le Doppler de couleur pour visualiser l’artère pulmonaire. Appuyez sur PW Doppler pour quantifier la vitesse de pointe pulmonaire, les profils d’écoulement pulmonaire, le temps d’éjection pulmonaire (TEP) et le temps d’accélération pulmonaire (PAT)11,12 (Figure 3B). Appuyez sur le bouton Cine Store pour enregistrer les données.
    5. Déplacez le transducteur plus loin vers la base et utilisez le Doppler couleur pour visualiser le flux aortique (Figure 3C). Utilisez PW Doppler pour visualiser le flux sanguin et mesurer le temps d’éjection aortique (AET). Appuyez sur le bouton Cine Store pour enregistrer les données.
    6. Calculez le Vcf (circ/sec)13,14, un indicateur de la performance myocardique, en utilisant la diastole terminale LVID (LVIDd), la LVID end-systole (LVID) et l’AET comme suit (Tableau 1) :
      (LVIDd - LVIDs) / (LVIDd x AET)
  5. Capturez la vue apicale à quatre chambres.
    1. Placez la plate-forme en position Trendelenburg, inclinez-la vers la gauche et ajustez la sonde pour visualiser les quatre chambres (Figure 4A).
    2. Utilisez le Doppler couleur pour visualiser le flux sanguin et le Doppler PW à l’extrémité des feuillets de la valve mitrale au centre de l’orifice de la valve mitrale pour enregistrer le flux mitral. Appuyez sur le Cine Store pour enregistrer les données.
    3. Dans cette vue, calculez les paramètres 2,3,10 suivants (Figure 4B et Tableau 1) :
      1. Calculer le rapport E/A, qui est la vitesse maximale du flux sanguin dans la phase précoce de la diastole (E) sur la vitesse maximale du flux sanguin dans la phase tardive de la diastole (A).
      2. Déterminez le temps de décélération de l’onde E (DT), qui est le temps écoulé entre le pic E et la fin de la diastole précoce.
      3. Calculer le temps de relaxation isovolumique (IVRT) du BT, qui est le temps écoulé entre la fermeture de la valve aortique et l’ouverture de la valve mitrale.
      4. Calculer le temps de contraction isovolumique du BT (SCIV), qui est le temps écoulé entre la fermeture de la valve mitrale et l’ouverture de la valve aortique.
    4. Utiliser le Doppler tissulaire à la face septale de l’anneau valvulaire mitrale dans une vue à quatre chambres pour mesurer la vitesse maximale de relaxation myocardique dans le remplissage diastolique précoce (e') et le remplissage diastolique tardif (a'), ainsi que la vitesse maximale de contraction systolique du myocarde (s') (Figure 4C et Tableau 1). Appuyez sur le bouton Cine Store pour enregistrer les données.
  6. Capturez la vue PLAX modifiée pour examiner l’artère coronaire descendante antérieure gauche.
    1. Utiliser une vue PLAX15 modifiée, en déplaçant le transducteur latéralement et en inclinant le faisceau vers l’antérieur (Figure 5A).
    2. Déplacez la sonde et utilisez le Doppler couleur pour visualiser l’origine de l’artère coronaire principale gauche (ACL) générée à partir de l’aorte. Identifier l’artère LAD qui génère à partir de l’ACL et passe entre la paroi antérieure ventriculaire gauche et la voie d’écoulement ventriculaire droite16,17. Dans cette position, appliquer PW Doppler pour mesurer le débit LAD (Figure 5B). Appuyez sur le bouton Cine Store pour enregistrer les données.
    3. Calculez les paramètres suivants de l’écoulement des artères coronaires LAD (Figure 5C et Tableau 2) : vitesse maximale de l’écoulement coronaire (CFV), CFV moyenne et vélocité-temps intégrale (VTI).
      REMARQUE : Tous ces paramètres sont mesurés à une concentration basale d’isoflurane de 1,5 % (valeur de référence).
    4. Augmenter la concentration d’isoflurane à 2,5 % et attendre 5 minutes pour atteindre le débit maximal (figure 5C). Appuyez sur le bouton Cine Store pour enregistrer les données. Calculer le CFR comme le rapport entre le CFV de crête diastolique au débit maximal et le CFV de crête diastolique au départ18,19,20 (Tableau 2) :
      CFR = CFV pic diastolique (2,5%) / CFV pic diastolique (1,5%)

3. Surveillance et soins post-imagerie des animaux

  1. Après avoir terminé l’imagerie échocardiographique, nettoyez soigneusement le chiot et laissez-le récupérer de l’anesthésie pendant environ 2 minutes.
  2. Avant de retourner le chiot dans sa cage, enduisez-le avec la litière de la mère en cage pour éviter le rejet ou la cannibalisation.
  3. Observez le comportement de la mère pendant environ 30 minutes après la procédure. Si un comportement agressif est observé, euthanasier le chiot en suivant les directives de procédure animale.

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Résultats

Cette étude a utilisé des bébés souris âgés de 7 jours pour caractériser la morphologie cardiaque, la fonction et le flux des artères coronaires. La manipulation de la souris doit être effectuée avec soin, et la plate-forme de la souris doit être adaptée à la petite taille des petits, comme décrit à la figure 1. Une image représentative de la vue PLAX est illustrée à la figure 2A et à la vidéo supplémentaire 1. Dans cette vu...

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Discussion

À l’ère de la médecine préventive, une évaluation précoce des altérations de la fonction cardiovasculaire est nécessaire pour établir l’apparition de la maladie et concevoir des thérapies interventionnelles appropriées. Les souris sont de plus en plus utilisées comme modèles précliniques dans la recherche cardiaque, et les études échocardiographiques sont généralement menées avec de jeunes souris adultes. Cependant, pour étudier le rôle des altérations génétiques ou des interventions pharmacol...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Chad M. Warren, MS (Université de l’Illinois à Chicago), pour l’édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les subventions NIH/NHLBI K01HL155241 et AHA CDA849387 au PCR.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Depilating agentNair Hair Remover
Electrode gelParker Laboratories15-60
High Frequency UltrasoundFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100
IsofluraneMedVetRXISO-250
Linear array high frequency transducerFUJIFILM VisualSonics, Inc.MS550D
Mice breeding pairCharles River LaboratoriesFVB/NStrain Code 207
Ultrasound GelParker Laboratories11-08
Vevo Lab SoftwareFUJIFILM VisualSonics, Inc.Verison 5.5.1

Références

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