JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает эхокардиографическую оценку морфологии, функции и коронарного кровотока левого желудочка у 7-дневных новорожденных мышей.

Аннотация

Эхокардиография является неинвазивной процедурой, которая позволяет оценить структурные и функциональные параметры на животных моделях сердечно-сосудистых заболеваний и используется для оценки влияния потенциальных методов лечения в доклинических исследованиях. Эхокардиографические исследования обычно проводятся на молодых взрослых мышах (т.е. в возрасте 4-6 недель). Оценка ранней сердечно-сосудистой функции новорожденных обычно не выполняется из-за небольшого размера детенышей мышей и связанных с этим технических трудностей. Одна из наиболее важных проблем заключается в том, что короткая длина конечностей щенков не позволяет им достичь электродов в эхокардиографической платформе. Температура тела является другой проблемой, так как щенки очень восприимчивы к изменениям температуры. Поэтому важно создать практическое руководство по проведению эхокардиографических исследований у маленьких детенышей мышей, чтобы помочь исследователям обнаружить ранние патологические изменения и изучить прогрессирование сердечно-сосудистых заболеваний с течением времени. Текущая работа описывает протокол выполнения эхокардиографии у щенков мышей в раннем возрасте 7 дней. Также описана эхокардиографическая характеристика сердечной морфологии, функции и коронарного потока у неонатальных мышей.

Введение

Общей целью этого протокола является изучение морфологии сердца, функции и течения коронарных артерий у 7-дневных детенышей неонатальных мышей с использованием эхокардиографии. Обоснование разработки этого метода заключается в определении ранних изменений коронарного кровотока и сердечной функции на мышиных моделях сердечных заболеваний1. Неинвазивный характер эхокардиографии является преимуществом, поскольку он позволяет исследователям оценивать сердечно-сосудистую функцию в физиологических условиях и предоставляет исследователям инструмент скрининга для изучения таргетной терапии для лечения сердечно-сосудистых заболеваний 2,3. Традиционно эхокардиографические исследования проводятся с молодыми взрослыми мышами (4-6 недель); однако некоторые модели мышей (т.е. генетически модифицированные модели) уже демонстрируют патологические изменения и сердечную дисфункцию в этом возрасте. Поэтому кардиологические исследования с использованием животных моделей были сосредоточены в первую очередь на терапевтических агентах, которые улучшают или лечат сердечную дисфункцию. Напротив, в последнее время исследовательские усилия были перенаправлены на профилактические меры и ранние вмешательства при сердечных заболеваниях4.

Предыдущие исследования описывали использование эхокардиографии для измерения сердечной функции в моделях инфаркта миокарда у неонатальных мышей 5,6; однако эти исследования не смогли измерить коронарный поток и, самое главное, не смогли записать данные электрокардиограммы (ЭКГ) и частоты сердечных сокращений (ЧСС) во время процедуры, скорее всего, из-за небольшого размера конечностей щенков, которые не могли достичь электродных подушечек. Мы преодолеваем эту проблему в этом протоколе, прикрепляя алюминиевую фольгу к конечностям, чтобы они могли достичь электродных подушечек и создать схему ЭКГ. Кроме того, этот протокол описывает и характеризует поток коронарных артерий у неонатальных мышей.

В ходе исследования были получены изображения В-моды и М-моды в парастернальных видах длинной и короткой осей для измерения структурных и функциональных параметров 2,3. Морфологические параметры включали размеры левого предсердия, размеры левого желудочка (LV), толщину стенки LV, массу LV и относительную толщину стенки (RWT). Функциональные параметры включали фракцию выброса (EF), дробное укорочение (FS), сердечный выброс (CO) и скорость укорочения окружного волокна (Vcf). Допплер импульсной волны (PW) использовался для измерения аортального потока в виде парастернальной короткой оси (PSAX) и для измерения митрального кровотока в апикальном четырехкамерном виде. Апикальный четырехкамерный вид также использовался для выполнения тканевой допплерографии в перегородочной части кольцевого кольца митрального клапана. Коронарный поток в левой передней нисходящей (LAD) коронарной артерии также исследовали с использованием модифицированного вида парастернальной длинной оси (PLAX). Резерв коронарного потока (CFR) был рассчитан после стрессового вызова, вызванного повышенной концентрацией изофлурана.

Настоящий протокол демонстрирует, что эхокардиографические исследования могут быть выполнены в очень раннем возрасте на неонатальных мышах, что позволяет раннее распознавание сердечных патологий и продольные последующие исследования гемодинамики лЖ и параметров коронарного потока у разных моделей мышей. Этот метод может быть использован для изучения роли генетических изменений или фармакологических вмешательств в сердечной функции в раннем постнатальном возрасте. Кроме того, протокол предоставляет ценный инструмент для определения начала сердечных заболеваний в раннем возрасте, что позволяет исследователям разблокировать молекулярные механизмы, лежащие в основе начальных стадий сердечных заболеваний в различных моделях мышей.

протокол

Все эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Иллинойса в Чикаго. Для экспериментов использовались 7-дневные мыши FVB/N. Протокол подразделяется на подготовку мышей, получение изображений эхокардиографии и поствизуальный уход за животными.

1. Подготовка мыши

  1. Достаньте 7-дневных мышей из гнездовой клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом раннем возрасте трудно определить пол животного путем физического осмотра.
  2. Поместите гель ЭКГ (см. Таблицу материалов) на нагретую платформу электродных прокладок. Поместите полоски из алюминиевой фольги (~1,5 дюйма x 0,25 дюйма) поверх электродных подушечек, чтобы расширить диапазон электродов и закрепить лентой (рисунок 1A). Затем поместите гель ЭКГ поверх полосок алюминиевой фольги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что гель под полосками алюминиевой фольги не высыхает во время процедуры. Если это произойдет, добавьте больше геля для поддержания проводимости.
  3. Вырежьте палец из нитриловой перчатки и установите его, чтобы покрыть как конус носа изофлурана/кислорода с одной стороны, так и нос мыши с другой стороны (рисунок 1B).
  4. Поместите щенка мыши в индукционную камеру изофлурана и начните доставку изофлурана в концентрации 2,5% за счет 100% кислорода (рисунок 1C).
  5. Поместите обезболенного щенка в лежачее положение на платформе для визуализации лапами поверх подушечек из алюминиевой фольги и закрепите скотчем. Убедитесь, что электрическая цепь завершена и что ЭКГ записывается.
  6. Уменьшить доставку изофлурана до 1,5% за счет 100% кислорода. Закрепите вырезанный палец от перчатки вокруг носа щенка скотчем. Подтвердите глубину анестезии, зажав лапы щенка.
  7. Поместите толстый слой предварительного ультразвукового геля поверх верхней части тела щенка. Используйте два марлевых рулона, чтобы ультразвуковой гель оставался на месте (рисунок 1D).
  8. Используйте нагревательную лампу для поддержания нормальной температуры тела щенка (рисунок 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ректальный зонд не использовался для мониторинга температуры тела в текущем исследовании из-за небольшого размера щенка.

2. Получение и анализ эхокардиографического изображения

  1. Выполнять трансторакальную эхокардиографию с помощью эхокардиографического прибора, оснащенного линейным датчиком решетки на частоте 40 МГц для B-режима и на частоте 32 МГц для доплеровской (частота кадров 233) (см. Таблицу материалов), следуя протоколам эхокардиографии взрослых мышей 7,8,9.
  2. Избегайте чрезмерного давления на грудную полость щенка при размещении эхопреобразователя во время получения эхокардиографического изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого размера щенка вес самого датчика может привести к изменению сердечной функции или смерти.
  3. Захватите plax вид левого желудочкового оттока и левого предсердия.
    1. Поместите преобразователь в держатель, указательной отметкой к правому плечу щенка.
    2. Опустите датчик до тех пор, пока он не соприкоснется с гелем и визуализируйте отток левого желудочка в В-режиме (рисунок 2А).
    3. Используйте M-режим на листочках аорты для измерения максимального диаметра левого предсердия (LA) в конце систолы (рисунок 2B, таблица 1). Нажмите кнопку Cine Store , чтобы записать данные.
  4. Захватите вид PSAX левого желудочка для измерения размеров камеры, толщины стенки, потока аорты и легочного потока.
    1. Поверните преобразователь ~90° по часовой стрелке PLAX для получения вида PSAX.
    2. Поместите зонд на уровень сосочковых мышц и используйте M-режим для измерения внутренних диаметров левого желудочка (LVID), толщины межжелудочковой перегородки (IVS) и PW во время систолы и диастолы (рисунок 3A, таблица 1). Нажмите кнопку Cine Store , чтобы записать данные.
    3. Рассчитайте RWT, индекс гипертрофии, используя размеры диастолической камеры следующим образом 3,10:
      (PW + IVS в конце диастолы) / (LVID в конце диастолы)
    4. Переместите датчик к основанию сердца и используйте цветной допплер для визуализации легочной артерии. Нажмите PW Doppler для количественной оценки скорости легочного пикового потока, профилей легочного потока, времени легочного выброса (PET) и времени легочного ускорения (PAT)11,12 (рисунок 3B). Нажмите кнопку Cine Store, чтобы записать данные.
    5. Переместите преобразователь дальше к основанию и используйте цветной допплер для визуализации аортального потока (рисунок 3C). Используйте PW Doppler для визуализации кровотока и измерения времени выброса аорты (AET). Нажмите кнопку Cine Store , чтобы записать данные.
    6. Рассчитайте Vcf (окружность/сек)13,14, показатель производительности миокарда, используя конечную диастолу LVID (LVIDd), конечную систолу LVID (LVID) и AET следующим образом (таблица 1):
      (LVIDd - LVID) / (LVIDd x AET)
  5. Захватите апикальный четырехкамерный вид.
    1. Поместите платформу в положение Trendelenburg, наклоните ее влево и отрегулируйте зонд для визуализации четырех камер (рисунок 4A).
    2. Используйте цветной допплер для визуализации кровотока и PW doppler на кончике створок митрального клапана в центре отверстия митрального клапана для записи митрального потока. Нажмите Cine Store , чтобы записать данные.
    3. В этом представлении рассчитайте следующие параметры 2,3,10 (рисунок 4В и таблица 1):
      1. Рассчитайте отношение E/A, которое представляет собой максимальную скорость кровотока в ранней фазе диастолы (E) над максимальной скоростью кровотока в поздней фазе диастолы (A).
      2. Определите время замедления E-волны (DT), которое представляет собой время от пика E до конца ранней диастолы.
      3. Рассчитайте время изоволюмической релаксации LV (IVRT), которое представляет собой время от закрытия аортального клапана до открытия митрального клапана.
      4. Рассчитайте время изоволюмического сокращения ЛЖ (IVCT), которое представляет собой время от закрытия митрального клапана до открытия аортального клапана.
    4. Используйте тканевый допплер на перегородочной стороне кольцевого кольца митрального клапана в четырехкамерном виде для измерения пиковой скорости релаксации миокарда в раннем диастолическом заполнении (e') и позднем диастолическом заполнении (a'), а также пиковой скорости сокращения систолического миокарда (s') (рисунок 4C и таблица 1). Нажмите кнопку Cine Store , чтобы записать данные.
  6. Захватите модифицированный вид PLAX, чтобы исследовать левую переднюю нисходящую коронарную артерию.
    1. Используйте модифицированный видPLAX 15, перемещая преобразователь в боковом направлении и наклоняя луч в сторону передней части (фиг.5A).
    2. Переместите зонд и используйте цветной допплер для визуализации происхождения левой главной коронарной артерии (LCA), которая генерируется из аорты. Определите артерию LAD, которая генерируется из LCA и проходит между передней стенкой левого желудочка и оттоком правого желудочка16,17. В этом положении примените ДОППЛЕР PW для измерения потока LAD (рисунок 5B). Нажмите кнопку Cine Store, чтобы записать данные.
    3. Рассчитайте следующие параметры потока коронарной артерии LAD (рисунок 5C и таблица 2): пиковая скорость коронарного потока (CFV), средняя CFV и интеграл скорости-времени (VTI).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти параметры измеряются при базальной концентрации изофлурана 1,5% (исходный уровень).
    4. Увеличьте концентрацию изофлурана до 2,5% и подождите 5 мин для достижения максимального расхода (рисунок 5С). Нажмите кнопку Cine Store, чтобы записать данные. Рассчитать CFR как отношение диастолического пика CFV при максимальном потоке к диастолическому пику CFV при исходном уровне 18,19,20 (таблица 2):
      CFR = диастолический пик CFV (2,5%) / диастолический пик CFV (1,5%)

3. Поствизуальный мониторинг животных и уход за ними

  1. После завершения эхокардиографической визуализации тщательно очистите щенка и дайте ему восстановиться после анестезии в течение примерно 2 минут.
  2. Прежде чем вернуть щенка в клетку, смажьте щенка постельным бельем матери в клетке, чтобы предотвратить отторжение или каннибализацию.
  3. Наблюдать за поведением матери в течение примерно 30 минут после процедуры. Если наблюдается агрессивное поведение, усыпните щенка, следуя рекомендациям по процедуре для животных.

Результаты

В этом исследовании использовались 7-дневные детеныши мышей для характеристики сердечной морфологии, функции и потока коронарных артерий. Работа с мышью должна осуществляться с осторожностью, а платформа мыши должна быть адаптирована для небольшого размера детенышей, как описано

Обсуждение

В эпоху профилактической медицины ранняя оценка изменений в сердечно-сосудистой функции требуется для установления начала заболевания и разработки соответствующих интервенционных методов лечения. Мыши все чаще используются в качестве доклинических моделей в кардиологических иссл?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Чада М. Уоррена, MS (Университет Иллинойса в Чикаго), за редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана грантами NIH/NHLBI K01HL155241 и AHA CDA849387 для ПЦР.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Depilating agentNair Hair Remover
Electrode gelParker Laboratories15-60
High Frequency UltrasoundFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100
IsofluraneMedVetRXISO-250
Linear array high frequency transducerFUJIFILM VisualSonics, Inc.MS550D
Mice breeding pairCharles River LaboratoriesFVB/NStrain Code 207
Ultrasound GelParker Laboratories11-08
Vevo Lab SoftwareFUJIFILM VisualSonics, Inc.Verison 5.5.1

Ссылки

  1. Le, V. P., Wagenseil, J. E. Echocardiographic Characterization of Postnatal Development in Mice with Reduced Arterial Elasticity. Cardiovascular Engineering and Technology. 3 (4), 424-438 (2012).
  2. Nagueh, S. F., et al. Recommendations for the Evaluation of Left Ventricular Diastolic Function by Echocardiography: An Update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. European Heart Journal: Cardiovascular Imaging. 17 (12), 1321-1360 (2016).
  3. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. European Heart Journal: Cardiovascular Imaging. 16 (3), 233-270 (2015).
  4. Chrysant, S. G. A new paradigm in the treatment of the cardiovascular disease continuum: focus on prevention. Hippokratia. 15 (1), 7-11 (2011).
  5. Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial infarction in neonatal mice, a model of cardiac regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocol. 9 (2), 305-311 (2014).
  7. Chowdhury, S. A. K., et al. Modifications of sarcoplasmic reticulum function prevent progression of sarcomere-linked hypertrophic cardiomyopathy despite a persistent increase in myofilament calcium response. Frontiers in Physiology. 11, 107 (2020).
  8. Batra, A., et al. Deletion of P21-activated kinase-1 induces age-dependent increased visceral adiposity and cardiac dysfunction in female mice. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1337-1349 (2021).
  9. Capote, A. E., et al. B-arrestin-2 signaling is important to preserve cardiac function during aging. Frontiers in Physiology. 12, 1302 (2021).
  10. Armstrong, W. F., Ryan, T., Feigenbaum, H. . Feigenbaum's Echocardiography. 7th ed. , (2010).
  11. Su, J., et al. Impact of chronic hypoxia on proximal pulmonary artery wave propagation and mechanical properties in rats. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 314 (6), 1264-1278 (2018).
  12. Rudski, L. G., et al. Guidelines for the echocardiographic assessment of the right heart in adults: a report from the American Society of Echocardiography endorsed by the European Association of Echocardiography, a registered branch of the European Society of Cardiology, and the Canadian Society of Echocardiography. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (7), 685-713 (2010).
  13. Wilson, J. R., Reichek, N. Echocardiographic indices of left ventricular function. A comparison. Chest. 76 (4), 441-447 (1979).
  14. Stypmann, J., et al. Echocardiographic assessment of global left ventricular function in mice. Lab Animal. 43 (2), 127-137 (2009).
  15. Wikstrom, J., Gronros, J., Bergstrom, G., Gan, L. M. Functional and morphologic imaging of coronary atherosclerosis in living mice using high-resolution color Doppler echocardiography and ultrasound biomicroscopy. Journal of the American College of Cardiology. 46 (4), 720-727 (2005).
  16. Douglas, P. S., Fiolkoski, J., Berko, B., Reichek, N. Echocardiographic visualization of coronary artery anatomy in the adult. Journal of the American College of Cardiology. 11 (3), 565-571 (1988).
  17. Lambertz, H., Lethen, H., Tries, H. P., Kersting, S. Non-invasive assessment of coronary flow reserve - valuable functional information in cardiac workflow. Ultraschall in der Medizin. 25 (1), 25-33 (2004).
  18. Lenzarini, F., Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Faita, F. Time course of isoflurane-induced vasodilation: A Doppler ultrasound study of the left coronary artery in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (4), 999-1009 (2016).
  19. Gan, L. M., Wikstrom, J., Bergstrom, G., Wandt, B. Non-invasive imaging of coronary arteries in living mice using high-resolution echocardiography. Scandinavian Cardiovascular Journal. 38 (2), 121-126 (2004).
  20. Gan, L. M., Wikstrom, J., Fritsche-Danielson, R. Coronary flow reserve from mouse to man--from mechanistic understanding to future interventions. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (5), 715-728 (2013).
  21. Krzanowski, M., Bodzon, W., Dimitrow, P. P. Imaging of all three coronary arteries by transthoracic echocardiography. An illustrated guide. Cardiovascular Ultrasound. 1, 16 (2003).
  22. Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR Journal. 52 (3), 21-31 (2011).
  23. Ha, T. W., Oh, B., Kang, J. O. Electrocardiogram recordings in anesthetized mice using lead II. Journal of Visualized Experiments. (160), e61583 (2020).
  24. Chu, V., et al. Method for non-invasively recording electrocardiograms in conscious mice. BMC Physiology. 1, 6 (2001).
  25. Hartley, C. J., et al. Effects of isoflurane on coronary blood flow velocity in young, old and ApoE(-/-) mice measured by Doppler ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (4), 512-521 (2007).
  26. You, J., Wu, J., Ge, J., Zou, Y. Comparison between adenosine and isoflurane for assessing the coronary flow reserve in mouse models of left ventricular pressure and volume overload. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 303 (10), 1199-1207 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены