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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la valutazione ecocardiografica della morfologia, della funzione e del flusso sanguigno coronarico del ventricolo sinistro in topi neonati di 7 giorni.

Abstract

L'ecocardiografia è una procedura non invasiva che consente la valutazione dei parametri strutturali e funzionali in modelli animali di malattie cardiovascolari e viene utilizzata per valutare l'impatto di potenziali trattamenti negli studi preclinici. Gli studi ecocardiografici sono di solito condotti in topi giovani adulti (cioè 4-6 settimane di età). La valutazione della funzione cardiovascolare neonatale precoce non viene solitamente eseguita a causa delle piccole dimensioni dei cuccioli di topo e delle difficoltà tecniche associate. Una delle sfide più importanti è che la breve lunghezza degli arti dei cuccioli impedisce loro di raggiungere gli elettrodi nella piattaforma ecocardiografica. La temperatura corporea è l'altra sfida, poiché i cuccioli sono molto sensibili ai cambiamenti di temperatura. Pertanto, è importante stabilire una guida pratica per l'esecuzione di studi ecocardiografici in piccoli cuccioli di topo per aiutare i ricercatori a rilevare i primi cambiamenti patologici e studiare la progressione delle malattie cardiovascolari nel tempo. Il lavoro attuale descrive un protocollo per eseguire l'ecocardiografia nei cuccioli di topo alla tenera età di 7 giorni. Viene inoltre descritta la caratterizzazione ecocardiografica della morfologia, della funzione e del flusso coronarico cardiaco nei topi neonatali.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo protocollo è esaminare la morfologia, la funzione e il flusso dell'arteria coronaria cardiaca in cuccioli di topo neonatale di 7 giorni utilizzando l'ecocardiografia. Il razionale alla base dello sviluppo di questa tecnica è quello di determinare i primi cambiamenti nel flusso coronarico e nella funzione cardiaca nei modelli murini di malattia cardiaca1. La natura non invasiva dell'ecocardiografia è vantaggiosa perché consente ai ricercatori di valutare la funzione cardiovascolare in condizioni fisiologiche e fornisce ai ricercatori uno strumento di screening per lo studio di terapie mirate per il trattamento delle malattie cardiovascolari 2,3. Tradizionalmente, gli studi ecocardiografici sono condotti con topi giovani adulti (4-6 settimane); Tuttavia, alcuni modelli di topi (cioè modelli geneticamente modificati) mostrano già cambiamenti patologici e disfunzione cardiaca a questa età. Pertanto, la ricerca cardiaca che utilizza modelli animali si è concentrata principalmente su agenti terapeutici che migliorano o trattano la disfunzione cardiaca. Al contrario, più recentemente, gli sforzi di ricerca sono stati reindirizzati per concentrarsi su misure preventive e interventi precoci nelle malattie cardiache4.

Studi precedenti hanno descritto l'uso dell'ecocardiografia per misurare la funzione cardiaca in modelli di infarto miocardico in topi neonatali 5,6; tuttavia, questi studi non sono riusciti a misurare il flusso coronarico e, soprattutto, non sono riusciti a registrare un elettrocardiogramma (ECG) e dati di frequenza cardiaca (FC) durante la procedura, molto probabilmente a causa delle piccole dimensioni degli arti dei cuccioli, che non potevano raggiungere gli elettrodi. Superiamo questo problema in questo protocollo attaccando un foglio di alluminio agli arti per consentire loro di raggiungere i pad degli elettrodi e creare un circuito ECG. Inoltre, questo protocollo descrive e caratterizza il flusso coronarico nei topi neonatali.

Questo studio ha ottenuto immagini B-mode e M-mode in viste parasternali ad asse lungo e corto per misurare i parametri strutturali e funzionali 2,3. I parametri morfologici includevano le dimensioni dell'atriale sinistro, le dimensioni del ventricolo sinistro (LV), lo spessore della parete LV, la massa LV e lo spessore della parete relativa (RWT). I parametri funzionali includevano la frazione di eiezione (EF), l'accorciamento frazionario (FS), la gittata cardiaca (CO) e la velocità di accorciamento delle fibre circonferenziali (Vcf). Il Doppler a onde di impulso (PW) è stato utilizzato per misurare il flusso aortico nella vista dell'asse corto parasternale (PSAX) e per misurare il flusso sanguigno mitralico nella vista apicale a quattro camere. La vista apicale a quattro camere è stata utilizzata anche per eseguire il Doppler tissutale nella parte settale dell'anulus della valvola mitrale. Anche il flusso coronarico all'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) è stato esaminato utilizzando una vista modificata dell'asse lungo parasternale (PLAX). La riserva di flusso coronarico (CFR) è stata calcolata dopo una sfida da stress indotta dall'aumento della concentrazione di isoflurano.

Il presente protocollo dimostra che gli studi ecocardiografici possono essere eseguiti in età molto precoce nei topi neonatali, consentendo così il riconoscimento precoce delle patologie cardiache e studi longitudinali di follow-up dell'emodinamica del ventricolo sinistro e dei parametri di flusso coronarico in diversi modelli di topi. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare il ruolo delle alterazioni genetiche o degli interventi farmacologici nella funzione cardiaca nelle prime età postnatali. Inoltre, il protocollo fornisce uno strumento prezioso per determinare l'insorgenza di malattie cardiache nelle prime fasi della vita, consentendo così ai ricercatori di sbloccare i meccanismi molecolari alla base delle fasi iniziali delle malattie cardiache in diversi modelli murini.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee dell'Università dell'Illinois a Chicago. Per gli esperimenti, sono stati utilizzati topi FVB / N di 7 giorni. Il protocollo è diviso in preparazione del topo, acquisizione di immagini ecocardiografiche e cura degli animali post-imaging.

1. Preparazione del mouse

  1. Prendi i topi di 7 giorni dalla gabbia di allevamento.
    NOTA: In questa tenera età, è difficile determinare il sesso dell'animale mediante esame fisico.
  2. Posizionare il gel ECG (vedere la tabella dei materiali) sui cuscinetti degli elettrodi della piattaforma riscaldati. Posizionare strisce di alluminio (~ 1,5 pollici x 0,25 pollici) sopra i cuscinetti degli elettrodi per estendere la gamma degli elettrodi e fissarli con nastro adesivo (Figura 1A). Successivamente, posizionare il gel ECG sopra le strisce di alluminio.
    NOTA: Assicurarsi che il gel sotto le strisce di alluminio non si asciughi durante la procedura. Se ciò si verifica, aggiungere più gel per mantenere la conduttività.
  3. Ritagliare un dito da un guanto in nitrile e montarlo per coprire sia il cono naso isoflurano/ossigeno da un lato che il naso del topo dall'altro lato (Figura 1B).
  4. Posizionare il cucciolo di topo nella camera di induzione dell'isoflurano e iniziare la somministrazione di isoflurano con una concentrazione del 2,5% guidata dal 100% di ossigeno (Figura 1C).
  5. Posizionare il cucciolo anestetizzato in posizione supina sulla piattaforma di imaging con le zampe sopra i cuscinetti di alluminio e fissare con del nastro adesivo. Assicurarsi che il circuito elettrico sia completo e che l'ECG stia registrando.
  6. Diminuire l'erogazione di isoflurano all'1,5% guidata dal 100% di ossigeno. Fissare il dito ritagliato dal guanto intorno al naso del cucciolo con del nastro adesivo. Conferma la profondità dell'anestesia pizzicando le zampe del cucciolo.
  7. Posizionare uno spesso strato di gel ad ultrasuoni preriscaldato sulla parte superiore del corpo del cucciolo. Utilizzare due rotoli di garza per mantenere il gel ad ultrasuoni in posizione (Figura 1D).
  8. Utilizzare una lampada riscaldante per mantenere la normale temperatura corporea del cucciolo (Figura 1E).
    NOTA: Una sonda rettale non è stata utilizzata per monitorare la temperatura corporea nello studio attuale a causa delle piccole dimensioni del cucciolo.

2. Acquisizione e analisi di immagini ecocardiografiche

  1. Eseguire l'ecocardiografia transtoracica utilizzando uno strumento ecocardiografico dotato di un trasduttore ad array lineare a 40 MHz per il B-mode e a 32 MHz per il Doppler (frame rate 233) (vedi Tabella dei Materiali), seguendo i protocolli di ecocardiografia di topi adulti 7,8,9.
  2. Evitare di esercitare una pressione eccessiva sulla cavità toracica del cucciolo quando si posiziona il trasduttore ecologico durante l'acquisizione dell'immagine ecocardiografica.
    NOTA: A causa delle piccole dimensioni del cucciolo, il peso del trasduttore stesso può causare un'alterazione della funzione cardiaca o la morte.
  3. Cattura la vista PLAX del tratto di efflusso ventricolare sinistro e dell'atrio sinistro.
    1. Posizionare il trasduttore nel supporto, con il segno dell'indice verso la spalla destra del cucciolo.
    2. Abbassare il trasduttore fino a quando non è in contatto con il gel e visualizzare il tratto di efflusso ventricolare sinistro in modalità B (Figura 2A).
    3. Utilizzare la modalità M sui lembi aortici per misurare il diametro massimo dell'atrio sinistro (LA) a fine sistole (Figura 2B, Tabella 1). Premere il pulsante Cine Store per registrare i dati.
  4. Cattura la vista PSAX del ventricolo sinistro per misurare le dimensioni della camera, lo spessore della parete, il flusso aortico e il flusso polmonare.
    1. Ruotare il trasduttore ~90° in senso orario del PLAX per ottenere la vista PSAX.
    2. Posizionare la sonda a livello dei muscoli papillari e utilizzare la modalità M per misurare i diametri interni ventricolari sinistri (LVID), lo spessore del setto interventricolare (IVS) e la PW durante la sistole e la diastole (Figura 3A, Tabella 1). Premere il pulsante Cine Store per registrare i dati.
    3. Calcolare l'RWT, un indice di ipertrofia, utilizzando le dimensioni della camera diastolica come segue 3,10:
      (PW + IVS a end-diastole) / (LVID a end-diastole)
    4. Spostare il trasduttore verso la base del cuore e utilizzare il color Doppler per visualizzare l'arteria polmonare. Premere PW Doppler per quantificare la velocità del flusso di picco polmonare, i profili di flusso polmonare, il tempo di eiezione polmonare (PET) e il tempo di accelerazione polmonare (PAT)11,12 (Figura 3B). Premere il pulsante Cine Store per registrare i dati.
    5. Spostare ulteriormente il trasduttore verso la base e utilizzare Color Doppler per visualizzare il flusso aortico (Figura 3C). Utilizzare PW Doppler per visualizzare il flusso sanguigno e misurare il tempo di eiezione aortica (AET). Premere il pulsante Cine Store per registrare i dati.
    6. Calcolare il Vcf (circ/sec)13,14, un indicatore delle prestazioni miocardiche, utilizzando LVID end-diastole (LVIDd), LVID end-systole (LVIDs) e AET come segue (Tabella 1):
      (LVIDd - LVIDs) / (LVIDd x AET)
  5. Cattura la vista apicale a quattro camere.
    1. Posizionare la piattaforma nella posizione Trendelenburg, inclinarla verso sinistra e regolare la sonda per visualizzare le quattro camere (Figura 4A).
    2. Utilizzare Color Doppler per visualizzare il flusso sanguigno e PW Doppler sulla punta dei lembi della valvola mitrale al centro dell'orifizio della valvola mitrale per registrare il flusso mitrale. Premere Cine Store per registrare i dati.
    3. In questa vista, calcolare i seguenti parametri 2,3,10 (Figura 4B e Tabella 1):
      1. Calcolare il rapporto E/A, che è la velocità massima del flusso sanguigno nella fase iniziale della diastole (E) rispetto alla velocità massima del flusso sanguigno nella fase finale della diastole (A).
      2. Determinare il tempo di decelerazione dell'onda E (DT), che è il tempo dal picco E alla fine della diastole precoce.
      3. Calcolare il tempo di rilassamento isovolumemico LV (IVRT), che è il tempo dalla chiusura della valvola aortica all'apertura della valvola mitrale.
      4. Calcolare il tempo di contrazione isovolumica del ventricolo sinistro (IVCT), che è il tempo che intercorre tra la chiusura della valvola mitrale e l'apertura della valvola aortica.
    4. Utilizzare il Doppler tissutale sul lato settale dell'anulus della valvola mitrale in una vista a quattro camere per misurare la velocità di rilassamento miocardico di picco nel riempimento diastolico precoce (e') e nel riempimento diastolico tardivo (a'), nonché la velocità di contrazione miocardica sistolica di picco (s') (Figura 4C e Tabella 1). Premere il pulsante Cine Store per registrare i dati.
  6. Acquisire la vista PLAX modificata per esaminare l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra.
    1. Utilizzare una vista PLAX modificata15, spostando il trasduttore lateralmente e inclinando il fascio verso l'anteriore (Figura 5A).
    2. Spostare la sonda e utilizzare Color Doppler per visualizzare l'origine dell'arteria coronaria principale sinistra (LCA) che genera dall'aorta. Identificare l'arteria LAD che genera dalla LCA e corre tra la parete anteriore ventricolare sinistra e il tratto di efflusso ventricolare destro16,17. In questa posizione, applicare PW Doppler per misurare il flusso LAD (Figura 5B). Premere il pulsante Cine Store per registrare i dati.
    3. Calcolare i seguenti parametri di flusso coronarico LAD (Figura 5C e Tabella 2): velocità di picco del flusso coronarico (CFV), CFV medio e integrale velocità-tempo (VTI).
      NOTA: Tutti questi parametri sono misurati ad una concentrazione basale di isoflurano dell'1,5% (basale).
    4. Aumentare la concentrazione di isoflurano al 2,5% e attendere 5 minuti per ottenere il flusso massimo (Figura 5C). Premere il pulsante Cine Store per registrare i dati. Calcolare il CFR come rapporto tra CFV di picco diastolico al flusso massimo e CFV di picco diastolico al basale18,19,20 (Tabella 2):
      CFR = picco diastolico CFV (2,5%) / picco diastolico CFV (1,5%)

3. Monitoraggio e cura degli animali post-imaging

  1. Dopo aver completato l'imaging ecocardiografico, pulire accuratamente il cucciolo e lasciarlo riprendersi dall'anestesia per circa 2 minuti.
  2. Prima di riportare il cucciolo nella sua gabbia, spalmare il cucciolo con la lettiera della madre della gabbia per evitare il rifiuto o la cannibalizzazione.
  3. Osservare il comportamento della madre per circa 30 minuti dopo la procedura. Se si osserva un comportamento aggressivo, eutanasia il cucciolo seguendo le linee guida sulla procedura animale.

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Risultati

Questo studio ha utilizzato cuccioli di topo di 7 giorni per caratterizzare la morfologia cardiaca, la funzione e il flusso coronarico. La manipolazione del mouse deve essere eseguita con cura e la piattaforma del mouse deve essere adattata alle piccole dimensioni dei cuccioli, come descritto nella Figura 1. Un'immagine rappresentativa della vista PLAX è mostrata nella Figura 2A e nel Video supplementare 1. In questa vista, M-mode è stato util...

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Discussione

Nell'era della medicina preventiva, è necessaria una valutazione precoce delle alterazioni della funzione cardiovascolare per stabilire l'insorgenza della malattia e progettare terapie interventistiche appropriate. I topi vengono sempre più utilizzati come modelli preclinici nella ricerca cardiaca e gli studi ecocardiografici sono tipicamente condotti con topi giovani adulti. Tuttavia, per studiare il ruolo delle alterazioni genetiche o degli interventi farmacologici nelle prime fasi delle malattie cardiache, l'imaging...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Chad M. Warren, MS (Università dell'Illinois a Chicago), per aver curato questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH / NHLBI K01HL155241 e AHA CDA849387 alla PCR.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Depilating agentNair Hair Remover
Electrode gelParker Laboratories15-60
High Frequency UltrasoundFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100
IsofluraneMedVetRXISO-250
Linear array high frequency transducerFUJIFILM VisualSonics, Inc.MS550D
Mice breeding pairCharles River LaboratoriesFVB/NStrain Code 207
Ultrasound GelParker Laboratories11-08
Vevo Lab SoftwareFUJIFILM VisualSonics, Inc.Verison 5.5.1

Riferimenti

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