低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達

要約

低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いて、H9ヒト胚性幹細胞(hESC)およびH9由来神経前駆細胞(NPC)においてshRNAを安定的に発現させるレンチウイルス粒子を高効率で製造しました。

要約

現在のプロトコルは、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびhESCに由来する神経前駆細胞(NPC)の両方に短いヘアピンRNA(shRNA)を高効率で送達するためのレンチウイルス粒子の使用を記載している。レンチウイルス粒子は、低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を使用してパッケージングプラスミド(pAXおよびpMD2.G)とともに、エントリーベクター(shRNAを担持)を使用してHEK293T細胞を同時トランスフェクトすることによって生成されました。ウイルス粒子を超遠心分離を用いて濃縮し、平均力価が5 x¹⁰⁷を超える結果となった。hESCsおよびNPCsは、ピューロマイシン選択およびhESCにおける安定発現、ならびにNPCにおける一過性GFP発現によって示されるように、これらのレンチウイルス粒子を使用して高効率で感染することができる。さらに、ウェスタンブロット解析は、shRNAによって標的とされる遺伝子の発現の有意な減少を示した。さらに、細胞は、CNSの異なる系統へのその後の分化によって証明されるように、それらの多能性ならびに分化能を保持した。現在のプロトコルはshRNAの送達を扱っている。しかし、過剰発現研究のためのcDNAの異所性発現にも同じアプローチが使用できる。

概要

胚盤胞内部細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(hESC)は多能性であり、in vitro条件下で外的要因に応じて異なる細胞型に分化することができる^1,2。hESCの可能性を最大限に引き出すためには、これらの細胞に対して迅速かつ信頼性の高い遺伝子送達方法が不可欠です。従来、使用される技術は、大きく2つのタイプに分類することができる:非ウイルスおよびウイルス遺伝子送達系^3、4。より頻繁に使用される非ウイルス遺伝子送達系は、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオフェクションである。非ウイルス送達系は、挿入変異が少なく、免疫原性の全体的な低下のために有利である^5,6。しかしながら、これらの方法は、低いトランスフェクション効率および短い一過性遺伝子発現の持続時間をもたらし、これは長期分化研究のための主要な制限である⁷。エレクトロポレーションは、リポフェクションと比較してより良いトランスフェクション効率をもたらす。しかしながら、^それは50%以上の細胞死をもたらす8、^9、10。ヌクレオフェクションを使用すると、リポフェクションとエレクトロポレーションを組み合わせることで細胞の生存率とトランスフェクション効率を向上させることができますが、このアプローチには細胞固有のバッファーと特殊な機器が必要であり、したがって、スケールアップされたアプリケーションにとっては非常にコストがかかります^11,12。

対照的に、ウイルスベクターは、形質導入後、改善されたトランスフェクション効率、ならびに全体的な低い細胞毒性を示している。さらに、送達された遺伝子は安定に発現しているため、この方法は長期的な研究に理想的^です13。hESCへの遺伝子送達に最も一般的に使用されるウイルスベクターの中には、レンチウイルスベクター(LVS)があり、これは高力価のウイルス粒子^14、15を使用して80%以上の形質導入効率を与えることができる。リポフェクションおよび_CaPO4 沈殿は、HEK293T細胞またはその誘導体をパッケージングプラスミドとともに遺伝子導入ベクターで一過性にトランスフェクトしてレンチウイルス粒子を作製するために最も一般的に使用される方法の^{1つである16}。リポフェクションは良好なトランスフェクション効率と低い細胞毒性をもたらすが、この技術はそのコストによって妨げられており、高力価のレンチウイルス粒子を得るためにスケールアップすることは非常にコストがかかるであろう。_CaPO4 沈殿は、リポフェクションを用いて得られたものと比較的類似したトランスフェクション効率をもたらす。費用対効果は高いものの、_CaPO4 沈殿はトランスフェクション後に著しい細胞死をもたらし、標準化を困難にし、バッチ間の変動を回避することを困難にしています¹⁷。このシナリオでは、高いトランスフェクション効率、低い細胞毒性、および費用対効果を提供する方法を開発することは、hESCに使用される高力価レンチウイルス粒子の製造にとって極めて重要である。

ポリエチレンイミン(PEI)は、細胞毒性をあまり持たずに高効率でHEK293T細胞をトランスフェクトできるカチオン性ポリマーであり、リポフェクションベースの方法と比較して無視できるコストを有する¹⁸。このような状況では、PEIは、様々な技術を用いて培養上清からのレンチウイルス粒子の濃縮を通じて、高力価LVS産生のスケールアップされた用途に使用することができる。提示された論文では、PEIを使用してHEK293T細胞をトランスフェクトし、スクロースクッションを介して超遠心分離を使用してレンチウイルスベクター濃度をトランスフェクトする方法について説明します。この方法を使用して、バッチ間の変動が少ない5 x¹⁰⁷ IU/mLをはるかに超える力価を定期的に取得します。この方法は、hESCおよびhESC由来細胞への遺伝子送達のためのスケールアップされたアプリケーションに対して、シンプルで簡単で費用対効果が高い。

プロトコル

1. PEIまたはリポフェクタミン3000試薬のいずれかを使用したHEK293T細胞のトランスフェクション

1. HEK293T細胞をDMEM + 10% FBS + 1xペニシリン/ストレプトマイシン中で、5%CO2および_21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで培養し、トランスフェクションのために播種する前に90%コンフルエン_{トになるまで培養} します。高力価ウイルス産生には比較的低い継代細胞数を使用する(理想的にはP30未満)。
2. 種子4 x¹⁰⁶ 細胞を100mm組織培養プレート中の10mLの完全な増殖培地中で、5%CO2および_21%O2 の雰囲気を有する加湿組織培養インキュベーター中で一晩増殖させる_。
3. トランスフェクションごとに、プラスミドDNA(1 mg/mLストック)を1.5 mL遠沈管内の無血清DMEM培地1 mLに希釈し、以下の比率のエントリープラスミドとパッケージングプラスミドを使用します。
   エントリベクトル = 10 μg
   psPAX2.0 = 7.5 μg
   pMD2.G = 5 μg
4. 渦を10秒間、チューブを10,000 x gで回転させ、室温で30秒間回転させて収集します。
5. チューブに70 μL(1 mg/mLのストック溶液)のPEIを加え、上記のようにボルテックスとスピンを短時間かけて回収します。使用されるPEIの体積は、全DNA(μg):P EI(μg)の1:3の比率に基づいています。
6. リポフェクタミンベースのトランスフェクションの場合、キットに供給された45 μLの試薬Pを含む500 μLの無血清DMEM培地に上記のベクターを希釈し、室温で5分間インキュベートします。
7. キットに供給された試薬Lの70 μLを500 μLの無血清DMEM培地を用いて希釈し、室温で5分間インキュベートする。
8. 両方のチューブの内容物を結合し、複合体形成を可能にするために室温で20分間チューブをインキュベートする。
9. 細胞を含むプレートにDNA/PEI1mLまたはDNA/リポフェクタミン複合体1mLを滴下し、5%CO2および_21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで6時間インキュベートする_。
10. 6時間後、新鮮な完全増殖培地(10mL)に交換し、細胞を5%CO2および_21%O2 の雰囲気で加湿したインキュベーターに戻す_。

2. LVS収集と超遠心分離

1. トランスフェクションの2日後、ウイルス含有培地を収集し、10mLの新鮮な完全増殖培地で細胞を再びオーバーレイする。
2. トランスフェクションの3日後、ウイルス含有培地を収集し、2日の時点で収集されたウイルス含有培地と組み合わせる。
3. ウイルス上清を2,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化する。
4. 0.45 μmの孔径の低いタンパク質結合フィルター(PESまたはSFCAのいずれか)を使用して上清をろ過し、超遠心分離の準備ができるまで4°Cで保存します。レンチウイルス粒子を含む濾過された上清は、ウイルス力価を有意に低下させることなく、4°Cで5日間保存することができる。
5. カップを保持する超遠心管を70%エタノールで10分間洗浄して滅菌し、風乾、閉じ、4°Cに保ちます。
6. レンチウイルス粒子を含む濾過培地36mLを滅菌超遠心チューブに加える。
7. 滅菌ストリペット5 mLを滅菌20%スクロース溶液(PBSで調製)4 mLで満たし、LVSを含む超遠心管(UC)の底部に直接分注します。スクロース溶液が媒体と混合されず、チューブの底に勾配を作ることが重要です。
8. 無血清DMEM培地を使用してすべての超遠心チューブのバランスを取り、冷たい超遠心チューブ保持カップに入れ、蓋を閉めます。
9. チューブを125,000 x gで4°Cで2時間回転させます。
10. スピン後、ペレットを乱すことなく漂白剤を入れた容器にチューブの内容物を反転させて上清を慎重に捨てる。ペレットが表示されている場合はマークを付けます。
11. 超遠心チューブを50 mL滅菌チューブに入れ、ペレットの上部に200 μLの滅菌DPBSを正確に加えます。4°Cで一晩邪魔されずに保管してください。
12. 翌日、上下40倍のピペッティングで穏やかに混ぜる。
13. 卓上遠心分離機で13,000 x gで短時間回転させ、破片をペレット化します。
14. 上清を新しいチューブに移し、ウイルス調製物を20 μLアリコートとしてアリコートします。-80°Cで保存してください。
15. ウイルス力価測定のために5μLの調製物を脇に置いておきます。

3. pLKO.1ベースのベクターのLVS力価測定

1. レンチウイルス粒子の力価は、製造元の推奨に従ってqPCRを使用して決定します。
2. 標準曲線の場合、各ステップで5 μLのDNAを45 μLのヌクレアーゼ_フリーH2Oに希釈することによって、標準対照DNA(キットに付属)の5つの10倍段階希釈液を調製する。標準曲線を生成するには、1:100 ~ 1:100,000 の希釈を使用します。
3. 氷上での反応を次のように重複して設定します。
   2x qPCR マスターミックス 10 μL
   プライマーミックス 2 μL
   サンプルまたは標準 DNA 2 μL
   ヌクレアーゼフリーH2O6μL
4. キットのマニュアルに記載されているサイクリング条件を使用して、合計 35 サイクルで qPCR を実行します。
5. サイクルしきい値 (Ct) 値を Y 軸にプロットし、ウイルス力価を X 軸にプロットします。
6. 4 つの標準対照 DNA 希釈液 (1:100 ~ 1:100,000) を使用して対数回帰を生成し、トレンドライン方程式を使用して未知のウイルスサンプル力価を決定します。

4. pll3.7ベースのベクターのLVS力価測定

1. 感染の24時間前に、P12ウェルプレートの各ウェル中の種子1 x¹⁰⁵ 個のHEK293T細胞を1mLの完全な増殖培地に入れた。
2. 培地に8 μg/mLのポリブレンを加え、滅菌した各1.5 mLチューブに1 mLを加えます。
3. 4 μL、2 μL、1 μL、0.5 μL、および 0.1 μL の濃縮レンチウイルス粒子をそれぞれ 1 mL のポリブレン含有培地中で使用して、ウイルス粒子を希釈します。
4. HEK293T細胞由来の培地を、8μg/mLのポリブレンとともに指示量のレンチウイルス粒子を含む培地と交換し、5%CO2および21_%O2の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで₂₄時間インキュベートする。
5. 翌日、新鮮な培地に変更し、5%CO2および21%O2の雰囲気を有する加湿インキュベーター内で37°Cで₇₂時間培養を続けた。
6. 72時間後、細胞をPBSで洗浄し、製造業者のプロトコールに従って37°Cでトリプシン処理し、1mLのPBSに再懸濁した。
7. メーカーの推奨に従って、セルソーターを使用してFACSセルソーティングを実行します。非感染HEK293T細胞を用いてゲートを0%GFP陽性細胞に設定し、各サンプルについて50,000イベントをカウントして、各ウイルス希釈に対する陽性細胞の割合を決定する。
8. レンチウイルス粒子の力価を計算するには、%GFP陽性細胞を2%〜20%の範囲で与えるレンチウイルス粒子の体積のみを使用します。

5. hESCの感染と安定した選択

1. 6ウェル細胞培養マルチウェルプレートの各ウェルで増殖する2mLのPBSで細胞を洗浄する。
2. 1mLの1x細胞解離試薬を用いて細胞培養プレートから細胞を剥離し、37°Cで5分間インキュベートした。
3. DMEM/F12培地で細胞を回収し、室温で1,500 x gで5分間遠心分離して細胞ペレットを回収します。
4. 吸引し、細胞を1mLに再懸濁し、血球計数器を用いて計数した。
5. 10 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)、ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)、および 10 μM ROCK 阻害剤 (RI) を添加した mTeSR1 を含む 2 x¹⁰⁵ cells/mL の完全な増殖培地で細胞懸濁液を作ります。
6. 種子1 x 105個の細胞を^50x 完全基底膜マトリックスコーティングP24ウェルプレート上で500μLの完全増殖培地で希釈し、5%CO2および_21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター中で37°Cで細胞を培養した_。
7. 翌日、hESCを感染多重度(MOI)10で8μg/mLのポリブレンで感染させ、37°Cで8時間インキュベートする。
8. 8時間後、ウイルス含有培地を新鮮な増殖培地(-RI)と交換し、細胞が90%コンフルエントになるまで培養を続けます。
9. ピューロマイシンの選択(0.8 μg/mL)は、細胞が90%のコンフルエント(通常、感染後48〜72時間)に達したときに開始します。
10. 選択が完了したら(通常4〜6日)、安定細胞を分割し(1:4)、凍結保存およびさらなる分析のために細胞を拡張する。

6. H9由来神経前駆細胞(NPC)の形質導入

注:NPCは、前述のように、デュアルSmad阻害プロトコルを使用してH9細胞から誘導された¹⁹。

1. 簡単に説明すると、H9細胞を37°Cで5分間細胞解離試薬で処理して単一細胞を生成し、10ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、および10μM ROCK阻害剤(RI)を添加したmTeSR1を含む完全な増殖培地に再懸濁します。60,000細胞/^cm2 の密度で1:50希釈したマトリゲルコーティング6ウェル細胞培養皿上の種子(0日目)。
2. LDN193189(200 nM)およびSB431542(10 μM)を含む100%KSR培地に変更することにより、細胞が95%-100%コンフルエントに達したときに分化を開始します(day1)。
3. 2日目に、LDN193189(200 nM)、SB431542(10 μM)、およびXAV939(5 μM)を添加した100%KSRでメディアを再度交換します。
4. 分化の4日目に、LDN193189(200nM)、SB431542(10μM)、およびXAV939(5μM)を有するKSR培地(75%)およびN2培地(25%)の混合物に切り替える。
5. 6日目から12日目まで、N2培地を毎日25%増やし、2日ごとに培地を交換することにより、LDN193189(200nM)、SB431542(10μM)、およびXAV939(5μM)を添加した100%N2に培地を徐々に切り替えます。
6. 培養12日目のNPCは、20ng/mL bFGFを添加したN2:B27培地中で行った。
7. 2 mLのNPCs培養培地で1:50希釈した完全基底膜マトリックスコーティングP6プレートの各ウェルに2 x 105^個の細胞 をシードし、細胞が付着できるようにインキュベートする。
8. 翌日、8μg/mLポリブレンの存在下でMOI 6でレンチウイルス粒子で細胞を感染させる。
9. 8時間後、ウイルス含有培地を新鮮なNPC増殖培地と交換する。
10. 翌日、感染を繰り返し、8時間で培地を交換します。
11. さらなる分析のために回収する前に、細胞を72時間培養に保持する。

結果

遺伝子導入後、hESCの高い生存率が必然的に要求される。hESCのエレクトロポレーション後の細胞死を減らすためのプロトコルの努力と最適化にもかかわらず、これらの細胞のエレクトロポレーション後には50%以上の細胞死が依然として観察され、トランスフェクション効率は低い²⁰。レンチウイルス媒介遺伝子導入は、遺伝子導入の高効率をもたらすだけでなく、形質導入後...

ディスカッション

研究または臨床目的のために幹細胞を遺伝子改変する能力は、技術およびhESCの生物学の基本的な理解の両方によって制限される。リポフェクションやエレクトロポレーションなど、マウスESCにおいて大きな可能性を示している技術は、従来の方法では遺伝子送達が困難であることで悪名高いhESCにとって非常に効率的ではない²⁰。この概念は、既存の技術の最適化だけでなく...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10