Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Özet

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Özet

Mevcut protokol, kısa saç tokası RNA'larının (shRNA'lar) hem insan embriyonik kök hücrelerine (hESC'ler) hem de hESC'lerden türetilen nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) yüksek verimlilikte verilmesi için lentiviral parçacıkların kullanımını açıklamaktadır. Lentiviral parçacıklar, düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanılarak ambalaj plazmidleri (pAX ve pMD2.G) ile birlikte giriş vektörleri (shRNA'lar taşıyan) kullanılarak HEK293T hücrelerinin birlikte transfekte edilmesiyle üretildi. Viral parçacıklar ultrasantrifüjleme kullanılarak konsantre edildi, bu da ortalama titrelerin 5 x 10^7'nin üzerinde olmasına neden oldu. Hem hESC'ler hem de NPC'ler, püromisin seçimi ve hESC'lerde kararlı ekspresyonun yanı sıra NPC'lerde geçici GFP ekspresyonu ile gösterildiği gibi, bu lentiviral partiküller kullanılarak yüksek verimlilikte enfekte olabilir. Ayrıca, batı leke analizi, shRNA'lar tarafından hedeflenen genlerin ekspresyonunda önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Ek olarak, hücreler, CNS'nin farklı soylarına daha sonraki farklılaşmalarıyla kanıtlandığı gibi, pluripotensilerini ve farklılaşma potansiyellerini korudular. Mevcut protokol, shRNA'ların verilmesi ile ilgilidir; Bununla birlikte, aynı yaklaşım aşırı ekspresyon çalışmaları için cDNA'ların ektopik ekspresyonu için de kullanılabilir.

Giriş

Blastosist iç hücre kütlesinden türetilen insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) pluripotenttir ve in vitro koşullar altında dış etkenlere bağlı olarak farklı hücre tiplerine ayrılabilir ^1,2. hESC'lerin potansiyelini tam olarak kullanmak için, bu hücreler için hızlı ve güvenilir gen dağıtım yöntemlerine sahip olmak zorunludur. Geleneksel olarak, kullanılan teknikler genel olarak iki tipte sınıflandırılabilir: viral olmayan ve viral gen dağıtım sistemleri ^3,4. Daha sık kullanılan nonviral gen taşıyıcı sistemler lipofeksiyon, elektroporasyon ve nükleofeksiyondur. Nonviral dağıtım sistemleri, daha az yerleştirme mutasyonu ve immünojenisitedeki genel azalma nedeniyle avantajlıdır ^5,6. Bununla birlikte, bu yöntemler düşük transfeksiyon etkinliği ve kısa süreli geçici gen ekspresyonu ile sonuçlanır, bu da uzun süreli farklılaşma çalışmaları için önemli bir sınırlamadır⁷. Elektroporasyon, lipofeksiyona kıyasla daha iyi transfeksiyon verimliliği sağlar; ancak %50'den fazla hücre ölümü^ile sonuçlanır ^8,9,10. Nükleofeksiyon kullanılarak, lipofeksiyon ve elektroporasyon birleştirilerek hücre sağkalımı ve transfeksiyon verimliliği artırılabilir, ancak yaklaşım hücreye özgü tamponlara ve özel ekipmanlara ihtiyaç duyar ve bu nedenle ölçeklendirilmiş uygulamalar için oldukça maliyetli hale gelir^11,12.

Buna karşılık, viral vektörler, transdüksiyonu takiben transfeksiyon verimliliklerinin yanı sıra genel olarak düşük sitotoksisiteyi de göstermiştir. Ek olarak, verilen genler istikrarlı bir şekilde ifade edilir ve bu nedenle bu yöntemi uzun süreli çalışmalar için ideal kılar¹³. hESC'lere gen iletimi için en sık kullanılan viral vektörler arasında, yüksek titreli viral parçacıklar^14,15 kullanarak% 80'den fazla transdüksiyon verimliliği sağlayabilen lentiviral vektörler (LVS) bulunmaktadır. Lipofeksiyon ve CaPO₄ çökeltmesi, HEK293T hücrelerini veya türevlerini gen transfer vektörleri ile geçici olarak transfekte etmek için en yaygın kullanılan yöntemler arasındadır ve lentiviral parçacıklar üretmek için plazmidleri paketlemektedir¹⁶. Lipofeksiyon iyi transfeksiyon etkinliği ve düşük sitotoksisite ile sonuçlanmasına rağmen, teknik maliyeti nedeniyle engellenir ve yüksek titreli lentiviral parçacıklar elde etmek için ölçeklendirilmesi çok maliyetli olacaktır. CaPO₄ çökelmesi, lipofeksiyon kullanılarak elde edilenlere nispeten benzer transfeksiyon verimlilikleri ile sonuçlanır. Uygun maliyetli olmasına rağmen, CaPO₄ çökeltisi, transfeksiyonları takiben önemli hücre ölümü ile sonuçlanır, bu da standardizasyonu ve partiden partiye varyasyonlardan kaçınmayı zorlaştırır¹⁷. Bu senaryoda, yüksek transfeksiyon verimliliği, düşük sitotoksisite ve maliyet etkinliği sağlayan bir yöntem geliştirmek, hESC'lerde kullanılacak yüksek titreli lentiviral parçacıkların üretimi için çok önemlidir.

Polietilenimin (PEI), HEK293T hücrelerini fazla sitotoksisite olmadan yüksek verimlilikte transfekte edebilen ve lipofeksiyon bazlı yöntemlere kıyasla ihmal edilebilir bir maliyeti olan katyonik bir polimerdir¹⁸. Bu durumda, PEI, çeşitli teknikler kullanılarak kültür süpernatantlarından lentiviral parçacıkların konsantrasyonu yoluyla yüksek titreli LVS üretiminin ölçeklendirilmiş uygulamaları için kullanılabilir. Sunulan makalede, HEK293T hücrelerini ve lentiviral vektör konsantrasyonunu transfekte etmek için PEI'nin bir sakkaroz yastığı aracılığıyla ultrasantrifüjleme kullanılarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, düzenli olarak 5 x 10⁷ IU / mL'nin çok üzerinde, düşük partiden partiye varyasyonlara sahip titreler elde ediyoruz. Yöntem, hESC'lere ve hESC'lerden türetilmiş hücrelere gen iletimi için ölçeklendirilmiş uygulamalar için basit, basit ve uygun maliyetlidir.

Protokol

1. HEK293T hücrelerinin PEI veya Lipofectamine 3000 reaktifi kullanılarak transfeksiyonu

1. DMEM'deki kültür HEK293T hücreleri +% 10 FBS + 1x penisilin / streptomisin, transfeksiyon için tohumlamadan önce% 90 akıcıya kadar% 5 CO₂ ve% 21_{O2 atmosferine} sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de. Yüksek titreli virüs üretimi için nispeten düşük bir geçiş hücresi sayısı kullanın (ideal olarak P30'dan daha az).
2. 100 mm'lik bir doku kültürü plakasında 10 mL'lik tam büyüme ortamında tohum 4 x 10⁶ hücre ve % 5 CO 2 ve%_{21 O 2} atmosferine sahip nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca büyür_.
3. Her transfeksiyon için, plazmid DNA'sını (1 mg/mL stoklar) 1,5 mL santrifüj tüplerinde 1 mL serum içermeyen DMEM ortamında aşağıdaki giriş ve ambalaj plazmid oranını kullanarak seyreltin:
   Giriş vektörü = 10 μg
   psPAX2.0 = 7.5 μg
   pMD2.G = 5 μg
4. 10 s vorteks ve toplamak için oda sıcaklığında 30 s için tüpü 10.000 x g'da döndürün.
5. Tüpe 70 μL (1 mg / mL stok çözeltisi) PEI ekleyin ve toplamak için yukarıda açıklandığı gibi vorteks ve spin yapın. Kullanılan PEI hacmi, toplam DNA (μg):P EI (μg)'nin 1: 3 oranına dayanmaktadır.
6. Lipofektamin bazlı transfeksiyon için, yukarıdaki vektörleri, kitte verilen 45 μL reaktif P içeren 500 μL serumsuz DMEM ortamında seyreltin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
7. Kitte verilen 70 μL reaktif L'yi 500 μL serumsuz DMEM ortamı kullanarak seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
8. Her iki tüpün içeriğini birleştirin ve karmaşık formasyona izin vermek için tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
9. Hücreleri içeren plakaya damla damla 1 mL DNA / PEI veya 1 mL DNA / lipofectamin kompleksleri ekleyin ve% 5 CO 2 ve%_{21 O 2} atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 6 saat boyunca inkübe edin_.
10. 6 saat sonra, taze tam büyüme ortamına (10 mL) geçin ve hücreleri% 5 CO 2 ve%_{21 O 2} atmosferi ile nemlendirilmiş inkübatöre geri döndürün_.

2. LVS toplama ve ultrasantrifüjleme

1. Transfeksiyondan 2 gün sonra, virüs içeren ortamı toplayın ve hücreleri tekrar 10 mL taze tam büyüme ortamı ile kaplayın.
2. Transfeksiyondan 3 gün sonra, virüs içeren medyayı toplayın ve 2 günlük zaman noktasında toplanan virüs içeren medya ile birleştirin.
3. Viral süpernatantı 2.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca hücresel kalıntıları pelet etmek için santrifüj edin.
4. Süpernatantı 0,45 μm gözenek boyutunda düşük protein bağlayıcı filtre (PES veya SFCA) kullanarak filtreleyin ve ultrasantrifüjlemeye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. Lentiviral parçacıklar içeren filtrelenmiş süpernatant, viral titrelerde önemli bir kayıp olmadan 5 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
5. Bardakları tutan ultrasantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca% 70 etanol ile yıkayarak sterilize edin, hava kurutun, kapatın ve 4 ° C'de tutun.
6. Steril bir ultrasantrifüj tüpüne lentiviral parçacıklar içeren 36 mL filtrelenmiş ortam ekleyin.
7. 5 mL'lik steril bir stripeti 4 mL steril% 20 sakkaroz çözeltisi (PBS'de hazırlanmış) ile doldurun ve LVS içeren ultrasantrifüj tüpünün (UC) dibine doğru dağıtın. Sakkaroz çözeltisinin medya ile karıştırılmaması ve tüpün dibinde bir gradyan yapması önemlidir.
8. Serumsuz DMEM ortamını kullanarak tüm ultrasantrifüj tüplerini dengeleyin, soğuk ultrasantrifüj tüp tutma kaplarına yerleştirin ve kapakları kapatın.
9. Tüpleri 4 °C'de 2 saat boyunca 125.000 x g'de döndürün.
10. Spinden sonra, peleti rahatsız etmeden tüpün içeriğini çamaşır suyu içeren bir kapta ters çevirerek süpernatantı dikkatlice atın. Görünürse peleti işaretleyin.
11. Ultra santrifüj tüpünü 50 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin ve peletin tam üstüne 200 μL steril DPBS ekleyin. Gece boyunca bozulmadan 4 ° C'de tutun.
12. Ertesi gün, 40x yukarı ve aşağı pipetle çekerek yavaşça karıştırın.
13. Herhangi bir enkazı peletlemek için bir masa üstü santrifüjünde kısaca 13.000 x g'de döndürün.
14. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve virüs preparatını 20 μL alikot olarak alikot edin. −80 °C'de saklayın.
15. Viral titre ölçümleri için preparatın 5 μL'sini bir kenara koyun.

3. pLKO.1 tabanlı vektörler için LVS titre ölçümü

1. Üreticinin tavsiyelerini izleyerek bir qPCR kullanarak lentiviral parçacıkların titresini belirleyin.
2. Standart bir eğri için, her adımda 5 μL DNA'yı 45 μL nükleaz içermeyen_H2O'ya seyrelterek Standart Kontrol DNA'sının (kit içinde sağlanan) beş adet 10 katlı seri seyreltmesini hazırlayın. Standart bir eğri oluşturmak için 1:100 ila 1:100.000 arasındaki seyreltmeleri kullanın.
3. Buz üzerindeki reaksiyonları aşağıdaki şekilde kopyalar halinde ayarlayın:
   2x qPCR ana karışımı 10 μL
   Astar karışımı 2 μL
   Örnek veya standart DNA 2 μL
   Nükleaz içermeyen H₂O 6 μL
4. Kitin kılavuzunda belirtilen bisiklet koşullarını kullanarak toplam 35 döngü için qPCR gerçekleştirin.
5. Y eksenindeki döngü eşiği (Ct) değerleri ile X eksenindeki virüs titresi değerlerini çizin.
6. Bir eğilim çizgisi denklemi kullanarak bilinmeyen virüs numune titresini belirlemek için dört standart kontrol DNA seyreltmesi (1:100 ila 1:100.000) kullanarak logaritmik bir regresyon oluşturun.

4. pll3.7 tabanlı vektörler için LVS titre ölçümü

1. Tohum 1 x 10⁵ HEK293T hücreleri, enfeksiyonlardan 24 saat önce 1 mL tam büyüme ortamında bir P12 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğunda.
2. Ortamı 8 μg / mL polibren ile destekleyin ve her steril 1,5 mL tüpe 1 mL ekleyin.
3. 1 mL polibren içeren ortamın her birinde 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0.5 μL ve 0.1 μL konsantre lentiviral partiküller kullanarak viral parçacıkları seyreltin.
4. HEK293T hücrelerinden gelen ortamı, 8 μg / mL polibren ile birlikte belirtilen miktarda lentiviral partikül içeren ortamla değiştirin ve% 5 CO 2 ve% 21_O2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de₂₄ saat boyunca inkübe edin.
5. Ertesi gün, taze medyaya geçin ve kültürü% 5 CO 2 ve% 21_{O 2} atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 72 saat boyunca devam edin.
6. 72 saat sonra, hücreleri PBS ile yıkayın, üreticinin protokolüne göre 37 ° C'de tripsinize edin ve 1 mL PBS'de yeniden askıya alın.
7. Üreticinin önerilerini izleyerek bir hücre sıralayıcı kullanarak FACS hücre sıralama gerçekleştirin. Enfekte olmayan HEK293T hücrelerini kullanarak kapıyı% 0 GFP pozitif hücrelere ayarlayın ve her viral seyreltme için pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek üzere her örnek için 50.000 olay sayın.
8. Lentiviral parçacıkların titresini hesaplamak için sadece% 2-20 aralığında% GFP pozitif hücreler veren lentiviral parçacıkların hacimlerini kullanın.

5. hESC'lerin enfeksiyonu ve stabil seçim

1. Hücreleri, 6 delikli hücre kültürü çok kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunda büyüyen 2 mL PBS ile yıkayın.
2. 1 mL 1x hücre ayrışma reaktifi kullanarak hücreleri hücre kültürü plakasından 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübasyonla ayırın.
3. DMEM / F12 ortamındaki hücreleri toplayın ve hücre peletini toplamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın.
4. Aspirat, hücreleri 1 mL'de yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak sayın.
5. 10 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), penisilin / streptomisin (P / S) ve 10 μM ROCK İnhibitörü (RI) ile desteklenmiş mTeSR1 içeren 2 x 10⁵ hücre / mL tam büyüme ortamı içeren bir hücre süspansiyonu yapın.
6. Tohum 1 x 10⁵ hücreler üzerinde 50x seyreltilmiş komple bazal membran matris kaplı P24-kuyucuk plakaları üzerinde 500 μL komple büyüme ortamı ve kültüründe hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 CO 2 ve %_{21 O 2 atmosferine} sahip bir inkübatörde kültürleyin_.
7. Ertesi gün, hESC'leri 8 μg / mL polibren ile 10 enfeksiyon çokluğunda (MOI) enfekte edin ve 8 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
8. 8 saat sonra, virüs içeren ortamı taze büyüme ortamı (-RI) ile değiştirin ve hücreler% 90 birleşene kadar kültüre devam edin.
9. Püromisin seçimine (0.8 μg / mL) hücreler% 90 akıcılığa ulaştığında başlayın, bu genellikle enfeksiyondan 48-72 saat sonradır.
10. Seçim tamamlandıktan sonra (genellikle 4-6 gün), kararlı hücreleri bölün (1: 4) ve kriyoprezervasyon ve daha fazla analiz için hücreleri genişletin.

6. H9 türevi nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) transdüksiyonu

NOT: NPC'ler, daha önce açıklandığı gibi bir dual-Smad inhibisyon protokolü kullanılarak H9 hücrelerinden türetilmiştir¹⁹.

1. Kısaca, H9 hücrelerini, tek hücreler üretmek için 37 ° C'de hücre ayrışma reaktifi ile 5 dakika boyunca tedavi edin ve 10 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), penisilin / streptomisin (P / S) ve 10 μM ROCK İnhibitörü (RI) ile desteklenmiş mTeSR1 içeren tam büyüme ortamında resüspend. 1:50 üzerinde tohum seyreltilmiş Matrigel kaplı 6 kuyucuklu hücre kültürü tabakları 60.000 hücre /^cm2 yoğunluğunda (gün 0).
2. LDN193189 (200 nM) ve SB431542 (10 μM) (gün1) içeren %100 KSR ortamına geçerek hücreler %95-%100 akıcılığa ulaştığında farklılaşmayı başlatın.
3. 2. günde, LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) ve XAV939 (5 μM) ile desteklenen %100 KSR ile ortamı tekrar değiştirin.
4. Farklılaşmanın 4. gününde, LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) ve XAV939 (5 μM) ile KSR ortamı (%75) ve N2 ortamı (%25) karışımına geçin.
5. 6. günden 12. güne kadar, N2 ortamını her gün %25 artırarak ve her 2 günde bir medyayı değiştirerek LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) ve XAV939 (5 μM) ile desteklenmiş ortamları kademeli olarak %100 N2'ye geçirin.
6. Kültür günü N2: B27 ortamındaki NPC'ler 20 ng / mL bFGF ile desteklenmiştir.
7. Tohum 2 x 10⁵ hücrenin her bir kuyucuğunda 1:50 seyreltilmiş komple bazal membran matris kaplı P6 plakası içinde 2 mL NPC kültür ortamı ve hücrelerin bağlanmasını sağlamak için inkübe edilir.
8. Ertesi gün, hücreleri 8 μg / mL polibren varlığında bir MOI 6'da lentiviral parçacıklarla enfekte edin.
9. 8 saat sonra, virüs içeren ortamı taze NPC büyüme ortamıyla değiştirin.
10. Ertesi gün, enfeksiyonları tekrarlayın ve medyayı 8 saatte değiştirin.
11. Daha fazla analiz için hasat etmeden önce hücreleri 72 saat kültürde tutun.

Sonuçlar

Gen transferini takiben, hESC'lerin yüksek canlılığı kaçınılmaz olarak gereklidir. hESC'lerin elektroporasyonunu takiben hücre ölümünü azaltmak için protokollerin çabalarına ve optimizasyonuna rağmen, bu hücrelerin elektroporasyonundan sonra% 50'den fazla hücre ölümü ve düşük transfeksiyon verimliliği²⁰ ile birlikte gözlenmektedir. Lentiviral aracılı gen transferi sadece gen transferinin yüksek verimliliği ile sonuçlanmakla kalmaz, aynı zamanda transdüksiyonu taki...

Tartışmalar

Kök hücreleri çalışma veya klinik amaçlar için genetik olarak değiştirme yeteneği, hem teknoloji hem de hESC'lerin biyolojisinin temel anlayışı ile sınırlıdır. Lipofeksiyon ve elektroporasyon gibi fare ESC'lerinde önemli potansiyel gösteren teknikler, geleneksel yöntemlerle gen iletimi için oldukça zor olan hESC'ler için oldukça verimli değildir²⁰. Bu kavram sadece mevcut tekniklerin optimizasyonuna değil, aynı zamanda hESC'lerde transfeksiyon verimliliğinin arttırılm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10