Лентивирусная опосредованная доставка шРНК в гЭСК и NPC с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI)

Резюме

Используя недорогой катионный полимер полиэтиленимин (PEI), мы произвели лентивирусные частицы для стабильной экспрессии шРНК в эмбриональных стволовых клетках человека H9 (hESCs) и транзиторно трансдуцированных нейронных клетках-предшественниках H9 (NPC) с высокой эффективностью.

Аннотация

Текущий протокол описывает использование лентивирусных частиц для доставки коротких шпильковых РНК (шРНК) как к эмбриональным стволовым клеткам человека (hESCs), так и к нейронным клеткам-предшественникам (NPC), полученным из hESCs с высокой эффективностью. Лентивирусные частицы генерировали путем котрансфекции клеток HEK293T с использованием входных векторов (несущих шРНК) вместе с упаковочными плазмидами (pAX и pMD2.G) с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI). Вирусные частицы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования, что приводило к средним титрам выше 5 х 10⁷. Как hESCs, так и NPC могут быть инфицированы с высокой эффективностью с использованием этих лентивирусных частиц, как показано отбором пуромицина и стабильной экспрессией в hESCs, а также транзиторной экспрессией GFP в NPC. Кроме того, анализ вестерн-блот показал значительное снижение экспрессии генов, нацеленных на шРНК. Кроме того, клетки сохраняли свою плюрипотентность, а также дифференцировочный потенциал, о чем свидетельствует их последующая дифференцировка в различные линии ЦНС. Действующий протокол касается доставки шРНК; однако тот же подход может быть использован для эктопической экспрессии кДНК для исследований гиперэкспрессии.

Введение

Эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs), полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются плюрипотентными и могут быть дифференцированы в различные типы клеток в зависимости от внешних факторов в условиях in vitro ^1,2. Чтобы в полной мере использовать потенциал hESCs, необходимо иметь быстрые и надежные методы доставки генов для этих клеток. Условно используемые методы можно в широком смысле классифицировать на два типа: невирусные и вирусные системы доставки генов ^3,4. Наиболее часто используемыми невирусными системами доставки генов являются липофекция, электропорация и нуклеофекция. Невирусные системы доставки являются выгодными из-за меньшего количества мутаций вставки и общего снижения иммуногенности ^5,6. Однако эти методы приводят к низкой эффективности трансфекции и короткой продолжительности экспрессии транзиторных генов, что является основным ограничением для долгосрочных исследований дифференцировки⁷. Электропорация приводит к лучшей эффективности трансфекции по сравнению с липофекцией; однако это приводит к гибели более 50% клеток ^8,9,10. Используя нуклеофекцию, выживаемость клеток и эффективность трансфекции могут быть улучшены путем сочетания липофекции и электропорации, но подход требует клеточных буферов и специализированного оборудования и, таким образом, становится довольно дорогостоящим для масштабируемых приложений^11,12.

Напротив, вирусные векторы показали улучшенную эффективность трансфекции, а также общую низкую цитотоксичность после трансдукции. Кроме того, доставленные гены стабильно экспрессируются и, следовательно, делают этот метод идеальным для долгосрочных исследований¹³. Среди наиболее часто используемых вирусных векторов для доставки генов в hESCs - лентивирусные векторы (LVS), которые могут дать более 80% эффективности трансдукции с использованием высоких титров вирусных частиц^14,15. Липофекция и осаждение CaPO₄ являются одними из наиболее часто используемых методов временной трансфекции клеток HEK293T или их производных с помощью векторов переноса генов вместе с упаковкой плазмид для получения лентивирусных частиц¹⁶. Хотя липофекция приводит к хорошей эффективности трансфекции и низкой цитотоксичности, методу препятствует его стоимость, и масштабирование для получения высоких титров лентивирусных частиц было бы очень дорогостоящим. Осаждение CaPO₄ приводит к относительно сходной эффективности трансфекции с теми, которые получены с помощью липофекции. Несмотря на рентабельность, осаждение CaPO₄ приводит к значительной гибели клеток после трансфекции, что затрудняет стандартизацию и позволяет избежать вариаций от партии к партии¹⁷. В этом сценарии разработка метода, который дает высокую эффективность трансфекции, низкую цитотоксичность и экономическую эффективность, имеет решающее значение для производства высокотитерных лентивирусных частиц, которые будут использоваться в гЭСК.

Полиэтиленимин (PEI) представляет собой катионный полимер, который может трансфектировать клетки HEK293T с высокой эффективностью без особой цитотоксичности и имеет незначительную стоимость по сравнению с методами¹⁸ на основе липофекции. В этой ситуации PEI может быть использован для расширенного применения производства LVS с высоким титром за счет концентрации лентивирусных частиц из супернатантов культуры с использованием различных методов. В представленной статье описано применение PEI для трансфекции клеток HEK293T и концентрации лентивирусных векторов с использованием ультрацентрифугирования через сахарозную подушку. Используя этот метод, мы регулярно получаем титры значительно выше 5 x 10⁷ МЕ/мл с низкими вариациями от партии к партии. Метод прост, прост и экономически эффективен для масштабируемых приложений для доставки генов в гЭСК и клетки, полученные из гЭСК.

протокол

1. Трансфекция клеток HEK293T с использованием реагента PEI или Lipofectamine 3000

1. Культивирование клеток HEK293T в DMEM + 10% FBS + 1x пенициллин/стрептомицин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO₂ и 21% O₂ до тех пор, пока они не станут 90% сливающимися перед посевом для трансфекции. Используйте относительно низкое количество прохождения клеток для производства вируса с высоким титром (в идеале менее P30).
2. Семена 4 х 10⁶ клеток в 10 мл полной питательной среды в 100 мм тканевой культуральной пластине и растут в течение ночи в инкубаторе культуры увлажненной ткани с атмосферой 5% CO₂ и 21% O_2.
3. Для каждой трансфекции разбавляют плазмидную ДНК (запасы 1 мг/мл) в 1 мл свободной от сыворотки среды DMEM в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл, используя следующее соотношение плазмид входа и упаковки:
   Входной вектор = 10 мкг
   psPAX2.0 = 7.5 мкг
   pMD2.G = 5 мкг
4. Вихрь в течение 10 с и вращение трубки при 10 000 х г в течение 30 с при комнатной температуре для сбора.
5. Добавьте 70 мкл (1 мг/мл стокового раствора) PEI в трубку, а затем кратковременно вращайте и вращайте, как описано выше, чтобы собрать. Объем используемого PEI основан на соотношении 1:3 общей ДНК (мкг) :P EI (мкг).
6. Для трансфекции на основе липофектамина разводят вышеуказанные векторы в 500 мкл бессывороточной DMEM-среды, содержащей 45 мкл реагента Р, поставляемого в комплекте, и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
7. Разбавить 70 мкл реагента L, поставляемого в комплекте, используя 500 мкл бессывороточной DMEM среды, и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
8. Соедините содержимое обоих трубок и инкубируйте трубки при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы обеспечить образование комплекса.
9. Добавьте по каплям 1 мл ДНК/PEI или 1 мл комплексов ДНК/липофектамина к пластине, содержащей клетки, и инкубируйте в течение 6 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO₂ и 21% O_2.
10. Через 6 ч переходят на свежие полные питательные среды (10 мл) и возвращают клетки обратно в увлажненный инкубатор с атмосферой 5% CO₂ и 21%_O2.

2. Сбор LVS и ультрацентрифугирование

1. После 2 дней трансфекции соберите вирусосодержащую среду и снова наложите на клетки 10 мл свежих полноценных питательных сред.
2. После 3 дней трансфекции соберите вирусосодержащую среду и объедините ее с вируссодержащей средой, собранной в 2-дневный момент времени.
3. Центрифугировать вирусный супернатант при 2000 х г в течение 10 мин при 4 °C в гранулированный клеточный мусор.
4. Фильтруйте супернатант с помощью фильтра с низким содержанием белка размером пор 0,45 мкм (PES или SFCA) и храните при 4 °C до готовности к ультрацентрифугированию. Фильтрованный супернатант, содержащий лентивирусные частицы, может храниться при 4 °C в течение 5 дней без значительной потери вирусных титров.
5. Стерилизуйте ультрацентрифужные трубки, удерживающие чашки, промыв их 70% этанолом в течение 10 минут, высушите на воздухе, закройте и держите при температуре 4 °C.
6. Добавьте 36 мл фильтрованного материала, содержащего лентивирусные частицы, в стерильную ультрацентрифужную трубку.
7. Заполните 5 мл стерильной полосы 4 мл стерильного 20% раствора сахарозы (приготовленного в PBS) и дозируйте его прямо на дно ультрацентрифужной трубки (UC), содержащей LVS. Важно, чтобы раствор сахарозы не смешивался со средой и делал градиент в нижней части трубки.
8. Сбалансируйте все ультрацентрифужные трубки с помощью бессывороточной среды DMEM, поместите в холодную ультрацентрифужную трубку, удерживающую чашки, и закройте крышки.
9. Вращайте трубки при 125 000 х г в течение 2 ч при 4 °C.
10. После отжима осторожно выбросьте супернатант, перевернув содержимое трубки в контейнер, содержащий отбеливатель, не нарушая гранулу. Отметьте гранулу, если она видна.
11. Поместите ультрацентрифужную трубку в стерильную трубку объемом 50 мл и добавьте 200 мкл стерильного DPBS точно в верхнюю часть гранулы. Хранить при температуре 4 °C в течение ночи без помех.
12. На следующий день аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз 40x.
13. Ненадолго вращайте при 13 000 х г в настольной центрифуге, чтобы гранулировать любой мусор.
14. Перенесите супернатант в новую трубку и аликвотируйте препарат вируса в виде 20 мкл аликвот. Хранить при температуре −80 °C.
15. Откладывают 5 мкл препарата для измерения титра вируса.

3. Измерение титра LVS для векторов на основе pLKO.1

1. Определите титр лентивирусных частиц с помощью qPCR в соответствии с рекомендациями производителя.
2. Для стандартной кривой подготовьте пять 10-кратных последовательных разведений стандартной контрольной ДНК (поставляемой в комплекте) путем разбавления 5 мкл ДНК в 45 мкл свободного от нуклеазы_H2Oна каждой стадии. Используйте разбавления от 1:100 до 1:100 000 для создания стандартной кривой.
3. Настраивайте реакции на льду в дубликатах следующим образом:
   2x qPCR мастер микс 10 мкл
   Грунтовочная смесь 2 мкл
   Образец или стандарт ДНК 2 мкл
   Не содержащий нуклеаз H₂O 6 мкл
4. Выполняйте qPCR с использованием условий цикла, указанных в руководстве по эксплуатации комплекта, в общей сложности 35 циклов.
5. Построение пороговых значений цикла (Ct) по оси Y и титру вируса по оси X.
6. Генерация логарифмической регрессии с использованием четырех стандартных контрольных разведений ДНК (от 1:100 до 1:100 000) для определения титра неизвестного образца вируса с использованием уравнения линии тренда.

4. Измерение титра LVS для векторов на основе pll3.7

1. Семена 1 х 10⁵ клеток HEK293T в каждой лунке P12-луночной пластины в 1 мл полной питательной среды за 24 ч до заражения.
2. Дополните среду полибреном 8 мкг/мл и добавьте 1 мл в каждую стерильную трубку объемом 1,5 мл.
3. Разбавляют вирусные частицы, используя 4 мкл, 2 мкл, 1 мкл, 0,5 мкл и 0,1 мкл концентрированных лентивирусных частиц в каждом из 1 мл полибреносодержащей среды.
4. Заменить среду из клеток HEK293T средой, содержащей указанные количества лентивирусных частиц вместе с полибреном 8 мкг/мл, и инкубировать в течение 24 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO₂ и 21% O₂.
5. На следующий день переходят на свежие носители и продолжают культивирование в течение 72 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO₂ и 21% O₂.
6. Через 72 ч промыть ячейки PBS, трипсинизировать при 37 °C по протоколу производителя и повторно использовать в 1 мл PBS.
7. Выполняйте сортировку ячеек FACS с помощью сортировщика ячеек в соответствии с рекомендациями производителя. Установите затвор на 0% положительных клеток GFP с использованием неинфицированных клеток HEK293T и подсчитайте 50 000 событий для каждого образца, чтобы определить процент положительных клеток для каждого вирусного разведения.
8. Используйте только объемы лентивирусных частиц, которые дают %GFP положительные клетки в диапазоне 2%-20% для расчета титра лентивирусных частиц.

5. Заражение гЭСК и стабильный отбор

1. Промыть клетки 2 мл PBS, растущих в каждой лунке многолуночной пластины клеточной культуры с 6 лунками.
2. Отсоедините клетки от пластины клеточной культуры с помощью 1 мл 1x клеточного диссоциационного реагента путем инкубации при 37 °C в течение 5 мин.
3. Соберите ячейки в среде DMEM/F12 и центрифуге при 1,500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для сбора гранулы ячейки.
4. Аспират, повторно суспендируют клетки в 1 мл, и подсчитывают с помощью гемоцитометра.
5. Сделать клеточную суспензию с 2 х 10⁵ клетками / мл полной питательной среды, содержащей mTeSR1, дополненную 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), пенициллина / стрептомицина (P / S) и ингибитора ROCK (RI) 10 мкМ (RI).
6. Семена 1 х 10⁵ клеток на 50x разбавлены полной базальной мембраной с матричным покрытием P24-луночных пластин в 500 мкл полной питательной среды и культивируют клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO₂ и 21% O_2.
7. На следующий день инфицируют гЭСК при кратности инфекции (MOI) 10 с полибреном 8 мкг/мл и инкубируют при 37 °C в течение 8 ч.
8. Через 8 ч замените вируссодержащую среду свежими питательными средами (-RI) и продолжайте культивирование до тех пор, пока клетки не сольются на 90%.
9. Начинают выделение пуромицина (0,8 мкг/мл), когда клетки достигают 90% конфлюентности, которая обычно составляет 48-72 ч после заражения.
10. После завершения отбора (обычно через 4-6 дней) расщепляют стабильные клетки (1:4) и расширяют клетки для криоконсервации и дальнейшего анализа.

6. Трансдукция нейронных клеток-предшественников H9 (NPC)

ПРИМЕЧАНИЕ: NPC были получены из клеток H9 с использованием протокола двойного ингибирования Smad, как описано ранее¹⁹.

1. Вкратце, обрабатывайте клетки H9 реагентом диссоциации клеток при 37 °C в течение 5 мин для получения одиночных клеток и повторного суспендирования в полной среде роста, содержащей mTeSR1, дополненную 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), пенициллина/стрептомицина (P/S) и ингибитора ROCK 10 мкМ (RI). Семена на 1:50 разбавляют покрытые Матригелем 6-луночные чашки для культивирования клеток при плотности 60 000 клеток/^см2 (день 0).
2. Инициируют дифференцировку, когда клетки достигают 95%-100% конфлюзии, изменяясь на 100% KSR среды, содержащие LDN193189 (200 нМ) и SB431542 (10 мкМ) (день1).
3. На 2-й день снова замените носитель 100% KSR, дополненным LDN193189 (200 нМ), SB431542 (10 мкМ) и XAV939 (5 мкМ).
4. На 4-й день дифференциации переключитесь на смесь среды KSR (75%) и среды N2 (25%) с LDN193189 (200 нМ), SB431542 (10 мкМ) и XAV939 (5 мкМ).
5. С 6-го по 12-й день постепенно переключайте носитель на 100% N2, дополненный LDN193189 (200 нМ), SB431542 (10 мкМ) и XAV939 (5 мкМ), увеличивая носитель N2 на 25% каждый день и меняя носитель через каждые 2 дня.
6. День культуры 12 NPC в среде N2:B27 дополнен 20 нг/мл bFGF.
7. Семена 2 х 10⁵ клеток в каждой лунке 1:50 разбавлены полной базальной мембраной с покрытием P6-пластины в 2 мл культуральной среды NPC и инкубируют, чтобы позволить клеткам прикрепляться.
8. На следующий день заражают клетки лентивирусными частицами при MOI 6 в присутствии полибрена 8 мкг/мл.
9. Через 8 ч заменить вирусосодержащую среду свежими средами роста NPC.
10. На следующий день повторите инфекции и смените среду через 8 ч.
11. Храните клетки в культуре в течение 72 ч перед сбором урожая для дальнейшего анализа.

Результаты

После переноса генов неизбежно требуется высокая жизнеспособность гЭСК. Несмотря на усилия и оптимизацию протоколов по снижению гибели клеток после электропорации гЭСК, более 50% гибели клеток все еще наблюдается после электропорации этих клеток, наряду с низкой эффективностью трансф...

Обсуждение

Способность генетически модифицировать стволовые клетки для изучения или клинических целей ограничена как технологией, так и базовым пониманием биологии hESCs. Методы, которые показали значительный потенциал в мышиных ЭСК, такие как липофекция и электропорация, не очень эффективны для ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10