Consegna mediata lentivirale di shRNA a hESC e NPC utilizzando polietilenimina polimerica cationica a basso costo (PEI)

Riepilogo

Utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimina (PEI), abbiamo prodotto particelle lentivirali per l'espressione stabile di shRNA in cellule staminali embrionali umane H9 (hESC) e cellule progenitrici neurali derivate da H9 trasdotte transitoriamente (NPC) ad alta efficienza.

Abstract

L'attuale protocollo descrive l'uso di particelle lentivirali per la somministrazione di RNA a forcina corta (shRNA) sia alle cellule staminali embrionali umane (hESC) che alle cellule progenitrici neurali (NPC) derivate da hESC ad alta efficienza. Le particelle lentivirali sono state generate co-trasfettando le cellule HEK293T utilizzando vettori di ingresso (che trasportano shRNA) insieme a plasmidi di imballaggio (pAX e pMD2.G) utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimmina (PEI). Le particelle virali sono state concentrate utilizzando l'ultracentrifugazione, che ha portato a titoli medi superiori a 5 x 10⁷. Sia le hESC che le NPC potrebbero essere infettate ad alta efficienza utilizzando queste particelle lentivirali, come dimostrato dalla selezione della puromicina e dall'espressione stabile nelle hESC, nonché dall'espressione transitoria della GFP nelle NPC. Inoltre, l'analisi western blot ha mostrato una significativa riduzione dell'espressione dei geni presi di mira dagli shRNA. Inoltre, le cellule hanno mantenuto la loro pluripotenza e il potenziale di differenziazione, come evidenziato dalla loro successiva differenziazione in diversi lignaggi del SNC. L'attuale protocollo si occupa della consegna di shRNA; tuttavia, lo stesso approccio potrebbe essere utilizzato per l'espressione ectopica dei cDNA per gli studi di sovraespressione.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali umane (hESC) derivate dalla massa cellulare interna della blastocisti sono pluripotenti e possono essere differenziate in diversi tipi di cellule a seconda di fattori esterni in condizioni in vitro ^1,2. Al fine di sfruttare appieno il potenziale delle hESC, è imperativo disporre di metodi di consegna genica rapidi e affidabili per queste cellule. Convenzionalmente, le tecniche utilizzate possono essere ampiamente classificate in due tipi: sistemi di consegna genica non virale e virale ^3,4. I sistemi di consegna genica non virale più frequentemente utilizzati sono la lipofezione, l'elettroporazione e la nucleofezione. I sistemi di somministrazione non virale sono vantaggiosi a causa del minor numero di mutazioni di inserzione e di una diminuzione complessiva dell'immunogenicità ^5,6. Tuttavia, questi metodi si traducono in una bassa efficienza di trasfezione e una breve durata dell'espressione genica transitoria, che è una delle principali limitazioni per gli studi di differenziazione a lungo termine⁷. L'elettroporazione si traduce in migliori efficienze di trasfezione rispetto alla lipofezione; tuttavia, si traduce in oltre il 50% di morte cellulare ^8,9,10. Utilizzando la nucleofezione, la sopravvivenza cellulare e l'efficienza della trasfezione possono essere migliorate combinando lipofezione ed elettroporazione, ma l'approccio richiede tamponi specifici per le cellule e attrezzature specializzate e, quindi, diventa piuttosto costoso per le applicazioni scaled-up^11,12.

Al contrario, i vettori virali hanno mostrato una migliore efficienza di trasfezione, così come una bassa citotossicità complessiva, dopo la trasduzione. Inoltre, i geni consegnati sono espressi stabilmente e, quindi, rendono questo metodo ideale per studi a lungo termine¹³. Tra i vettori virali più comunemente usati per la consegna genica nelle hESC ci sono i vettori lentivirali (LVS), che possono dare un'efficienza di trasduzione superiore all'80% utilizzando particelle virali ad alto titolo^14,15. La lipofezione e la precipitazione di CaPO₄ sono tra i metodi più comunemente usati per trasfettare transitoriamente le cellule HEK293T o i suoi derivati con vettori di trasferimento genico insieme a plasmidi di imballaggio per produrre particelle lentivirali¹⁶. Sebbene la lipofezione si traduca in una buona efficienza di trasfezione e bassa citotossicità, la tecnica è ostacolata dal suo costo e il ridimensionamento per ottenere particelle lentivirali ad alto titolo sarebbe molto costoso. La precipitazione di CaPO₄ si traduce in efficienze di trasfezione relativamente simili a quelle ottenute utilizzando la lipofezione. Sebbene economicamente vantaggiosa, la precipitazione di CaPO₄ provoca una significativa morte cellulare a seguito di trasfezioni, il che rende difficile standardizzare ed evitare variazioni da lotto a lotto¹⁷. In questo scenario, lo sviluppo di un metodo che dia un'elevata efficienza di trasfezione, bassa citotossicità ed economicità è fondamentale per la produzione di particelle lentivirali ad alto titolo da utilizzare nelle hESC.

La polietilenimina (PEI) è un polimero cationico in grado di trasfettare le cellule HEK293T ad alta efficienza senza molta citotossicità e ha un costo trascurabile rispetto ai metodi basati sulla lipofezione¹⁸. In questa situazione, PEI può essere utilizzato per applicazioni su larga scala di produzione di LVS ad alto titolo attraverso la concentrazione di particelle lentivirali da supernatanti di coltura utilizzando varie tecniche. L'articolo presentato descrive l'uso del PEI per trasfettare le cellule HEK293T e la concentrazione del vettore lentivirale utilizzando l'ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio. Usando questo metodo, otteniamo regolarmente titoli ben al di sopra di 5 x 10⁷ UI / mL con basse variazioni da lotto a lotto. Il metodo è semplice, diretto ed economico per applicazioni su larga scala per la consegna di geni a hESC e cellule derivate da hESC.

Protocollo

1. Trasfezione di cellule HEK293T utilizzando PEI o lipofectamine 3000 reagente

1. Coltiva cellule HEK293T in DMEM + 10% FBS + 1x penicillina/streptomicina a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera del 5% CO₂ e 21% O₂ fino a quando non sono confluenti al 90% prima della semina per la trasfezione. Utilizzare un numero di cellule di passaggio relativamente basso per un'elevata produzione di virus del titolo (idealmente inferiore a P30).
2. Semina 4 x 10⁶ cellule in 10 mL di terreno di coltura completo in una piastra di coltura tissutale da 100 mm e cresce durante la notte in un incubatore di colture tissutali umidificate con un'atmosfera del 5% di CO₂ e del 21% di O_2.
3. Per ogni trasfezione, diluire il DNA plasmidico (1 mg/mL di scorte) in 1 mL di mezzi DMEM privi di siero in tubi di centrifuga da 1,5 mL utilizzando il seguente rapporto tra plasmidi di entrata e confezionamento:
   Vettore di ingresso = 10 μg
   psPAX2.0 = 7,5 μg
   pMD2.G = 5 μg
4. Vortice per 10 s e rotazione del tubo a 10.000 x g per 30 s a temperatura ambiente da raccogliere.
5. Aggiungere 70 μL di PEI (1 mg/mL di soluzione madre) al tubo e ruotare e ruotare brevemente come descritto sopra per raccogliere. Il volume di PEI utilizzato si basa su un rapporto 1:3 di DNA totale (μg):P EI (μg).
6. Per la trasfezione a base di lipofectamine, diluire i vettori di cui sopra in 500 μL di mezzi DMEM privi di siero contenenti 45 μL di reagente P forniti nel kit e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
7. Diluire 70 μL di reagente L fornito nel kit utilizzando 500 μL di mezzo DMEM privo di siero e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
8. Combinare il contenuto di entrambi i tubi e incubare i tubi a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire la formazione di complessi.
9. Aggiungere 1 mL di DNA/PEI o 1 mL di complessi DNA/lipofectamine alla piastra contenente cellule e incubare per 6 ore a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera di 5% CO₂ e 21% O_2.
10. Dopo 6 ore, passare a un mezzo di crescita fresco completo (10 ml) e riportare le cellule all'incubatore umidificato con un'atmosfera di 5% CO₂ e 21% O_2.

2. Raccolta LVS e ultracentrifugazione

1. Dopo 2 giorni di trasfezione, raccogliere i mezzi contenenti virus e sovrapporre nuovamente le cellule con 10 ml di terreno di crescita fresco e completo.
2. Dopo 3 giorni di trasfezione, raccogliere il supporto contenente virus e combinarlo con il supporto contenente virus raccolto al punto orario di 2 giorni.
3. Centrifugare il surnatante virale a 2.000 x g per 10 min a 4 °C per pellettificare i detriti cellulari.
4. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro legante a basso contenuto proteico di dimensioni dei pori di 0,45 μm (PES o SFCA) e conservare a 4 °C fino a quando non è pronto per l'ultracentrifugazione. Il surnatante filtrato contenente particelle lentivirali può essere conservato a 4 °C per 5 giorni senza una significativa perdita di titoli virali.
5. Sterilizzare i tubi ultracentrifuga che contengono le tazze lavandoli con etanolo al 70% per 10 minuti, asciugare all'aria, chiudere e mantenere a 4 °C.
6. Aggiungere 36 mL di mezzo filtrato contenente particelle lentivirali a un tubo ultracentrifuga sterile.
7. Riempire 5 mL di stripette sterile con 4 mL di soluzione sterile al 20% di saccarosio (preparata in PBS) ed erogarla direttamente sul fondo del tubo ultracentrifuga (UC) contenente LVS. È importante che la soluzione di saccarosio non sia mescolata con il mezzo e faccia un gradiente nella parte inferiore del tubo.
8. Bilanciare tutti i tubi ultracentrifuga utilizzando supporti DMEM privi di siero, posizionare le coppe del tubo ultracentrifugale freddo e chiudere i coperchi.
9. Ruotare i tubi a 125.000 x g per 2 ore a 4 °C.
10. Dopo la rotazione, scartare con cura il surnatante invertendo il contenuto del tubo in un contenitore contenente candeggina senza disturbare il pellet. Contrassegnare il pellet se visibile.
11. Posizionare il tubo ultracentrifuga in un tubo sterile da 50 mL e aggiungere 200 μL di DPBS sterile esattamente nella parte superiore del pellet. Conservare a 4 °C durante la notte indisturbati.
12. Il giorno seguente, mescolare delicatamente pipettando su e giù 40x.
13. Ruotare brevemente a 13.000 x g in una centrifuga da tavolo per pellettare eventuali detriti.
14. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo e aliquotare la preparazione del virus come aliquote da 20 μL. Conservare a -80 °C.
15. Mettere da parte 5 μL del preparato per le misurazioni del titolo virale.

3. Misurazione del titolo LVS per vettori basati su pLKO.1

1. Determinare il titolo delle particelle lentivirali utilizzando un qPCR seguendo le raccomandazioni del produttore.
2. Per una curva standard, preparare cinque diluizioni seriali 10 volte del DNA di controllo standard (fornite nel kit) diluendo 5 μL di DNA in 45 μL di H₂O senza nucleasi in ogni fase. Utilizzare diluizioni da 1:100 a 1:100.000 per generare una curva standard.
3. Impostare le reazioni sul ghiaccio in duplicati nel modo seguente:
   2x miscela master qPCR 10 μL
   Miscela di primer 2 μL
   Campione o DNA standard 2 μL
   Senza nucleasi H₂O 6 μL
4. Eseguire qPCR utilizzando le condizioni di ciclismo menzionate nel manuale del kit per un totale di 35 cicli.
5. Valori di soglia del ciclo di stampa (Ct) sull'asse Y rispetto al titolo del virus sull'asse X.
6. Generare una regressione logaritmica utilizzando quattro diluizioni standard del DNA di controllo (da 1:100 a 1:100.000) per determinare il titolo del campione di virus sconosciuto utilizzando un'equazione della linea di tendenza.

4. Misurazione del titolo LVS per vettori basati su pll3.7

1. Seme 1 x 10⁵ cellule HEK293T in ogni pozzetto di una piastra P12-pozzetto in 1 mL di terreno di crescita completo 24 ore prima delle infezioni.
2. Integrare il fluido con 8 μg/mL di polibrene e aggiungere 1 mL in ogni tubo sterile da 1,5 mL.
3. Diluire le particelle virali utilizzando 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL e 0,1 μL di particelle lentivirali concentrate in ciascuno degli 1 mL di mezzi contenenti polibrene.
4. Sostituire il fluido delle celle HEK293T con il mezzo contenente le quantità indicate di particelle lentivirali insieme a 8 μg/mL di polibrene e incubare per 24 ore a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera del 5% di CO₂ e del 21% di O₂.
5. Il giorno successivo, passare a mezzi freschi e continuare la coltura per 72 ore a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera di 5% CO₂ e 21% O₂.
6. Dopo 72 ore, lavare le celle con PBS, tripsinare a 37 °C secondo il protocollo del produttore e risospendere in 1 mL di PBS.
7. Eseguire l'ordinamento delle celle FACS utilizzando un selezionatore di celle, seguendo le raccomandazioni del produttore. Impostare il gate su cellule GFP positive allo 0% utilizzando cellule HEK293T non infette e contare 50.000 eventi per ciascun campione per determinare la percentuale di cellule positive per ogni diluizione virale.
8. Utilizzare solo i volumi di particelle lentivirali che danno %GFP cellule positive nell'intervallo 2%-20% per calcolare il titolo delle particelle lentivirali.

5. Infezione delle hESC e selezione stabile

1. Lavare le cellule con 2 ml di PBS che crescono in ogni pozzetto di una piastra multiwell di coltura cellulare a 6 pozzetti.
2. Staccare le cellule dalla piastra di coltura cellulare utilizzando 1 mL di 1x reagente di dissociazione cellulare mediante incubazione a 37 °C per 5 minuti.
3. Raccogliere le cellule in mezzo DMEM/F12 e centrifugare a 1.500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per raccogliere il pellet di cella.
4. Aspirare, risospesciare le cellule in 1 mL e contare usando un emocitometro.
5. Fare una sospensione cellulare con 2 x 10⁵ cellule / mL di mezzo di crescita completo contenente mTeSR1 integrato con 10 ng / mL fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), penicillina / streptomicina (P / S) e 10 μM ROCK Inhibitor (RI).
6. Seminare 1 x 10⁵ celle su 50x piastre P24-well rivestite a matrice di membrana basale completa diluita in 500 μL di terreno di crescita completo e coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera del 5% di CO₂ e del 21% di O_2.
7. Il giorno seguente, infettare le hESC a una molteplicità di infezione (MOI) di 10 con 8 μg/mL di polibrene e incubare a 37 °C per 8 ore.
8. Dopo 8 ore, sostituire i mezzi contenenti virus con mezzi di crescita freschi (-RI) e continuare la coltura fino a quando le cellule sono confluenti al 90%.
9. Iniziare la selezione della puromicina (0,8 μg / mL) quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, che di solito è 48-72 ore dopo l'infezione.
10. Dopo che la selezione è completa (di solito 4-6 giorni), dividere le cellule stabili (1: 4) ed espandere le cellule per la crioconservazione e ulteriori analisi.

6. Trasduzione di cellule progenitrici neurali derivate da H9 (NPC)

NOTA: gli NPC sono stati derivati da cellule H9 utilizzando un protocollo di inibizione dual-Smad, come descritto in precedenza¹⁹.

1. In breve, trattare le cellule H9 con reagente di dissociazione cellulare a 37 °C per 5 minuti per generare singole cellule e risospese in mezzi di crescita completi contenenti mTeSR1 integrato con 10 ng / mL fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), penicillina / streptomicina (P / S) e 10 μM ROCK Inibitore (RI). Seme su 1:50 piastre di coltura cellulare a 6 pozzetti diluite rivestite di Matrigel ad una densità di 60.000 cellule/cm² (giorno 0).
2. Iniziare la differenziazione quando le cellule raggiungono il 95% -100% di confluenza passando al 100% di mezzi KSR contenenti LDN193189 (200 nM) e SB431542 (10 μM) (giorno1).
3. Il giorno 2, cambia di nuovo il supporto con KSR al 100% integrato con LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) e XAV939 (5 μM).
4. Il giorno 4 della differenziazione, passare a una miscela di mezzo KSR (75%) e mezzo N2 (25%) con LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) e XAV939 (5 μM).
5. Dal giorno 6 al giorno 12, passare gradualmente il supporto al 100% N2 integrato con LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) e XAV939 (5 μM) aumentando il supporto N2 del 25% ogni giorno e cambiando il supporto dopo ogni 2 giorni.
6. Giornata della cultura 12 NPC nei media N2:B27 integrati con 20 ng/mL bFGF.
7. Seminare 2 x 10⁵ cellule in ogni pozzetto di una piastra P6 rivestita a matrice di membrana basale completa diluita 1:50 in 2 ml di terreni di coltura NPC e incubare per consentire alle cellule di attaccarsi.
8. Il giorno successivo, infettare le cellule con particelle lentivirali a un MOI 6 in presenza di 8 μg / mL di polibrene.
9. Dopo 8 ore, sostituire il supporto contenente virus con nuovi supporti di crescita NPC.
10. Il giorno dopo, ripetere le infezioni e cambiare i media a 8 h.
11. Mantenere le cellule in coltura per 72 ore prima della raccolta per ulteriori analisi.

Risultati

A seguito del trasferimento genico, è inevitabilmente richiesta un'elevata vitalità delle hESC. Nonostante gli sforzi e l'ottimizzazione dei protocolli per ridurre la morte cellulare a seguito dell'elettroporazione delle hESC, oltre il 50% della morte cellulare è ancora osservato dopo l'elettroporazione di queste cellule, insieme a una bassa efficienza di trasfezione²⁰. Il trasferimento genico mediato da lentivirale non solo si traduce in un'elevata efficienza del trasferimento genico, ma dimos...

Discussione

La capacità di modificare geneticamente le cellule staminali per scopi di studio o clinici è limitata sia dalla tecnologia che dalla comprensione di base della biologia delle hESC. Le tecniche che hanno mostrato un potenziale significativo nelle ESC di topo, come la lipofezione e l'elettroporazione, non sono altamente efficienti per le hESC, che sono notoriamente difficili per la consegna genica con metodi convenzionali²⁰. Questa nozione ha portato non solo all'ottimizzazione delle tecniche esis...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10