저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

요약

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

초록

현재의 프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)뿐만 아니라 hESCs로부터 유래 된 신경 전구 세포 (NPCs) 모두에 짧은 헤어핀 RNA (shRNAs)를 고효율로 전달하기위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기술한다. 렌티바이러스 입자는 저가의 양이온성 폴리머 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 패키징 플라스미드(pAX 및 pMD2.G)와 함께 진입 벡터(운반 shRNAs)를 사용하여 HEK293T 세포를 공동형질감염시킴으로써 생성되었다. 바이러스 입자는 초원심분리를 사용하여 농축되었고, 이는 5 x 10⁷ 이상의 평균 역가를 초래하였다. hESCs 및 NPCs 둘 다 퓨로마이신 선택 및 hESC에서의 안정한 발현뿐만 아니라 NPC에서의 일시적인 GFP 발현에 의해 나타난 바와 같이, 이러한 렌티바이러스 입자를 사용하여 높은 효율로 감염될 수 있었다. 더욱이, 웨스턴 블롯 분석은 shRNAs에 의해 표적화된 유전자의 발현에서 유의한 감소를 보여주었다. 또한, 세포는 CNS의 다른 계보로의 후속 분화에 의해 입증 된 바와 같이 분화 잠재력뿐만 아니라 다능성을 유지했습니다. 현재 프로토콜은 shRNA의 전달을 다룬다; 그러나, 과발현 연구를 위해 cDNA의 자궁외 발현에 대해 동일한 접근법이 사용될 수 있다.

서문

배반포 내부 세포괴로부터 유래된 인간 배아줄기세포(hESCs)는 다능성이며, 시험관내 조건 ^1,2 하에서 외부 인자에 따라 상이한 세포 유형으로 분화될 수 있다. hESC의 잠재력을 완전히 활용하기 위해서는 이러한 세포에 대한 신속하고 신뢰할 수있는 유전자 전달 방법이 필수적입니다. 종래, 사용된 기술은 크게 두 가지 유형으로 분류될 수 있다: 비바이러스성 및 바이러스 유전자 전달 시스템^(3,4). 더 자주 사용되는 비바이러스 유전자 전달 시스템은 리포펙션, 전기천공 및 핵형성이다. 비바이러스 전달 시스템은 더 적은 삽입 돌연변이 및 면역원성의 전반적인 감소 ^5,6 때문에 유리하다. 그러나, 이들 방법은 낮은 형질감염 효율 및 짧은 일시적 유전자 발현의 기간을 초래하며, 이는 장기 분화 연구⁷에 대한 주요한 한계이다. 전기천공은 리포펙션에 비해 더 나은 형질감염 효율을 초래한다; 그러나, 50% 이상의 세포 사멸 ^{8,9,10을 초래한다}. 핵을 사용하여, 세포 생존 및 형질감염 효율은 리포펙션과 전기천공을 결합함으로써 개선될 수 있지만, 접근법은 세포-특이적 완충액 및 특수 장비를 필요로 하며, 따라서, 스케일업 응용(^11,12)을 위해 상당히 비용이 많이 든다.

대조적으로, 바이러스 벡터는 형질도입 후 개선된 형질감염 효율뿐만 아니라 전반적으로 낮은 세포독성을 나타냈다. 또한, 전달된 유전자는 안정적으로 발현되고, 따라서, 이 방법은 장기 연구¹³에 이상적이다. hESCs로의 유전자 전달을 위해 가장 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터 중에는 높은 역가 바이러스 입자^14,15를 사용하여 80% 이상의 형질도입 효율을 제공할 수 있는 렌티바이러스 벡터(LVS)가 있다. 리포펙션 및_CaPO4 침전은 렌티바이러스 입자⁽¹⁶)를 수득하기 위해 패키징 플라스미드와 함께 HEK293T 세포 또는 그의 유도체를 유전자 전달 벡터로 일시적으로 형질감염시키는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나이다. 지방 감염은 좋은 형질감염 효율과 낮은 세포 독성을 초래하지만,이 기술은 비용에 의해 방해 받고 높은 역가 렌티 바이러스 입자를 얻기 위해 확장하는 것은 매우 비쌉니다. _CaPO4 침전은 리포펙션을 사용하여 수득된 것과 비교적 유사한 형질감염 효율을 초래한다. 비용 효율적이지만, CaPO4 침전은 형질감염 후 상당한 세포 사멸을 초래하며, 이는 표준화를 어렵게 하고 배치-배치-배치 변이(batch-to-batch) 변이를 피한다⁽¹⁷). 이 시나리오에서, 높은 형질감염 효율, 낮은 세포독성 및 비용 효율성을 제공하는 방법을 개발하는 것은 hESCs에 사용되는 높은 역가 렌티바이러스 입자의 생산을 위해 매우 중요하다.

폴리에틸렌이민(PEI)은 HEK293T 세포를 많은 세포독성 없이 고효율로 형질감염시킬 수 있는 양이온성 고분자이며, 리포펙션 기반 방법⁽¹⁸)에 비해 무시할 수 있는 비용을 갖는다. 이러한 상황에서, PEI는 다양한 기술을 사용하는 배양 상청액으로부터의 렌티바이러스 입자의 농도를 통한 고역가 LVS 생산의 스케일업 응용에 사용될 수 있다. 제시된 기사는 슈크로스 쿠션을 통한 초원심분리를 사용하여 HEK293T 세포 및 렌티바이러스 벡터 농도를 형질감염시키기 위한 PEI의 사용을 기술한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 정기적으로 낮은 배치 대 배치 변화로 5 x 10⁷ IU / mL 이상의 역가를 얻습니다. 이 방법은 hESC 및 hESC 유래 세포로의 유전자 전달을 위한 확장 적용에 간단하고 간단하며 비용 효율적입니다.

프로토콜

1. PEI 또는 리포펙타민 3000 시약을 사용한 HEK293T 세포의 형질감염

1. HEK293T 세포를 형질감염을 위해 시딩하기 전에 90% 합류_{할 때까지 5}% CO2 및_{21% O2}의 대기를 갖는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 DMEM + 10% FBS + 1x 페니실린/스트렙토마이신으로 배양한다. 높은 역가 바이러스 생산을 위해 상대적으로 낮은 통과 수의 세포를 사용하십시오 (이상적으로는 P30 미만).
2. 시드 4 x 10⁶ 세포를 100 mm 조직 배양 플레이트에서 완전한 성장 배지 10 mL에 넣고 5% CO2 및_{21% O2} 의 대기를 갖는 가습 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 성장시킨다_.
3. 각 형질감염에 대해, 1.5 mL 원심분리 튜브의 무혈청 DMEM 배지 1 mL에 다음과 같은 비율의 진입 및 패키징 플라스미드를 사용하여 희석된 플라스미드 DNA (1 mg/mL 스톡스)를 묽는다:
   엔트리 벡터 = 10 μg
   psPAX2.0 = 7.5 μg
   pMD2.G = 5 μg
4. 10초 동안 소용돌이치고 튜브를 실온에서 30초 동안 10,000 x g로 회전시켜 수집한다.
5. 70 μL의 (1 mg/mL 원액) PEI를 튜브에 첨가하고, 위에서 설명한 바와 같이 간단히 와류 및 스핀하여 수집한다. 사용된 PEI의 부피는 총 DNA(μg):P EI(μg)의 1:3 비율을 기준으로 합니다.
6. 리포펙타민계 트랜스펙션의 경우, 키트에 공급된 45 μL의 시약 P를 함유하는 무혈청 DMEM 배지 500 μL에 상기 벡터를 희석하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
7. 키트에 공급된 시약 L 70 μL를 500 μL의 무혈청 DMEM 배지를 사용하여 희석하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
8. 두 튜브의 내용물을 결합하고 복잡한 형성을 허용하기 위해 실온에서 20 분 동안 튜브를 배양하십시오.
9. DNA/PEI 1mL 또는 DNA/리포펙타민 복합체 1mL를 세포를 포함하는 플레이트에 적가하고, 5% CO2 및_{21% O2} 의 분위기의 가습 인큐베이터에서 37°C에서 6시간 동안 배양한다_.
10. 6시간 후, 신선한 완전 성장 배지(10 mL)로 변경하고, 세포를 5% CO2 및_{21% O2} 의 분위기로 가습된 인큐베이터로 복귀시킨다_.

2. LVS 수집 및 초원심분리

1. 형질감염 2일 후, 바이러스 함유 배지를 수집하고 세포를 다시 10 mL의 신선한 완전 성장 배지로 오버레이한다.
2. 형질감염 3일 후, 바이러스-함유 배지를 수집하고, 이를 2일 시점에서 수집된 바이러스 함유 배지와 결합시킨다.
3. 바이러스 상청액을 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다.
4. 상층액을 0.45 μm 공극 크기 저단백질 결합 필터(PES 또는 SFCA)를 사용하여 여과하고, 초원심분리가 준비될 때까지 4°C에서 보관한다. 렌티바이러스 입자를 함유하는 여과된 상청액은 바이러스 역가에서 유의한 손실 없이 5일 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
5. 컵을 보유하는 초원심분리 튜브를 멸균하여 10분 동안 70% 에탄올로 세척하고, 공기 건조하고, 닫고, 4°C에서 유지한다.
6. 렌티바이러스 입자가 포함된 여과된 배지 36 mL를 멸균 초원심분리 튜브에 첨가한다.
7. 멸균 스트리펫 5 mL를 멸균 20% 수크로오스 용액 4 mL(PBS로 제조)로 채우고 LVS가 포함된 초원심분리 튜브(UC)의 바닥에 바로 분배한다. 자당 용액이 매체와 혼합되지 않고 튜브 바닥에 구배를 만드는 것이 중요합니다.
8. 무혈청 DMEM 배지를 사용하여 모든 초원심분리 튜브의 균형을 맞추고, 컵을 고정하는 차가운 초원심분리 튜브에 넣고, 뚜껑을 닫습니다.
9. 튜브를 4°C에서 2시간 동안 125,000 x g로 회전시킨다.
10. 스핀 후, 펠렛을 방해하지 않고 표백제가 들어있는 용기에 튜브의 내용물을 뒤집어 조심스럽게 상층액을 버립니다. 펠릿이 보이면 표시하십시오.
11. 초원심분리 튜브를 50 mL 멸균 튜브에 넣고 200 μL의 멸균 DPBS를 펠릿 상단에 정확하게 첨가하십시오. 하룻밤 동안 방해받지 않고 4°C에서 보관하십시오.
12. 다음날 40x를 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞으십시오.
13. 탁상 원심분리기에서 13,000 x g로 간단히 회전시켜 파편을 펠릿화하십시오.
14. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 바이러스 제제를 20 μL 분취량으로 분취한다. -80 °C에서 보관하십시오.
15. 바이러스 역가 측정을 위한 제제 5 μL를 따로 보관한다.

3. pLKO.1 기반 벡터에 대한 LVS 역가 측정

1. 제조업체의 권장 사항에 따라 qPCR을 사용하여 렌티바이러스 입자의 역가를 확인합니다.
2. 표준 곡선의 경우, 각 단계에서 5 μL의 DNA를 45 μL의 뉴클레아제가 없는_H2O로 희석하여 표준 대조군 DNA (키트에 제공됨)의 5 배 연속 희석물을 준비하십시오. 1:100 ~ 1:100,000의 희석을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다.
3. 다음과 같은 방식으로 얼음에 대한 반응을 중복으로 설정하십시오.
   2x qPCR 마스터 믹스 10 μL
   프라이머 믹스 2 μL
   샘플 또는 표준 DNA 2 μL
   뉴클레아제 프리_H2O6 μL
4. 총 35 사이클 동안 키트의 설명서에 언급 된 사이클링 조건을 사용하여 qPCR을 수행하십시오.
5. X축 상의 Y축 대 바이러스 역가에 대한 주기 역치(Ct) 값을 플롯한다.
6. 추세선 방정식을 사용하여 알려지지 않은 바이러스 샘플 역가를 결정하기 위해 네 개의 표준 대조군 DNA 희석물 (1:100 내지 1:100,000)을 사용하여 로그 회귀를 생성한다.

4. pll3.7 기반 벡터에 대한 LVS 역가 측정

1. 시드 1 x 10⁵ HEK293T 세포를 감염 24 h 전에 완전한 성장 배지 1 mL의 P12-웰 플레이트의 각 웰에 넣는다.
2. 배지에 8 μg/mL 폴리브렌을 보충하고 멸균된 각 1.5 mL 튜브에 1 mL를 첨가하십시오.
3. 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0.5 μL, 및 0.1 μL의 진한 렌티바이러스 입자를 각각의 1 mL의 폴리브렌 함유 배지에 사용하여 바이러스 입자를 희석한다.
4. HEK293T 세포의 배지를 8 μg/mL 폴리브렌과 함께 표시된 양의 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지로 교체하고 5% CO2 및 21_{% O2}의 분위기의 가습 배양기에서 37°C에서₂₄시간 동안 배양한다.
5. 다음날, 신선한 배지로 변경하고, 5% CO2 및 21% O2의 대기를 갖는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서₇₂시간 동안 배양을 계속한다.
6. 72시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 제조자의 프로토콜에 따라 37°C에서 트립신화하고, PBS 1 mL에 재현탁시킨다.
7. 제조업체의 권장 사항에 따라 셀 분류기를 사용하여 FACS 셀 정렬을 수행합니다. 감염되지 않은 HEK293T 세포를 사용하여 게이트를 0% GFP 양성 세포로 설정하고 각 샘플에 대해 50,000개의 이벤트를 계수하여 각 바이러스 희석에 대한 양성 세포의 백분율을 결정한다.
8. 렌티바이러스 입자의 역가를 계산하기 위해 %GFP 양성 세포를 2%-20% 범위로 제공하는 렌티바이러스 입자의 부피만 사용하십시오.

5. hESCs의 감염 및 안정되어 있는 선택

1. 세포를 6-웰 세포 배양 멀티웰 플레이트의 각 웰에서 성장하는 PBS 2 mL로 세척한다.
2. 세포를 1 mL의 1x 세포 해리 시약을 사용하여 세포 배양 플레이트로부터 분리하고, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
3. 세포를 DMEM/F12 배지에 모으고 실온에서 5분 동안 1,500 x g에서 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다.
4. 흡인물, 세포를 1 mL로 재현탁하고, 혈구분석기를 사용하여 계수한다.
5. 10 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 및 10 μM ROCK 억제제(RI)로 보충된 mTeSR1을 포함하는 2 x 10⁵ 세포/mL의 완전한 성장 배지로 세포 현탁액을 만드십시오.
6. 시드 1 x 10 5 세포를 50x 완전 성장 배지의 500 μL에 희석된 완전한 기저막 매트릭스-코팅된 P24-웰 플레이트 상에서⁵ % CO2 및_{21% O2} 의 분위기의 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양하였다_.
7. 다음날, 8 μg/mL 폴리브렌으로 10의 감염 다수(MOI)에서 hESC를 감염시키고 37°C에서 8시간 동안 배양한다.
8. 8시간 후, 바이러스 함유 배지를 신선한 성장 배지(-RI)로 교체하고 세포가 90% 합류할 때까지 배양을 계속한다.
9. 세포가 90 % 합류율에 도달하면 퓨로 마이신 선택 (0.8 μg / mL)을 시작하십시오.이 플루언시는 일반적으로 감염 후 48-72 시간입니다.
10. 선택이 완료된 후 (보통 4-6 일), 안정한 세포를 분할하고 (1:4) 동결 보존 및 추가 분석을 위해 세포를 확장하십시오.

6. H9 유래 신경전구세포(NPC)의 형질도입

참고: NPCs는 앞서 19에 기술된 바와 같이 이중 Smad 억제 프로토콜을 사용하여^H9 세포로부터 유도되었다.

1. 간단히 말해서, H9 세포를 37°C에서 5분 동안 세포 해리 시약으로 처리하여 단일 세포를 생성하고, 10 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 및 10 μM ROCK 억제제(RI)로 보충된 mTeSR1을 함유하는 완전한 성장 배지에서 재현탁시킨다. 종자를 1:50에 마트리겔로 코팅된 6웰 세포 배양 접시에 60,000 cells/^cm2 (0일째)의 밀도로 희석하였다.
2. 세포가 LDN193189 (200 nM) 및 SB431542 (10 μM)를 함유하는 100% KSR 배지로 변경함으로써 95%-100% 컨플루언시에 도달할 때 분화를 개시한다(day1).
3. 2일째에, LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) 및 XAV939 (5 μM)로 보충된 100% KSR로 배지를 다시 변경한다.
4. 분화 4일째에, KSR 배지 (75%) 및 N2 배지 (25%)와 LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM), 및 XAV939 (5 μM)의 혼합물로 전환한다.
5. 6일째부터 12일째까지, 매일 N2 배지를 25% 증가시키고 2일마다 배지를 변경함으로써 LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) 및 XAV939 (5 μM)가 보충된 100% N2로 배지를 점진적으로 전환한다.
6. 배양 12일째 NPCs를 N2:B27 배지에서 20 ng/mL bFGF로 보충하였다.
7. 시드 2 x 10⁵ 세포를 2 mL의 NPCs 배양 배지에 1:50 희석된 완전한 기저막 매트릭스-코팅된 P6-플레이트의 각 웰에서 세포가 부착될 수 있도록 인큐베이션한다.
8. 다음날, 8 μg/mL 폴리브렌이 있는 상태에서 MOI 6에서 렌티바이러스 입자로 세포를 감염시킨다.
9. 8시간 후, 바이러스 함유 배지를 신선한 NPC 성장 배지로 교체한다.
10. 다음날 감염을 반복하고 8 시간에 미디어를 바꿉니다.
11. 추가 분석을 위해 수확하기 전에 세포를 72 h 동안 배양물에 보관하십시오.

결과

유전자 전달 후, hESCs의 높은 생존력은 필연적으로 요구된다. hESCs의 전기천공에 따른 세포 사멸을 감소시키기 위한 프로토콜의 노력 및 최적화에도 불구하고, 낮은 형질감염 효율⁽²⁰)과 함께 이들 세포의 전기천공 후에도 50% 이상의 세포 사멸이 여전히 관찰된다. 렌티바이러스 매개 유전자 전달은 유전자 전달의 높은 효율을 가져올 뿐만 아니라 형질도입 후 높은 수준의 세포 생?...

토론

연구 또는 임상 목적을 위해 줄기 세포를 유 전적으로 변형시키는 능력은 hESC의 생물학에 대한 기술과 기본적인 이해에 의해 제한됩니다. 리포펙션 및 전기천공과 같은 마우스 ESC에서 상당한 잠재력을 보인 기술은 hESC에 대해 매우 효율적이지 않으며, 이는 통상적인 방법⁽²⁰)에 의한 유전자 전달에 대해 악명 높게 어렵다. 이 개념은 기존 기술의 최적화뿐만 아니라 hESC에서 형질감...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10