Entrega mediada lentiviral de shRNAs para hESCs e NPCs usando polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI)

Resumo

Usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI), produzimos partículas lentivirais para expressão estável de shRNAs em células-tronco embrionárias humanas H9 (hESCs) e células progenitoras neurais derivadas de H9 (NPCs) com alta eficiência.

Resumo

O protocolo atual descreve o uso de partículas lentivirais para a entrega de RNAs (shRNAs) de grampos curtos (shRNAs) tanto para células-tronco embrionárias humanas (hESCs) quanto células progenitoras neurais (NPCs) derivadas de hESCs com alta eficiência. As partículas lentivirais foram geradas pela co-transfecção de células HEK293T usando vetores de entrada (carregando shRNAs) juntamente com plasmídeos de embalagem (pAX e pMD2.G) usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI). As partículas virais foram concentradas usando ultracentrifugação, o que resultou em titulações médias acima de 5 x 10⁷. Tanto os hESCs quanto os NPCs poderiam ser infectados em alta eficiência usando essas partículas lentivirais, como mostra a seleção de puramicina e expressão estável em hESCs, bem como expressão de GFP transitória em NPCs. Além disso, a análise de manchas ocidentais mostrou uma redução significativa na expressão de genes visados por shRNAs. Além disso, as células mantiveram sua pluripotência, bem como potencial de diferenciação, evidenciado por sua subsequente diferenciação em diferentes linhagens de CNS. O protocolo atual trata da entrega de shRNAs; no entanto, a mesma abordagem poderia ser usada para a expressão ectópica de cDNAs para estudos de superexpressão.

Introdução

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) derivadas da massa celular interna blastocisto são pluripotentes e podem ser diferenciadas em diferentes tipos de células, dependendo de fatores externos em condições in vitro ^1,2. Para aproveitar totalmente o potencial dos hESCs, é imprescindível ter métodos rápidos e confiáveis de entrega de genes para essas células. Convencionalmente, as técnicas utilizadas podem ser amplamente classificadas em dois tipos: sistemas de entrega de genes não-virais e virais ^3,4. Os sistemas de entrega de genes não-virais mais usados são lipofecção, eletroporação e nucleofeipulação. Os sistemas de entrega não-virais são vantajosos devido à menor inserção de mutações e uma diminuição geral da imunogenicidade ^5,6. No entanto, esses métodos resultam em baixa eficiência de transfecção e curta duração da expressão genética transitória, o que é uma grande limitação para estudos de diferenciação de longo prazo⁷. A eletroporação resulta em melhores eficiências de transfecção em comparação com a lipofecção; no entanto, resulta em mais de 50% de morte celular ^8,9,10. Usando nucleofecção, a eficiência de sobrevivência celular e transfecção pode ser melhorada combinando lipofecção e eletroporação, mas a abordagem precisa de tampões específicos de células e equipamentos especializados e, assim, torna-se bastante cara para aplicações dimensionadas^11,12.

Em contraste, os vetores virais têm mostrado melhores eficiências de transfecção, bem como baixa citotoxicidade geral, após a transdução. Além disso, os genes entregues são expressos de forma estável e, portanto, tornam este método ideal para estudos de longo prazo¹³. Entre os vetores virais mais utilizados para a entrega de genes em hESCs estão vetores lentivirais (LVS), que podem dar mais de 80% de eficiência de transdução usando partículas virais de alta titer^14,15. Lipofecção e precipitação de CaPO₄ estão entre os métodos mais usados para transfectar transitóriamente células HEK293T ou seus derivados com vetores de transferência genética, juntamente com plasmídeos de embalagem para produzir partículas lentivirais¹⁶. Embora a lipofecção resulte em boa eficiência de transfecção e baixa citotoxicidade, a técnica é prejudicada pelo seu custo, e escalar para obter partículas lentivirais de alto título seria muito caro. A precipitação de CaPO₄ resulta em eficiências de transfecção relativamente semelhantes às obtidas por lipofecção. Embora econômica, a precipitação do CaPO₄ resulta em morte celular significativa após transfecções, o que dificulta a padronização e a evitar variações em lote a lote¹⁷. Nesse cenário, desenvolver um método que dê alta eficiência de transfecção, baixa citotoxicidade e custo-benefício é crucial para a produção de partículas lentiviras de alto título para serem utilizadas em hESCs.

Polietilenimina (PEI) é um polímero cationico que pode transfetar células HEK293T em alta eficiência sem muita citotoxicidade e tem um custo insignificante em comparação com os métodos baseados em lipofecção¹⁸. Nesta situação, o PEI pode ser usado para aplicações dimensionadas de alta produção de LVS de titer através da concentração de partículas lentivirais de supernacantes culturais utilizando várias técnicas. O artigo apresentado descreve o uso de PEI para transfetar células HEK293T e concentração de vetores lentiviral usando ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose. Usando este método, obtemos regularmente titers bem acima de 5 x 10⁷ UI/mL com variações de lote a lote baixas. O método é simples, direto e econômico para aplicações dimensionadas para entrega de genes em células derivadas de hESCs e hESCs.

Protocolo

1. Transfecção de células HEK293T usando pei ou lipofectamina 3000 reagente

1. Cultura HEK293T células em DMEM + 10% FBS + 1x penicilina/estreptomicina a 37 °C em uma incubadora umidificada com atmosfera de 5% DE CO₂ e 21% O₂ até que sejam 90% confluentes antes de semear para transfecção. Use um número de passagem relativamente baixo de células para alta produção de vírus titer (idealmente menos que P30).
2. Semente 4 x 10⁶ células em 10 mL de meio de crescimento completo em uma placa de cultura de tecido de 100 mm e crescer durante a noite em uma incubadora de cultura tecidificada com uma atmosfera de 5% DE CO₂ e 21% O_2.
3. Para cada transfecção, diluir o DNA plasmídeo (1 mg/mL estoques) em 1 mL de mídia DMEM livre de soro em tubos de centrífugas de 1,5 mL usando a seguinte proporção de plasmídeos de entrada e embalagem:
   Vetor de entrada = 10 μg
   psPAX2,0 = 7,5 μg
   pMD2.G = 5 μg
4. Vórtice para 10 s e gire o tubo a 10.000 x g por 30 s à temperatura ambiente para coletar.
5. Adicione 70 μL de PEI (solução de estoque de 1 mg/mL) ao tubo, e vórtice e gire brevemente conforme descrito acima para coletar. O volume de PEI utilizado baseia-se em uma razão de 1:3 de DNA total (μg):P EI (μg).
6. Para transfecção à base de lipofectamina, diluir os vetores acima em 500 μL de mídia DMEM sem soro contendo 45 μL de reagente P fornecido no kit e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
7. Diluir 70 μL de reagente L fornecido no kit usando 500 μL de mídia DMEM sem soro e incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
8. Combine o conteúdo de ambos os tubos e incubar os tubos à temperatura ambiente por 20 minutos para permitir uma formação complexa.
9. Adicione dropwise 1 mL de DNA/PEI ou 1 mL de complexos de DNA/lipofectamina à placa contendo células e incubar por 6h a 37 °C em uma incubadora umidificada com atmosfera de 5% de CO₂ e 21% O_2.
10. Após 6h, mude para nova mídia de crescimento completo (10 mL) e retorne as células à incubadora umidificada com atmosfera de 5% de CO₂ e 21% O_2.

2. Coleção LVS e ultracentrifugação

1. Após 2 dias de transfecção, colete a mídia contendo vírus e sobreponha as células novamente com 10 mL de mídia de crescimento completa fresca.
2. Após 3 dias de transfecção, colete as mídias contendo vírus e combine-as com as mídias contendo vírus coletadas no ponto de hora de 2 dias.
3. Centrifugar o supernante viral a 2.000 x g por 10 min a 4 °C para pelotas de detritos celulares.
4. Filtre o supernatante usando um filtro de ligação de proteína de baixo tamanho de 0,45 μm (PES ou SFCA) e armazene a 4 °C até estar pronto para a ultracentrifugação. O supernanato filtrado contendo partículas lentivirais pode ser armazenado a 4 °C por 5 dias sem uma perda significativa em virais.
5. Esterilize os tubos ultracentrífugas segurando copos lavando-os com 70% de etanol por 10 minutos, ar seco, feche e mantenha a 4 °C.
6. Adicione 36 mL de mídia filtrada contendo partículas lentivirais a um tubo ultracentrífuga estéril.
7. Encha 5 mL de uma stripette estéril com 4 mL de solução estéril de 20% de sacarose (preparada em PBS) e dispense-a até a parte inferior do tubo ultracentrífuga (UC) contendo LVS. É importante que a solução de sacarose não seja misturada com a mídia e faça um gradiente na parte inferior do tubo.
8. Equilibre todos os tubos de ultracentrifuuge usando mídia DMEM sem soro, coloque no tubo de ultracentrifusagem fria segurando copos e feche as tampas.
9. Gire os tubos a 125.000 x g por 2 h a 4 °C.
10. Após o giro, descarte cuidadosamente o supernasce, invertendo o conteúdo do tubo em um recipiente contendo alvejante sem perturbar a pelota. Marque a pelota se for visível.
11. Coloque o tubo ultracentrífuga em um tubo estéril de 50 mL e adicione 200 μL de DPBS estéreis exatamente na parte superior da pelota. Mantenha-se a 4 °C durante a noite sem ser incomodado.
12. No dia seguinte, misture suavemente por pipetting para cima e para baixo 40x.
13. Gire brevemente a 13.000 x g em uma centrífuga de mesa para pelotar quaisquer detritos.
14. Transfira o supernatante para um novo tubo e aliquot a preparação do vírus como 20 μL alíquotas. Armazenar a −80 °C.
15. Reserve 5 μL da preparação para medidas de titer virais.

3. Medição de titer LVS para vetores baseados em pLKO.1

1. Determine o título de partículas lentiviras usando um qPCR seguindo as recomendações do fabricante.
2. Para uma curva padrão, prepare cinco diluições seriais de 10 vezes do DNA de Controle Padrão (fornecidas no kit) diluindo 5 μL de DNA em 45 μL de H₂O livre de nuclease em cada passo. Use diluições de 1:100 a 1:100.000 para gerar uma curva padrão.
3. Configure reações no gelo em duplicatas da seguinte maneira:
   2x qPCR master mix 10 μL
   Mix de primer 2 μL
   Amostra ou DNA padrão 2 μL
   H₂O 6 μL sem nuclease
4. Realizar qPCR utilizando as condições de ciclismo mencionadas no manual do kit para um total de 35 ciclos.
5. Valores do limiar do ciclo de enredo (Ct) no eixo Y vs. titulante do vírus no eixo X.
6. Gerar uma regressão logarítmica usando quatro diluições de DNA de controle padrão (1:100 a 1:100.000) para determinar o titer amostrado do vírus desconhecido usando uma equação de linha de tendência.

4. Medição de titer LVS para vetores pll3.7 baseados

1. Semente 1 x 10⁵ células HEK293T em cada poço de uma placa de P12-well em 1 mL de mídia de crescimento completo 24 h antes de infecções.
2. Suplemente a mídia com 8 μg/mL de polibrene e adicione 1 mL em cada tubo estéril de 1,5 mL.
3. Diluir as partículas virais usando 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL e 0,1 μL de partículas lentiviras concentradas em cada um dos 1 mL de mídia contendo polibrena.
4. Substitua a mídia das células HEK293T pelas mídias que contêm quantidades indicadas de partículas lentiviras, juntamente com 8 μg/mL de polibrene e incubar por 24 h a 37 °C em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% de CO₂ e 21% de O₂.
5. No dia seguinte, mude para mídia fresca e continue a cultura por 72 h a 37 °C em uma incubadora umidificada com atmosfera de 5% de CO₂ e 21% O₂.
6. Após 72 h, lave as células com PBS, tente 37 °C de acordo com o protocolo do fabricante e resuspenda em 1 mL de PBS.
7. Realize a classificação de células FACS usando um classificador de células, seguindo as recomendações do fabricante. Defina o portão para células positivas de 0% GFP usando células HEK293T não infectadas e conte 50.000 eventos para cada amostra para determinar a porcentagem de células positivas para cada diluição viral.
8. Use apenas os volumes de partículas lentivirais que dão células positivas %GFP na faixa de 2%-20% para calcular o título de partículas lentivirais.

5. Infecção de hESCs e seleção estável

1. Lave as células com 2 mL de PBS crescendo em cada poço de uma placa multiwell de cultura celular de 6 poços.
2. Retire as células da placa de cultura celular usando 1 mL de reagente de dissociação celular 1x por incubação a 37 °C por 5 min.
3. Colete as células em mídia DMEM/F12 e centrífuga a 1.500 x g por 5 min a temperatura ambiente para coletar a pelota celular.
4. Aspirar, resuspensar as células em 1 mL, e contar usando um hemótmetro.
5. Faça uma suspensão celular com 2 x 10⁵ células/mL de mídia de crescimento completo contendo mTeSR1 suplementado com 10 ng/mL fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF), penicilina/estreptomicina (P/S) e 10 μM fator de crescimento rock (RI).
6. Semente 1 x 10⁵ células em 50x diluídas placas p24-well revestidas de matriz de porão em 500 μL de mídia de crescimento completo e cultura as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% CO₂ e 21% O_2.
7. No dia seguinte, infecte os hESCs em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 com polibrene de 8 μg/mL e incubar a 37 °C por 8h.
8. Depois de 8h, substitua a mídia contendo vírus por novas mídias de crescimento (-RI) e continue a cultura até que as células sejam 90% confluentes.
9. Inicie a seleção de domicina (0,8 μg/mL) quando as células atingirem 90% de confluência, que geralmente é 48-72 h pós-infecção.
10. Após a seleção ser concluída (geralmente de 4 a 6 dias), divida as células estáveis (1:4) e expanda as células para criopreservação e análises posteriores.

6. Transdução de células progenitoras neurais derivadas de H9 (NPCs)

NOTA: Os NPCs foram derivados de células H9 usando um protocolo de inibição dual-Smad, como descrito anteriormente¹⁹.

1. Brevemente, trate as células H9 com reagente de dissociação celular a 37 °C por 5 min para gerar células únicas e resuspensar em meios de crescimento completo contendo mTeSR1 complementado com 10 ng/mL fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF), penicilina/estreptomicina (P/S) e 10 μM fator de inibidor de ROCHA (RI). Semente em 1:50 diluído Matrigel revestido de 6 poços pratos de cultura celular com uma densidade de 60.000 células/cm² (dia 0).
2. Inicie a diferenciação quando as células atingirem 95%-100% de confluência alterando para mídia 100% KSR contendo LDN193189 (200 nM) e SB431542 (10 μM) (dia1).
3. No dia 2, mude a mídia novamente com 100% KSR complementado com LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) e XAV939 (5 μM).
4. No dia 4 de diferenciação, mude para uma mistura de média KSR (75%) e N2 médio (25%) com LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) e XAV939 (5 μM).
5. Do dia 6 ao dia 12, mude gradualmente a mídia para 100% N2 complementada com LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) e XAV939 (5 μM) aumentando a mídia N2 em 25% a cada dia e mudando a mídia a cada 2 dias.
6. Dia de cultura 12 NPCs em N2:B27 mídia suplementada com 20 ng/mL bFGF.
7. Semente 2 x 10⁵ células em cada poço de uma membrana de porão diluída matriz de porão de matriz de porão revestida P6-placa em 2 mL de mídia de cultura NPCs e incubar para permitir que as células se conectem.
8. No dia seguinte, infecte as células com partículas lentivirais em um MOI 6 na presença de 8 μg/mL de polibrene.
9. Após 8h, substitua a mídia contendo vírus por uma nova mídia de crescimento de NPC.
10. No dia seguinte, repita as infecções e mude a mídia às 8h.
11. Mantenha as células na cultura por 72 h antes de colher para análise suplementar.

Resultados

Após a transferência genética, a alta viabilidade dos hESCs é inevitavelmente necessária. Apesar dos esforços e otimização dos protocolos para reduzir a morte celular após a eletroporação de hESCs, mais de 50% da morte celular ainda é observada após a eletroporação dessas células, juntamente com baixa eficiência de transfecção²⁰. A transferência de genes mediada pela Lentiviral não só resulta em alta eficiência da transferência genética, mas também demonstra altos níveis...

Discussão

A capacidade de modificar geneticamente células-tronco para estudo ou fins clínicos é limitada tanto pela tecnologia quanto pela compreensão básica da biologia dos hESCs. Técnicas que têm mostrado potencial significativo em ESCs de camundongos, como lipofecção e eletroporação, não são altamente eficientes para os hESCs, que são notoriamente difíceis para a entrega de genes pelos métodos convencionais²⁰. Essa noção levou não só à otimização das técnicas existentes, mas tamb?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10