マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

要約

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。

要約

骨髄(BM)は、新しい血球が生成されるプロセスである造血が主に発生する骨内にある軟組織です。そのため、造血幹および前駆細胞(HSPC)と、HSPCの維持と調節に寄与する間質細胞が含まれています。 血液学的およびその他のBM障害は、造血細胞に直接および/またはBMニッチの変化を介して影響を与えることにより、造血を破壊します。ここでは、フローサイトメトリーによるマウスBM HSPCと間質ニッチ集団の表現型解析を通じて、健康と悪性腫瘍における造血を研究する方法について説明します。私たちの方法は、内膜および中枢BM画分でBM細胞を濃縮するために必要なステップ、およびHSPC調節に関与する2つの主要なニッチ細胞タイプ、内皮細胞および間葉系幹細胞を特定するための適切なゲーティング戦略を詳述しています。ここで提案される表現型解析は、マウス変異体、疾患モデル、および機能アッセイと組み合わせて、HSPCコンパートメントおよびそのニッチを特徴付けることができる。

概要

フローサイトメトリーは、免疫細胞および造血細胞の特性評価と前向き単離のための非常に貴重な方法です。また、さまざまな組織の間質および上皮集団の分析にもますます使用されています。造血幹細胞(HSC)は、自己複製と多能性というユニークな特性を持っています。成体哺乳類では、HSCは主に骨髄(BM)に存在し、周囲の微小環境またはニッチから静止および生存シグナルを受け取ります¹。HSCは、機能アッセイ²に従って正式に定義されます。それにもかかわらず、いくつかの画期的な論文は、HSCを特定するためのフローサイトメトリーの有用性を示しています。限られた細胞表面マーカーを使用することにより、造血幹細胞が高度に濃縮されている造血集団を識別^{することが可能です3。}したがって、フローサイトメトリーは幹細胞分野の中心的な方法です。これは、HSCに対する推定ニッチ細胞タイプおよびニッチ因子の影響を評価するために広く使用されています。フローサイトメトリーとイメージングおよび機能アッセイを組み合わせることにより、造血幹細胞が血管周囲間葉系幹細胞(MSC)および内皮細胞(EC)によって決定的にサポートされていることが示されています。BM MSCは異種グループであり、サイトカインの寄与が異なりますが⁴、レプチン受容体(LepR)⁺ MSCが重要なニッチ細胞であることは十分に確立されています¹。BM ECも非常に不均一であり、正弦波、細動脈、およびH型/移行血管の一部である^{可能性があります5。}さまざまな研究により、これらのさまざまなECの微妙な貢献が示されています。例えば、内膜正弦波ECは空間的に静止^HSC6に近く、活性酸素種レベルが低い非移動性HSCは細動脈^EC7の近くに位置しています。ニッチの内膜と中央の位置も非常に重要です。骨内膜H型血管は、加齢とともに失われる血管周囲間質細胞と関連しており、HSC^の喪失につながります8。急性骨髄性白血病では、中枢ECが拡張し、内膜血管と内膜HSCが失われます⁹。

この分野のほとんどの研究は、造血自体と細胞のHSCの外因性調節に焦点を当てています。しかし、他の前駆細胞を調節するニッチ、すなわち多能性前駆細胞(MPP)をよりよく特徴付ける必要があることが、特にそれらが定常状態での造血の主な推進力であることを考慮すると、ますます認識されています¹⁰。固定された階層構造とは対照的に、最近の研究では、造血は、造血幹細胞が初期段階で偏ったMPPに分化する連続体であることが示されています¹¹。MPPは異なる分類スキーム¹²にちなんで名付けられているが、国際実験血液学会(ISEH)による最近のコンセンサス論文は、MPPを初期のMPPとして、リンパ系(MPP-Ly)、巨核球および赤血球(MPP-Mk/E)、および骨髄系(MPP-G/M)バイアス¹³に従って識別することを提案した。フローサイトメトリーの使用は、これらの集団の調節におけるBMニッチの重要性をさらに研究する上で重要です。現在のフローサイトメトリー法では、可変ゲーティング戦略を使用してHSPCを区別し、一貫性のないマーカーを使用して間質細胞、つまりECを同定します。現在の方法の目標は、HSPC亜集団、ECの不均一なグループ、およびLepR⁺ MSCを同定するためのBM染色のシンプルで再現性のあるワークフローを提示することです。この手法は、以前に報告された方法(たとえば、参考文献¹⁴を参照)に匹敵するものの、2つの機能的骨髄領域、内膜および中枢BM ^8,15、およびBM間質ニッチ細胞の表現型分析のための更新された実装が容易なプロトコルを提供すると考えています。

プロトコル

このプロトコルで使用された動物は、i3S動物施設で、12時間の明暗サイクルおよび温度制御された環境で、特定の病原体のない条件下で飼育されました。標準的なげっ歯類のチャウチャウと水への無料アクセスが提供されました。すべての動物は、実験動物の世話と取り扱いに関する欧州実験動物科学協会連盟(EU指令2010/63 / EU)によって概説された基準に従って人道的な世話を受けました。動物に対して行われた実験手順(安楽死)は、i3S動物倫理委員会(参照DD_2019_15)およびDireção-Geral de Alimentação e Veterináriaによって承認されました。このプロトコル全体で使用される材料の詳細は、 材料の表に記載されています。

1.溶液の調製とカクテルの染色

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS):5つのPBS錠剤を1 Lの蒸留水に溶解します。.室温(RT)で保存してください。
2. PBS 2%ウシ胎児血清(FBS):500 mLのPBSに10 mLのFBSを加えます。4°Cで保存してください。
3. 赤血球(RBC)溶解バッファー(1x):50 mLの10x RBC溶解バッファーを450 mLの脱イオン水に加えます。4°Cで保存してください。
4. コラゲナーゼIVおよびディスパーゼII溶液:30 mgのコラゲナーゼIVおよび60 mgのディスパーゼIIを30 mLのHBSSに溶解して、1 mg/mLのコラゲナーゼIVおよび2 mg/mLのディスパーゼII溶液にします。使用前に新鮮な準備をしてください。
5. Fc受容体ブロッキング溶液:精製マウスCD16/32抗体10 μLをPBS 2%FBS490 μLに加えます。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで4°Cで保存してください。
6. 蛍光細胞生存率色素染色液:2 μLの蛍光細胞生存率色素を1 mLのPBSに加えます。使用前に新鮮な準備をしてください。
7. ビオチン系統カクテル:ビオチン抗マウスCD3ε、ビオチン抗マウスCD4、ビオチン抗マウスCD8a、ビオチン抗マウス/ヒトCD11b、ビオチン抗マウス/ヒトCD45R/B220、ビオチン抗マウスLy-6G/Ly-6C(Gr-1)、およびビオチン抗マウスTER-119/赤血球細胞の各抗体を100μL混合します。使用するまで4°Cで保存してください。
8. HSCの一次染色カクテル:ビオチン系統カクテル10 μL、免疫蛍光タグ付き510抗マウスCD150(SLAM)10 μL、フィコエリスリン(PE)抗マウスFlk2(CD135)10 μL、ペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)抗マウスLy-6A/E(Sca-1)10 μL、PE/シアニン7抗マウスCD4810 μL、およびアロフィコシアニン(APC)/シアニン7抗マウスCD117(cキット)10 μLをPBS 2%FBS940 μLに加えます。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで光から保護して4°Cで保管してください。
9. 間質一次染色カクテル:5 μLのマウスレプチンRビオチン化抗体、6.7 μLのPE抗マウスエンドムチン抗体、10 μLのPerCP抗マウスLy-6A/E(Sca-1)、4 μLのPE /シアニン7抗マウスCD31、10 μLのAPC/シアニン7抗マウスCD45、および10 μLのAPC/シアニン7抗マウスTER-119/赤血球細胞を954 μLのPBS 2%FBSに添加します。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで光から保護して4°Cで保管してください。
10. HSC/間質二次染色液:1 μLのAPCストレプトアビジンを1 mLのPBS 2%FBSに加えます。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで光から保護して4°Cで保管してください。
11. ECs染色カクテル:10 μLのPE抗マウスエンドムチン抗体、10 μLのPerCP抗マウスLy-6A/E(Sca-1)、10 μLのPE/シアニン7抗マウスCD31、10 μLのAlexa Fluor 647抗マウスCD54/ICAM-1、10 μLのAPC/Cyanine7抗マウスCD45、および10 μLのAPC/シアニン7抗マウスTER-119/赤血球細胞を940 μLのPBS 2%FBSに加えます。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで光から保護して4°Cで保管してください。
12. DAPI染色液:1滴のDAPI試薬を500 μLのPBSに加えます。使用前に新鮮な準備をしてください。

2. サンプル抽出

1. 頸部脱臼によって動物を安楽死させる(この研究で提示されたデータを生成するために使用された動物の詳細は、 補足表1に記載されています)。腹を上にして動物をペトリ皿に置き、70%エタノールをスプレーします。はさみを使用して腹部の上に切り込みを入れ、皮膚を足首まで引き離します。
2. 片足をつかみ、はさみを使ってその底(脚と腰の間の関節がある場所)で切り、動物から分離します。このステップは、安楽死の二次確認方法としても機能します。足首を切って足から足を外します。脚を氷冷したPBS 2%FBSに入れます。必要に応じて、もう一方の脚で手順を繰り返します。
3. 腰の骨をつかみ、後ろに切ったハサミを使って動物から分離します。股関節の骨を氷冷したPBS 2%FBSに入れます。必要に応じて、もう一方の股関節骨で手順を繰り返します。
4. 脚と腰の骨をペトリ皿に入れ、滅菌メスを使用して骨をきれいにします。メスで膝を切って脛骨と大腿骨を分離します。きれいな骨を氷冷したPBS 2%FBSに入れます。

3. 全骨髄中の造血細胞集団解析のためのサンプル処理

1. 氷冷PBS 2%FBSを入れた乳鉢に大腿骨または脛骨を置き、乳棒を使用して乳鉢の壁にそっと押し付けて骨を粉砕します。BM細胞は乳鉢に含まれる溶液中に放出される。
2. 得られた細胞懸濁液を10 mLピペットを使用して上下にピペットでホモジナイズし、チューブの上部に配置された40 μmのセルストレーナーを介して50 mLチューブに移します。
3. この時点で破砕された骨が白く見えない場合は、乳鉢にPBS 2%FBSを追加して破砕を繰り返してから、上下にピペットで移動し、同じ40 μmセルストレーナーを介して同じ50 mLチューブに溶液を移します。
4. さらにPBS 2%FBSで乳鉢をすすぎ、同じ40 μmセルストレーナーを通して同じ50 mLチューブに溶液を移します。50 mLチューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
5. 上清を廃棄し、細胞ペレットを5 mLのRBC溶解バッファー(1x)に数回上下にピペッティングしてRTで再懸濁します。RTで2分間インキュベーションした後、15 mLのPBS 2%FBSを加えます。
6. 50 mLチューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 それでも細胞ペレットが赤みがかっているように見える場合は、手順3.5に戻ります。そうでない場合は、上清を廃棄し、ペレットを200 μLのPBSに再懸濁し、細胞懸濁液を96ウェルV底プレートのウェルに移して染色します。
7. プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。 プレートを吸収紙の上にひっくり返して上清を捨て、ペレットを200 μLの蛍光色素染色液に再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
8. プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。 プレートを吸収紙の上にひっくり返して上清を捨て、ペレットを200 μLのPBS 2%FBSに再懸濁して洗浄します。
9. プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨て、ペレットを100 μLのFc受容体遮断溶液に再懸濁します。プレートを光から保護された4°Cで10分間インキュベートします。
10. 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨て、ペレットを100 μLのHSCs一次染色カクテルに再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
11. 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨て、ペレットを100 μLのHSCs二次染色溶液に再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
12. 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を廃棄します。
13. ペレットを250 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。フローサイトメトリー分析まで、光から保護された氷上に保管してください。
    注:造血細胞集団の絶対数を決定することに関心がある場合は、サイト^{メーター16}で分析する前に、Caliblite Beadsをポリスチレンチューブに追加します。

4. 全骨髄中の間質細胞集団分析のためのサンプル処理

1. 氷冷PBS 2%FBSを入れた乳鉢に大腿骨または脛骨を置き、乳棒を使用して乳鉢の壁にそっと押し付けて骨を粉砕します。はさみを使用してP1000チップの先端を切り、それを使用して乳鉢のすべての内容物を50 mLチューブに移します(セルストレーナーを通過させないでください)。
2. 50 mLチューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを3 mLのコラゲナーゼIVおよびディスパーゼII溶液に再懸濁します。チューブを37°Cで40分間インキュベートします。
3. チューブを25 mLに補充し、PBS、2%FBS、ボルテックスを加えて混合します。50 mLチューブの内容物を100 μmセルストレーナーを通して新しい50 mLチューブに移します。15 mLのPBS 2% FBSを古い50 mLチューブに加え、同じセルストレーナーを通して同じ新しい50 mLチューブに溶液を移します。500 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
4. 上清を廃棄し、細胞ペレットを5 mLのRBC溶解バッファー(1x)に数回上下にピペッティングしてRTで再懸濁します。RTで2分間インキュベーションした後、15 mLのPBS 2%FBSを加えます。
5. 50 mLチューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 それでも細胞ペレットが赤みがかっているように見える場合は、手順4.4に戻ります。そうでない場合は、上清を廃棄し、ペレットを200 μLのPBS 2% FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を染色のために96ウェルV底プレートのウェルに移します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
6. 間質染色を行う場合は、手順4.7に進みます。EC染色を行う場合は、ステップ4.12に進んでください。
7. プレートを吸収紙の上にひっくり返して上清を捨て、ペレットを100 μLの間質一次染色カクテルに再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
8. 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上にひっくり返して上清を捨て、ペレットを100 μLの間質二次染色溶液に再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
9. 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。 プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨てます。
10. ペレットを250 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。光から保護された氷の上に保管してください。
11. サイトメーターに行く直前に、フローサイトメトリー分析用の細胞懸濁液を含むチューブに35 μLのDAPI染色溶液を加え、チューブをRTで暗所で5分間インキュベートします。このインキュベーションの後、フローサイトメトリー分析まで光から保護された氷上で保管してください。
12. プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨て、ペレットを100 μLのECs染色カクテルに再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
13. 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
14. プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨てます。ペレットを250 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。光から保護された氷の上に保管してください。
15. サイトメーターに行く直前に、フローサイトメトリー分析用の細胞懸濁液を含むチューブに35 μLのDAPI染色溶液を加え、チューブをRTで暗所で5分間インキュベートします。このインキュベーションの後、フローサイトメトリー分析まで光から保護された氷上で保管してください。
    注:間質細胞集団および内皮細胞集団の絶対数を決定する場合は、サイト^{メーター16}で分析する前に、Caliblite Beadsをポリスチレンチューブに追加します。

5.破砕およびフラッシュされたBMにおける造血細胞集団の分析のためのサンプル処理

1. ペトリ皿の上に大腿骨を置き、滅菌メスを使用して骨の端を切ります。
2. 死体のない0.5 mLインスリンシリンジを使用して、PBS 2%FBS100 μLを両側から1回骨の内側に通し、PBS 2%FBS1 mLを含む微量遠心チューブに溶液を回収することにより、骨の中央部を洗い流します(骨幹)。続いて、細胞懸濁液を、4 mLのPBS 2% FBSを含むフラッシュBMとラベル付けした50 mLチューブに移します。氷の上に保管してください。
3. 骨の端を氷冷PBS 2%FBSの入った乳鉢に入れ、乳棒を使って乳鉢の壁にそっと押し付けて押しつぶします。得られた細胞懸濁液を10 mLピペットを用いて上下にピペットでホモジナイズし、40 μmの細胞ストレーナーを通して破砕BMと標識した50 mLチューブに移します。
4. この時点で押しつぶされた骨が白く見えない場合は、モルタルにPBS 2%FBSを追加し、破砕を繰り返します。次に、上下にピペットで移動し、同じ40 μmセルストレーナーを介して同じ50 mLチューブ(粉砕BM)に溶液を移します。
5. さらにPBS 2%FBSで乳鉢をすすぎ、同じ40 μmセルストレーナーを通して同じ50 mLチューブ(粉砕BM)に溶液を移します。
6. フラッシュおよび破砕したサンプルに対応する50 mLチューブを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
7. ステップ3.5から3.13(セクション3)に従って、洗い流して粉砕したBMサンプルを使用します。

6. フローサイトメトリー解析のための単色コントロール(SCC)の調製

1. ステップ3.1から3.6(セクション3)に従い、メイン分析に使用しなかった動物の1匹から余分な骨を加え、最終的な細胞懸濁液を96ウェルV底プレートのウェルの代わりに1 mLのPBS 2%FBSを含むマイクロ遠心チューブに移します。
2. 細胞懸濁液100 μLを96ウェルV底プレートの8ウェルに移し、100 μLをDAPI SCCと標識されたPBS 2%FBS100 μLを含む5 mLポリスチレン丸底チューブに移し、残りの細胞懸濁液を無染色として標識されたPBS 2%FBS100 μLを含む5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。チューブを氷上に保ち、光から保護してください。
3. プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を廃棄します。
4. 1つのペレットを100 μLの蛍光色素染色溶液に再懸濁し、残りのペレットを100 μLのPBS 2%FBSに再懸濁します。
5. PBS 2% FBS中の細胞懸濁液(1ウェルあたり1抗体、メイン解析パネルで使用したのと同じ抗体、または同様の蛍光強度とエピトープ存在量を持つ同じ蛍光色素抗体)をそれぞれウェルに、2 μL添加する抗体と0.3 μLを添加するPECy7 CD31抗体の系統カクテルとは別に、以下の抗体を0.5 μL添加します。 ビオチン系統カクテル、免疫蛍光タグ付き510抗マウスCD150(SLAM)、PE抗マウスFlk2(CD135)、PerCP抗マウスLy-6A/E(Sca-1)、免疫蛍光タグ付き647抗マウスCD54/ICAM-1、PE/シアニン7抗マウスCD48、およびAPC/シアニン7抗マウスCD117(cキット)。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
6. 各ウェルに100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を廃棄します。
7. 抗体の系統カクテルとともにインキュベートした細胞に対応するペレットを除くすべてのペレットを180 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。フローサイトメトリー分析まで、光から保護された氷上に保管してください。
8. 抗体の系統カクテルとともにインキュベートした細胞を、100 μLのHSC/間質二次染色溶液に再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
9. 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
10. ペレットを180 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。フローサイトメトリー分析まで、光から保護された氷上に保管してください。
11. サイトメーターに行く直前に、35 μLのDAPI染色溶液をDAPI SCCチューブに加え、チューブをRTで暗所で5分間インキュベートします。このインキュベーションの後、フローサイトメトリー分析まで光から保護された氷上で保管してください。

結果

健康な若年成人C57Bl/6マウスにおけるHSCおよびMPPのフローサイトメトリー分析の代表的なプロットを 図1に示します。ゲーティング戦略は、ISEH¹³によって提案された最新の調和命名法に従います。感染やがんなどの摂動の影響を解析する場合、正常ゲートの基準としてコントロールマウスを使用することが重要です。蛍光マイナス1(FMO)コントロールは、?...

ディスカッション

説明されているプロトコルはシンプルで簡単に実行できますが、特定の手順には特別な注意を払う必要があります。例えば、フラッシュされたBMを得る場合(ステップ5.2)、PBS 2%FBSを骨の中央部の内側に通すために示された量または回数は、内膜細胞集団によるフラッシュされたサンプルの重大な汚染をもたらす可能性があるため、超えてはなりません。

治験責任医師によ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody	BioLegend	116114
APC Streptavidin	BioLegend	405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody	BioLegend	105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody	BioLegend	103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody	BioLegend	116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody	BioLegend	100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody	BioLegend	100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody	BioLegend	100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody	BioLegend	108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody	BioLegend	116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody	BioLegend	101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody	BioLegend	103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody	BioLegend	115929
Calibrite 2 Color Beads	BD Biosciences	349502
Collagenase IV	Merck Life Science	C1889
Dispase II	Merck Life Science	D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	ThermoFisher Scientific	10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody	R&D systems	BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)	ThermoFisher Scientific	R37606	DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody	ThermoFisher Scientific	12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135)	ThermoFisher Scientific	12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody	BioLegend	102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody	BioLegend	103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody	BioLegend	108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets	Merck Life Science	P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody	BioLegend	101302
RBC lysis buffer 10x	BioLegend	420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye	BioLegend	423114	fluorescent dye