Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Zusammenfassung

Das Knochenmark (BM) ist das Weichgewebe in den Knochen, in dem hauptsächlich die Hämatopoese stattfindet, der Prozess, durch den neue Blutzellen gebildet werden. Als solches enthält es hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sowie unterstützende Stromazellen, die zur Aufrechterhaltung und Regulierung von HSPCs beitragen. Hämatologische und andere BM-Erkrankungen stören die Hämatopoese, indem sie hämatopoetische Zellen direkt und/oder durch die Veränderung der BM-Nische betreffen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Hämatopoese in Gesundheit und Malignität durch die phänotypische Analyse von murinen BM-HSPCs und stromalen Nischenpopulationen mittels Durchflusszytometrie. Unsere Methode beschreibt die erforderlichen Schritte zur Anreicherung von BM-Zellen in endostealen und zentralen BM-Fraktionen sowie die geeigneten Gating-Strategien zur Identifizierung der beiden wichtigsten Nischenzelltypen, die an der HSPC-Regulation beteiligt sind, Endothelzellen und mesenchymale Stammzellen. Die hier vorgeschlagene phänotypische Analyse kann mit Mausmutanten, Krankheitsmodellen und funktionellen Assays kombiniert werden, um das HSPC-Kompartiment und seine Nische zu charakterisieren.

Einleitung

Die Durchflusszytometrie ist eine unschätzbare Methode zur Charakterisierung und prospektiven Isolierung von Immun- und hämatopoetischen Zellen. Es wird auch zunehmend zur Analyse von Stroma- und Epithelpopulationen verschiedener Gewebe eingesetzt. Die hämatopoetische Stammzelle (HSC) hat einzigartige Eigenschaften der Selbsterneuerung und Multipotenz. Bei erwachsenen Säugetieren befinden sich HSZ hauptsächlich im Knochenmark (BM), wo sie Ruhe- und Überlebenssignale aus der umgebenden Mikroumgebung oder Nische¹ erhalten. HSCs werden formal nach funktionellen Assays² definiert. Nichtsdestotrotz haben mehrere wegweisende Arbeiten die Nützlichkeit der Durchflusszytometrie zur Identifizierung von HSZ gezeigt. Durch die Verwendung von begrenzten Zelloberflächenmarkern ist es möglich, hämatopoetische Populationen zu unterscheiden, die stark an HSZ angereichert sind³. Die Durchflusszytometrie ist daher eine zentrale Methode im Stammzellbereich. Es wurde ausgiebig verwendet, um den Einfluss von vermeintlichen Nischenzelltypen und Nischenfaktoren auf HSZ zu bewerten. Durch die Kombination von Durchflusszytometrie mit Bildgebung und funktionellen Assays konnte gezeigt werden, dass HSZ entscheidend durch perivaskuläre mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Endothelzellen (ECs) unterstützt werden. BM-MSCs sind eine heterogene Gruppe und haben unterschiedliche Zytokinbeiträge⁴, aber es ist allgemein bekannt, dass Leptinrezeptoren (LepR)⁺ MSCs wichtige Nischenzellen sind¹. BM ECs sind ebenfalls sehr heterogen und können Teil von Sinusoiden, Arteriolen und Typ H/Übergangsgefäßen^{sein 5}. Verschiedene Studien haben den nuancierten Beitrag dieser verschiedenen ECs gezeigt. Zum Beispiel befinden sich endosteale sinusoidale ECs räumlich näher an ruhenden HSCs⁶, während nicht-migratorische HSCs mit geringeren Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies in der Nähe von arteriolären ECs⁷ lokalisiert sind. Die endosteale versus zentrale Lage von Nischen ist ebenfalls sehr wichtig. Endosteale Typ-H-Gefäße sind mit perivaskulären Stromazellen assoziiert, die mit zunehmendem Alter verloren gehen, was zum Verlust von HSZ führt⁸. Bei der akuten myeloischen Leukämie sind zentrale ECs erweitert, während endosteale Gefäße und endosteale HSZ verloren gehen⁹.

Die meisten Studien auf diesem Gebiet haben sich auf die Hämatopoese selbst und auf die extrinsische Regulation von HSZ durch die Zelle konzentriert. Es wurde jedoch zunehmend erkannt, dass es notwendig ist, die Nischen, die andere Vorläuferzellen regulieren, nämlich die multipotenten Vorläuferzellen (MPPs), besser zu charakterisieren, insbesondere wenn man bedenkt, dass sie die Haupttreiber der Hämatopoese im stationären Zustand sind¹⁰. Im Gegensatz zu einer festen hierarchischen Struktur haben neuere Studien gezeigt, dass die Hämatopoese ein Kontinuum ist, in dem sich HSZ in einem frühen Stadium zu verzerrten MPPs differenzieren¹¹. MPPs wurden nach verschiedenen Klassifikationsschemata benannt¹², aber ein kürzlich veröffentlichtes Konsensuspapier der Internationalen Gesellschaft für experimentelle Hämatologie (ISEH) schlug vor, MPPs als frühe MPPs und nach ihrer lymphoiden (MPP-Ly), megakaryozytären und erythroiden (MPP-Mk/E) und myeloischen (MPP-G/M) Bias zu unterscheiden¹³. Der Einsatz der Durchflusszytometrie wird entscheidend sein, um die Bedeutung von BM-Nischen für die Regulation dieser Populationen weiter zu untersuchen. Aktuelle Methoden der Durchflusszytometrie verwenden variable Gating-Strategien, um HSPCs zu differenzieren und Stromazellen, nämlich ECs, anhand inkonsistenter Marker zu identifizieren. Das Ziel der aktuellen Methode ist es, einen einfachen und reproduzierbaren Workflow der BM-Färbung zur Identifizierung von HSPC-Subpopulationen, heterogenen Gruppen von ECs und LepR⁺ MSCs zu präsentieren. Wir glauben, dass diese Technik, obwohl sie mit den zuvor beschriebenen Methoden vergleichbar ist (siehe z.B. Referenz 14), ein aktualisiertes und einfach zu implementierendes Protokoll für die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen in den beiden funktionellen Knochenmarkbereichen, endosteal und zentralem BM ^8,15, sowie von BM-Stromanischenzellen bietet.

Protokoll

Die Tiere, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden in der i3S-Tiereinrichtung unter spezifischen, erregerfreien Bedingungen in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und einer temperaturkontrollierten Umgebung untergebracht. Freier Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser wurde zur Verfügung gestellt. Alle Tiere wurden nach den Kriterien der Federation of European Laboratory Animal Science Associations für die Pflege und den Umgang mit Versuchstieren (EU-Richtlinie 2010/63/EU) artgerecht versorgt. Das an den Tieren durchgeführte Versuchsverfahren (Euthanasie) wurde von der i3S-Tierethikkommission (Ref. DD_2019_15) und der Direção-Geral de Alimentação e Veterinária genehmigt. Einzelheiten zu den Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle.

1. Zubereitung von Lösungen und Färbecocktails

1. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): Lösen Sie fünf PBS-Tabletten in 1 l destilliertem Wasser auf. Bei Raumtemperatur (RT) lagern.
2. PBS 2% fetales Kälberserum (FBS): Fügen Sie 10 ml FBS zu 500 ml PBS hinzu. Bei 4 °C lagern.
3. Lysepuffer für rote Blutkörperchen (1x): Fügen Sie 50 ml 10x RBC-Lysepuffer zu 450 ml deionisiertem Wasser hinzu. Bei 4 °C lagern.
4. Kollagenase IV und Dispase II-Lösung: Lösen Sie 30 mg Kollagenase IV und 60 mg Dispase II in 30 ml HBSS für eine 1 mg/ml Kollagenase IV und 2 mg/ml Dispase II-Lösung. Vor Gebrauch frisch zubereiten.
5. Fc-Rezeptor-blockierende Lösung: Fügen Sie 10 μl gereinigten Anti-Maus-CD16/32-Antikörper zu 490 μl PBS 2% FBS hinzu. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
6. Färbelösung für fluoreszierende Zellviabilitätsfarbstoffe: Fügen Sie 2 μl fluoreszierenden Zellviabilitätsfarbstoff zu 1 ml PBS hinzu. Vor Gebrauch frisch zubereiten.
7. Biotin-Abstammungscocktail: Mischen Sie 100 μl von jedem der folgenden Antikörper: Biotin-Anti-Maus-CD3ε, Biotin-Anti-Maus-CD4, Biotin-Anti-Maus-CD8a, Biotin-Anti-Maus/Human-CD11b, Biotin-Anti-Maus/Human-CD45R/B220, Biotin-Anti-Maus-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) und Biotin-Anti-Maus-TER-119/erythroide Zellen. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
8. HSCs primärer Färbecocktail: Fügen Sie 10 μl Biotin-Lineage-Cocktail, 10 μl immunfluoreszenzmarkiertes 510 Anti-Maus-CD150 (SLAM), 10 μl Phycoerythrin (PE) Anti-Maus-Flk2 (CD135), 10 μl Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP) Anti-Maus-Ly-6A/E (Sca-1), 10 μl PE/Cyanin-7-Anti-Maus-CD48 und 10 μl Allophycocyanin (APC)/Cyanin-7-Anti-Maus-CD117 (c-kit) zu 940 μl PBS 2% FBS hinzu. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
9. Stromaler Primärfärbecocktail: Fügen Sie 5 μl Mäuse-Leptin-R-Biotinylierungsantikörper, 6,7 μl PE-Anti-Maus-Endomuzin-Antikörper, 10 μl PerCP-Anti-Maus-Ly-6A/E (Sca-1), 4 μl PE/Cyanin7-Anti-Maus-CD31, 10 μl APC/Cyanin7-Anti-Maus-CD45 und 10 μl APC/Cyanin7-Anti-Maus-TER-119/erythroid-Zellen zu 954 μl PBS 2% FBS hinzu. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
10. HSCs/stromale Sekundärfärbelösung: 1 μl APC-Streptavidin zu 1 ml PBS 2% FBS geben. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
11. ECs-Färbecocktail: Fügen Sie 10 μl PE-Anti-Maus-Endomucin-Antikörper, 10 μl PerCP-Anti-Maus-Ly-6A/E (Sca-1), 10 μl PE/Cyanin7-Anti-Maus-CD31, 10 μl Alexa Fluor 647 Anti-Maus-CD54/ICAM-1, 10 μl APC/Cyanin7-Anti-Maus-CD45 und 10 μl APC/Cyanin7-Anti-Maus-TER-119/erythroide Zellen zu 940 μl PBS 2% FBS hinzu. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
12. DAPI-Färbelösung: Geben Sie 1 Tropfen DAPI-Reagenz auf 500 μl PBS. Vor Gebrauch frisch zubereiten.

2. Probenentnahme

1. Euthanasieren Sie das Tier durch Zervixluxation (Einzelheiten zu den Tieren, die zur Herstellung der in dieser Studie vorgelegten Daten verwendet wurden, finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1). Legen Sie das Tier mit dem Bauch nach oben auf eine Petrischale und besprühen Sie es mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt über dem Bauch und ziehen Sie die Haut bis zu den Knöcheln weg.
2. Fassen Sie ein Bein und schneiden Sie es mit einer Schere unten (wo sich das Gelenk zwischen Bein und Hüfte befindet) ab, um es vom Tier zu trennen. Dieser Schritt wird auch als sekundäre Bestätigungsmethode der Euthanasie dienen. Entfernen Sie den Fuß vom Bein, indem Sie am Knöchel schneiden. Legen Sie das Bein in eiskaltes PBS 2% FBS. Wiederholen Sie den Schritt bei Bedarf mit dem anderen Bein.
3. Fassen Sie den Hüftknochen und trennen Sie ihn mit einer Schere dahinter vom Tier. Legen Sie den Hüftknochen in eiskaltes PBS 2% FBS. Wiederholen Sie den Schritt bei Bedarf mit dem anderen Hüftknochen.
4. Legen Sie die Beine und Hüftknochen in eine Petrischale und reinigen Sie die Knochen mit einem sterilen Skalpell. Trennen Sie Schien- und Oberschenkelknochen, indem Sie mit dem Skalpell am Knie schneiden. Legen Sie die sauberen Knochen in eiskaltes PBS 2% FBS.

3. Probenaufbereitung zur Analyse hämatopoetischer Zellpopulationen im gesamten Knochenmark

1. Legen Sie einen Oberschenkelknochen oder ein Schienbein in einen Mörser mit eiskaltem PBS 2% FBS und zerdrücken Sie den Knochen, indem Sie ihn mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken. BM-Zellen werden in die im Mörtel enthaltene Lösung freigesetzt.
2. Die resultierende Zellsuspension wird mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettiert, um sie zu homogenisieren und durch ein 40-μm-Zellsieb, das auf das Röhrchen gelegt wird, in ein 50-ml-Röhrchen zu überführen.
3. Wenn die zerkleinerten Knochen zu diesem Zeitpunkt nicht weiß aussehen, geben Sie mehr PBS 2% FBS in den Mörser und wiederholen Sie das Zerkleinern, pipettieren Sie dann auf und ab und übertragen Sie die Lösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen durch dasselbe 40-μm-Zellsieb.
4. Spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2% FBS ab und geben Sie die Lösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen durch dasselbe 40-μm-Zellsieb. Zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml Erythrozyten-Lysepuffer (1x) bei RT durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Nach einer 2-minütigen Inkubation bei RT werden 15 ml PBS 2% FBS hinzugefügt.
6. Zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Wenn das Zellpellet immer noch rötlich aussieht, fahren Sie mit Schritt 3.5 fort. Wenn nicht, verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl PBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte.
7. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen und das Pellet in 200 μl fluoreszierender Farbstofffärbelösung resuspendieren. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.
8. Zentrifugenplatte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen und das Pellet zum Waschen in 200 μl PBS 2% FBS resuspendieren.
9. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl Fc-Rezeptor-Blockierungslösung. Inkubieren Sie die Platte für 10 min bei 4 °C vor Licht geschützt.
10. Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl HSCs primärem Färbecocktail. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.
11. Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl HSCs sekundärer Färbelösung. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.
12. Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen.
13. Resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl PBS 2% FBS und überführen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Bis zur Analyse der Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
    HINWEIS: Wenn Sie daran interessiert sind, die absolute Anzahl der hämatopoetischen Zellpopulationen zu bestimmen, fügen Sie den Polystyrolröhrchen vor der Analyse im Zytometer Calibrite Beads hinzu¹⁶.

4. Probenaufbereitung zur Analyse von Stromazellpopulationen im gesamten Knochenmark

1. Legen Sie einen Oberschenkelknochen oder ein Schienbein in einen Mörser mit eiskaltem PBS 2% FBS und zerdrücken Sie den Knochen, indem Sie ihn mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken. Schneiden Sie die Spitze einer P1000-Spitze mit einer Schere ab und füllen Sie damit den gesamten Inhalt des Mörtels in ein 50-ml-Röhrchen (nicht durch ein Zellensieb passieren).
2. Zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml Kollagenase IV und Dispase II-Lösung. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 40 min.
3. Füllen Sie das Röhrchen auf 25 ml mit PBS 2% FBS auf und wirbeln Sie es zum Mischen. Übertragen Sie den Inhalt des 50-ml-Röhrchens durch ein 100-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen. Geben Sie 15 ml PBS 2% FBS in das alte 50-ml-Röhrchen und übertragen Sie die Lösung durch dasselbe Zellsieb in dasselbe neue 50-ml-Röhrchen. Bei 500 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml Erythrozyten-Lysepuffer (1x) bei RT durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Nach einer 2-minütigen Inkubation bei RT werden 15 ml PBS 2% FBS hinzugefügt.
5. Zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Wenn das Zellpellet immer noch rötlich aussieht, fahren Sie mit Schritt 4.4 fort. Wenn nicht, verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl PBS 2% FBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C.
6. Wenn Sie eine Stromafärbung durchführen, fahren Sie mit Schritt 4.7 fort. Wenn Sie eine EC-Färbung durchführen, fahren Sie mit Schritt 4.12 fort.
7. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen und das Pellet in 100 μl stromalen primären Färbecocktail resuspendieren. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.
8. Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl stromaler sekundärer Färbelösung. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.
9. Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Teller auf saugfähiges Papier werfen.
10. Resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl PBS 2% FBS und überführen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Auf dem Eis lichtgeschützt aufbewahren.
11. Kurz bevor Sie zum Zytometer gehen, geben Sie 35 μl DAPI-Färbelösung in das Röhrchen mit der Zellsuspension für die Durchflusszytometrieanalyse und inkubieren Sie das Röhrchen bei RT für 5 Minuten im Dunkeln. Nach dieser Inkubation bis zur durchflusszytometrischen Analyse lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
12. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen und das Pellet in 100 μl ECs-Färbecocktail resuspendieren. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.
13. Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C.
14. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Teller auf saugfähiges Papier werfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl PBS 2% FBS und überführen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Auf dem Eis lichtgeschützt aufbewahren.
15. Kurz bevor Sie zum Zytometer gehen, geben Sie 35 μl DAPI-Färbelösung in das Röhrchen mit der Zellsuspension für die Durchflusszytometrieanalyse und inkubieren Sie das Röhrchen bei RT für 5 Minuten im Dunkeln. Nach dieser Inkubation bis zur durchflusszytometrischen Analyse lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
    HINWEIS: Wenn Sie daran interessiert sind, die absolute Anzahl der Stroma- und Endothelzellpopulationen zu bestimmen, fügen Sie den Polystyrolröhrchen vor der Analyse im Zytometer Calibrite Beads hinzu¹⁶.

5. Probenaufbereitung zur Analyse hämatopoetischer Zellpopulationen in zerkleinerter und gespülter BM

1. Legen Sie einen Oberschenkelknochen auf eine Petrischale und schneiden Sie die Knochenenden mit einem sterilen Skalpell ab.
2. Spülen Sie den zentralen Teil des Knochens (Diaphyse), indem Sie 100 μl PBS 2% FBS einmal von jeder Seite mit einer 0,5-ml-Insulinspritze ohne Totvolumen durch das Innere des Knochens führen und die Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS 2% FBS auffangen. Anschließend wird die Zellsuspension in ein 50-ml-Röhrchen überführt, das als gespültes BM gekennzeichnet ist und 4 ml PBS 2% FBS enthält. Auf Eis bleiben.
3. Die Enden des Knochens in einen Mörser mit eiskaltem PBS 2% FBS geben und mit dem Stößel leicht gegen die Mörserwand drücken. Die resultierende Zellsuspension wird mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettiert, um sie zu homogenisieren und durch ein 40-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen zu überführen, das als zerkleinerte BM gekennzeichnet ist.
4. Wenn der zerkleinerte Knochen zu diesem Zeitpunkt nicht weiß aussieht, geben Sie mehr PBS 2% FBS in den Mörser und wiederholen Sie das Zerkleinern. Pipettieren Sie dann auf und ab und übertragen Sie die Lösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen (zerkleinerter BM) durch dasselbe 40-μm-Zellsieb.
5. Spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2% FBS ab und überführen Sie die Lösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen (zerkleinerte BM) durch dasselbe 40-μm-Zellsieb.
6. Die 50-ml-Röhrchen, die den gespülten und zerkleinerten Proben entsprechen, werden bei 500 x g 3 min bei 4 °C zentrifugiert.
7. Befolgen Sie die Schritte 3.5 bis 3.13 (Abschnitt 3) mit den gespülten und zerkleinerten BM-Proben.

6. Vorbereitung von Einfarbenkontrollen (SCCs) für die durchflusszytometrische Analyse

1. Befolgen Sie die Schritte 3.1 bis 3.6 (Abschnitt 3) mit einem zusätzlichen Knochen von einem der Tiere, die nicht für die Hauptanalyse verwendet wurden, und übertragen Sie die endgültige Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml PBS 2% FBS enthält, anstatt in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte.
2. Übertragen Sie 100 μl der Zellsuspension in 8 Vertiefungen einer 96-Well-V-Bodenplatte, 100 μl in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit 100 μl PBS 2 % FBS, das als DAPI-SCC gekennzeichnet ist, und die verbleibende Zellsuspension in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit 100 μl PBS 2 % FBS, das als ungefärbt gekennzeichnet ist. Bewahren Sie die Röhren auf Eis lichtgeschützt auf.
3. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C und entsorgen Sie die Überstände, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen.
4. Resuspendieren Sie ein Pellet in 100 μl Fluoreszenzfarbstoff-Färbelösung und die restlichen in 100 μl PBS 2% FBS.
5. Fügen Sie 0,5 μl der folgenden Antikörper hinzu, mit Ausnahme des Lineage-Cocktails von Antikörpern, für die 2 μl hinzugefügt werden, und des PECy7 CD31-Antikörpers, für den 0,3 μl hinzugefügt werden, zu jedem der Wells mit Zellsuspension in PBS 2% FBS (ein Antikörper pro Well, dieselben Antikörper, die in den Hauptanalysepanels verwendet werden, oder dieselben Fluorophor-Antikörper mit ähnlicher Fluoreszenzintensität und Epitophäufigkeit): Biotin-Lineage-Cocktail, immunfluoreszenzmarkiert 510 Anti-Maus CD150 (SLAM), PE Anti-Maus Flk2 (CD135), PerCP Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1), immunfluoreszenzmarkiert 647 Anti-Maus CD54/ICAM-1, PE/Cyanin7 Anti-Maus CD48 und APC/Cyanine7 Anti-Maus CD117 (c-kit). Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.
6. Geben Sie 100 μl PBS 2% FBS in jede Vertiefung und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um sie zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C und entsorgen Sie die Überstände, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen.
7. Resuspendieren Sie alle Pellets mit Ausnahme des Pellets, das den Zellen entspricht, die mit dem Lineage-Cocktail von Antikörpern in 180 μl PBS 2% FBS inkubiert wurden, und überführen Sie die Zellsuspensionen in 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen durch 40-μm-Zellsiebe. Bis zur Analyse der Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
8. Resuspendieren Sie die mit dem Lineage-Cocktail von Antikörpern inkubierten Zellen in 100 μl HSCs/stromaler sekundärer Färbelösung. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.
9. Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C.
10. Resuspendieren Sie das Pellet in 180 μl PBS 2% FBS und überführen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Bis zur Analyse der Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
11. Kurz bevor Sie zum Zytometer gehen, geben Sie 35 μl DAPI-Färbelösung in das DAPI-SCC-Röhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen bei RT für 5 Minuten im Dunkeln. Nach dieser Inkubation bis zur durchflusszytometrischen Analyse lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.

Ergebnisse

Repräsentative Diagramme der durchflusszytometrischen Analyse von HSCs und MPPs in einer gesunden C57Bl/6-Maus eines jungen Erwachsenen sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Gating-Strategie folgt der neuesten harmonisierenden Nomenklatur, die von der ISEH¹³ vorgeschlagen wurde. Bei der Analyse der Auswirkungen einer Störung, wie z. B. einer Infektion oder einer Krebserkrankung, ist es wichtig, eine Kontrollmaus als Referenz für normale Gates zu verwenden. Fluoresze...

Diskussion

Während das beschriebene Protokoll einfach und leicht durchzuführen ist, sollte besonderen Wert auf bestimmte Schritte gelegt werden. Beispielsweise sollte bei der Gewinnung von gespültem BM (Schritt 5.2) das Volumen oder die Anzahl der Male, die angegeben sind, um PBS 2% FBS durch das Innere des zentralen Teils des Knochens zu passieren, nicht überschritten werden, da dies zu einer erheblichen Kontamination der gespülten Probe durch endosteale Zellpopulationen führen kann.

Änderungen a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody	BioLegend	116114
APC Streptavidin	BioLegend	405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody	BioLegend	105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody	BioLegend	103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody	BioLegend	116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody	BioLegend	100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody	BioLegend	100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody	BioLegend	100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody	BioLegend	108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody	BioLegend	116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody	BioLegend	101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody	BioLegend	103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody	BioLegend	115929
Calibrite 2 Color Beads	BD Biosciences	349502
Collagenase IV	Merck Life Science	C1889
Dispase II	Merck Life Science	D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	ThermoFisher Scientific	10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody	R&D systems	BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)	ThermoFisher Scientific	R37606	DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody	ThermoFisher Scientific	12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135)	ThermoFisher Scientific	12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody	BioLegend	102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody	BioLegend	103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody	BioLegend	108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets	Merck Life Science	P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody	BioLegend	101302
RBC lysis buffer 10x	BioLegend	420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye	BioLegend	423114	fluorescent dye