Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Özet

Kemik iliği (BM), yeni kan hücrelerinin üretildiği süreç olan hematopoezin öncelikle meydana geldiği kemiklerde bulunan yumuşak dokudur. Bu nedenle, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler) ve HSPC'lerin bakımına ve düzenlenmesine katkıda bulunan destekleyici stromal hücreleri içerir. hematolojik ve diğer BM bozuklukları, hematopoetik hücreleri doğrudan ve / veya BM nişinin değiştirilmesi yoluyla etkileyerek hematopoezi bozar. Burada, murin BM HSPC'lerinin ve stromal niş popülasyonlarının akış sitometrisi ile fenotipik analizi yoluyla sağlık ve malignitede hematopoez incelemek için bir yöntem tanımlanmıştır. Yöntemimiz, endosteal ve santral BM fraksiyonlarında BM hücrelerini zenginleştirmek için gerekli adımları ve HSPC regülasyonunda yer alan iki anahtar niş hücre tipini, endotel hücrelerini ve mezenkimal kök hücreleri tanımlamak için uygun geçit stratejilerini detaylandırmaktadır. Burada önerilen fenotipik analiz, HSPC bölmesini ve nişini karakterize etmek için fare mutantları, hastalık modelleri ve fonksiyonel testlerle birleştirilebilir.

Giriş

Akım sitometrisi, immün ve hematopoetik hücreleri karakterize etmek ve prospektif olarak izole etmek için paha biçilmez bir yöntemdir. Ayrıca, farklı dokuların stromal ve epitel popülasyonlarını analiz etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Hematopoetik kök hücre (HSC) kendini yenileme ve multipotens gibi benzersiz özelliklere sahiptir. Yetişkin memelilerde, HSC'ler öncelikle çevredeki mikro çevreden veya niş1'den sessizlik ve hayatta kalma sinyalleri aldıkları kemik iliğinde (BM) bulunur. HSC'ler resmi olarak fonksiyonel tahlilleregöre tanımlanır 2. Bununla birlikte, birkaç dönüm noktası makalesi, HSC'leri tanımlamak için akış sitometrisinin yararlılığını göstermiştir. Sınırlı hücre yüzey belirteçlerinin kullanılmasıyla, HSC'lerde oldukça zenginleştirilmiş hematopoetik popülasyonları ayırt etmek mümkündür3. Bu nedenle akım sitometrisi, kök hücre alanında merkezi bir yöntemdir. Varsayımsal niş hücre tiplerinin ve niş faktörlerin HSC'ler üzerindeki etkisini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Akım sitometrisini görüntüleme ve fonksiyonel testlerle birleştirerek, HSC'lerin perivasküler mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) ve endotel hücreleri (EC'ler) tarafından kritik olarak desteklendiği gösterilmiştir. BM MSC'ler heterojen bir gruptur ve farklı sitokin katkılarına sahiptir4, ancak leptin reseptörü (LepR) + MSC'lerin anahtar niş hücreler olduğu iyi bilinmektedir1. BM EC'leri ayrıca oldukça heterojendir ve sinüzoidlerin, arteriollerin ve tip H / geçiş damarlarının bir parçası olabilir5. Farklı çalışmalar, bu farklı EC'lerin nüanslı katkısını göstermiştir. Örneğin, endosteal sinüzoidal EC'ler sessiz HSC'ler6'ya mekansal olarak daha yakınken, daha düşük reaktif oksijen türlerine sahip göçmen olmayan HSC'ler arteriyolar ECs7'nin yakınında bulunur. Nişlerin endosteal ve merkezi konumu da çok önemlidir. Endosteal tip H damarları, yaşlanma ile birlikte kaybedilen perivasküler stromal hücrelerle ilişkilidir ve HSC'lerin kaybına yol açar8. Akut miyeloid lösemide santral EC'ler genişlerken, endosteal damarlar ve endosteal HSC'ler kaybolur9.

Alandaki çalışmaların çoğu, hematopoezin kendisine ve hücrenin HSC'lerin dışsal düzenlemesine odaklanmıştır. Bununla birlikte, diğer progenitörleri, yani multipotent progenitörleri (MPP'ler) düzenleyen nişlerin, özellikle de kararlı durumda hematopoezin ana itici güçleri oldukları göz önüne alındığında, daha iyi karakterize edilmesine ihtiyaç duyulduğu giderek daha fazla kabul edilmiştir10. Sabit bir hiyerarşik yapının aksine, son çalışmalar hematopoezin HSC'lerin erken evre11'de önyargılı MPP'lere farklılaştığı bir süreklilik olduğunu göstermiştir. MPP'ler farklı sınıflandırma şemalarından sonra adlandırılmıştır12, ancak Uluslararası Deneysel Hematoloji Derneği (ISEH) tarafından yakın zamanda yayınlanan bir fikir birliği makalesi, MPP'lerin erken MPP'ler olarak ve lenfoid (MPP-Ly), megakaryositik ve eritroid (MPP-Mk / E) ve miyeloid (MPP-G / M) önyargılarına göre ayrım yapılmasını önermiştir13. Akış sitometrisinin kullanımı, bu popülasyonların düzenlenmesinde BM nişlerinin önemini daha fazla incelemek için kritik öneme sahip olacaktır. Mevcut akış sitometri yöntemleri, HSPC'leri ayırt etmek ve tutarsız belirteçler kullanarak stromal hücreleri, yani EC'leri tanımlamak için değişken geçit stratejileri kullanır. Mevcut yöntemin amacı, HSPC alt popülasyonlarını, heterojen ECs gruplarını ve LepR + MSC'leri tanımlamak için BM boyamasının basit ve tekrarlanabilir bir iş akışını sunmaktır. Bu tekniğin, daha önce bildirilen yöntemlerle karşılaştırılabilir olmasına rağmen (örneğin, referans 14'e bakınız), iki fonksiyonel kemik iliği alanında, endosteal ve merkezi BM 8,15 ve BM stromal niş hücrelerindeki hematopoetik hücrelerin fenotipik analizi için güncellenmiş ve uygulanması kolay bir protokol sağladığına inanıyoruz.

Protokol

Bu protokolde kullanılan hayvanlar, i3S hayvan tesisinde belirli patojensiz koşullar altında 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsünde ve sıcaklık kontrollü bir ortamda barındırılmıştır. Standart kemirgen chow ve suya ücretsiz erişim sağlandı. Tüm hayvanlar, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilim Dernekleri Federasyonu tarafından belirtilen kriterlere göre insancıl bakım almıştır (AB Direktifi 2010/63/EU). Hayvanlar üzerinde yapılan deneysel prosedür (ötenazi), i3S Hayvan Etik Komitesi (ref. DD_2019_15) ve Direção-Geral de Alimentação e Veterinária tarafından onaylanmıştır. Bu protokol boyunca kullanılan malzemelerin detayları Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Çözeltilerin hazırlanması ve boyama kokteylleri

  1. Fosfat tamponlu salin (PBS): Beş PBS tabletini 1 L damıtılmış su içinde çözün. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.
  2. PBS% 2 fetal sığır serumu (FBS): 500 mL PBS'ye 10 mL FBS ekleyin. 4 °C'de saklayın.
  3. Kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu (1x): 450 mL deiyonize suya 50 mL 10x RBC lizis tamponu ekleyin. 4 °C'de saklayın.
  4. Kollajenaz IV ve dispas II çözeltisi: 1 mg / mL kollajenaz IV ve 2 mg / mL dispaz II çözeltisi için 30 mg kollajenaz IV ve 60 mg dispaz II'yi 30 mL HBSS içinde çözün. Kullanmadan önce taze hazırlayın.
  5. Fc reseptörlerini bloke eden çözelti: 490 μL PBS% 2 FBS'ye 10 μL saflaştırılmış anti-fare CD16/32 antikoru ekleyin. Taze veya önceki gün hazırlayın. Kullanıma kadar 4 °C'de saklayınız.
  6. Floresan hücre canlılığı boya boyama çözeltisi: 1 mL PBS'ye 2 μL floresan hücre canlılığı boyası ekleyin. Kullanmadan önce taze hazırlayın.
  7. Biotin soy kokteyli: Aşağıdaki antikorların her birinden 100 μL'yi karıştırın: biyotin anti-fare CD3ε, biyotin anti-fare CD4, biyotin anti-fare CD8a, biyotin anti-fare / insan CD11b, biyotin anti-fare / insan CD45R / B220, biyotin anti-fare Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) ve biyotin anti-fare TER-119 / eritroid hücreleri. Kullanıma kadar 4 °C'de saklayınız.
  8. HSC'lerin birincil boyama kokteyli: 940 μL PBS %2 FBS'ye 10 μL biyotin soy kokteyli, 10 μL immünofloresan etiketli 510 anti-fare CD150 (SLAM), 10 μL fikoeritrin (PE) anti-fare Flk2 (CD135), 10 μL peridinin-klorofil-protein (PerCP) anti-fare Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL PE/Cyanine7 anti-fare CD48 ve 10 μL allofikosiyanin (APC)/Siyanin7 anti-fare CD117 (c-kit) ekleyin. Taze veya önceki gün hazırlayın. Kullanıma kadar ışıktan korunmuş 4 °C'de saklayınız.
  9. Stromal birincil boyama kokteyli: 5 μL fare leptin R biyotinile antikoru, 6.7 μL PE anti-fare endomüsin antikoru, 10 μL PerCP anti-fare Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL PE/Cyanine7 anti-fare CD31, 10 μL APC/Cyanine7 anti-fare CD45 ve 10 μL APC/Cyanine7 anti-fare TER-119/eritroid hücreleri 954 μL PBS %2 FBS'ye ekleyin. Taze veya önceki gün hazırlayın. Kullanıma kadar ışıktan korunmuş 4 °C'de saklayınız.
  10. HSC'ler/stromal sekonder boyama çözeltisi: 1 mL PBS% 2 FBS'ye 1 μL APC streptavidin ekleyin. Taze veya önceki gün hazırlayın. Kullanıma kadar ışıktan korunmuş 4 °C'de saklayınız.
  11. ECs boyama kokteyli: 10 μL PE anti-fare endomüsin antikoru, 10 μL PerCP anti-fare Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL PE/Cyanine7 anti-mouse CD31, 10 μL Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1, 10 μL APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 ve 10 μL APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/eritroid hücreleri 940 μL PBS %2 FBS'ye ekleyin. Taze veya önceki gün hazırlayın. Kullanıma kadar ışıktan korunmuş 4 °C'de saklayınız.
  12. DAPI boyama çözeltisi: 500 μL PBS'ye 1 damla DAPI reaktifi ekleyin. Kullanmadan önce taze hazırlayın.

2. Numune ekstraksiyonu

  1. Servikal çıkık ile hayvanı ötenazi yapın (bu çalışmada sunulan verileri üretmek için kullanılan hayvanların ayrıntıları Ek Tablo 1'de bulunabilir). Hayvanı karnı yukarı kaldırarak bir Petri kabına yerleştirin ve% 70 etanol ile püskürtün. Makas kullanarak karın üstünde bir kesim yapın ve cildi ayak bileklerine kadar çekin.
  2. Bir bacağını tut ve makas kullanarak, hayvandan ayırmak için dibinden (bacak ile kalça arasındaki eklemin olduğu yerde) kesin. Bu adım aynı zamanda ikincil bir doğrulayıcı ötenazi yöntemi olarak da hizmet edecektir. Ayak bileğini keserek ayağı bacaktan çıkarın. Bacağınızı buz gibi soğuk PBS% 2 FBS'ye yerleştirin. Gerekirse, adımı diğer bacağınızla tekrarlayın.
  3. Kalça kemiğini tutun ve hayvandan ayırmak için arkasından kesilmiş makas kullanarak. Kalça kemiğini buz gibi soğuk PBS% 2 FBS'ye yerleştirin. Gerekirse, adımı diğer kalça kemiğiyle tekrarlayın.
  4. Bacaklarını ve kalça kemiklerini bir Petri kabına yerleştirin ve steril bir neşter kullanarak kemikleri temizleyin. Neşterle dizden keserek tibia ve femuru ayırın. Temiz kemikleri buz gibi soğuk PBS% 2 FBS'ye yerleştirin.

3. Toplam kemik iliğinde hematopoetik hücre popülasyonlarının analizi için numune işleme

  1. Buz gibi soğuk PBS% 2 FBS içeren bir harç içine bir femur veya tibia yerleştirin ve havaneli kullanarak harcın duvarına hafifçe bastırarak kemiği ezin. BM hücreleri, harçta bulunan çözeltiye salınır.
  2. Elde edilen hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyin, homojenize edin ve tüpün üzerine yerleştirilen 40 μm'lik bir hücre süzgeci aracılığıyla 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  3. Ezilmiş kemikler bu noktada beyaz görünmüyorsa, harca daha fazla PBS% 2 FBS ekleyin ve ezmeyi tekrarlayın ve ardından pipetle yukarı ve aşağı pipet yapın ve çözeltiyi aynı 40 μm hücre süzgecinden aynı 50 mL tüpe aktarın.
  4. Harcı biraz daha PBS% 2 FBS ile durulayın ve çözeltiyi aynı 40 μm hücre süzgecinden aynı 50 mL tüpe aktarın. 50 mL'lik tüpü 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
  5. Süpernatantı atın ve hücre peletini RT'de 5 mL RBC lizis tamponunda (1x) birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. RT'de 2 dakikalık bir inkübasyonun ardından, 15 mL PBS% 2 FBS ekleyin.
  6. 50 mL'lik tüpü 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peleti hala kırmızımsı görünüyorsa, adım 3.5'e geri dönün. Değilse, süpernatanı atın, pelet 200 μL PBS'de yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu boyama için 96 delikli bir V tabanlı plakanın kuyucuğuna aktarın.
  7. Plakayı 500 x g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın ve peleti 200 μL floresan boya boyama çözeltisi içinde tekrar askıya alın. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  8. Santrifüj plakası 500 x g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca. Plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın ve peleti yıkamak için 200 μL PBS% 2 FBS'de tekrar askıya alın.
  9. Plakayı 4 ° C'de 3 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin, plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın ve peleti 100 μL Fc reseptörlerini bloke eden çözelti içinde yeniden askıya alın. Plakayı ışıktan korunan 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
  10. 100 μL PBS% 2 FBS ekleyin ve yıkamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Plakayı 4 °C'de 3 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin, plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın ve pelet 100 μL HSC'nin birincil boyama kokteylinde yeniden askıya alın. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  11. 100 μL PBS% 2 FBS ekleyin ve yıkamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Plakayı 4 °C'de 3 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin, plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın ve pelet 100 μL HSC'lerin ikincil boyama çözeltisinde yeniden askıya alın. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  12. 100 μL PBS% 2 FBS ekleyin ve yıkamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Plakayı 4 ° C'de 3 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin ve plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın.
  13. Peletin 250 μL PBS% 2 FBS'de yeniden askıya alınması ve hücre süspansiyonunun 40 μm hücre süzgeci aracılığıyla 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarılması. Akış sitometrisi analizine kadar ışıktan korunan buz üzerinde tutun.
    NOT: Hematopoetik hücre popülasyonlarının mutlak sayılarını belirlemekle ilgileniyorsanız, sitometre16'da analizden önce polistiren tüplerine Kalibrit Boncuklar ekleyin.

4. Toplam kemik iliğinde stromal hücre popülasyonlarının analizi için numune işleme

  1. Buz gibi soğuk PBS% 2 FBS içeren bir harç içine bir femur veya tibia yerleştirin ve havaneli kullanarak harcın duvarına hafifçe bastırarak kemiği ezin. Makas kullanarak bir P1000 ucunun ucunu kesin ve harcın tüm içeriğini 50 mL'lik bir tüpe aktarmak için kullanın (bir hücre süzgecinden geçmeyin).
  2. 50 mL'lik tüpü 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanı atın ve peleti 3 mL kollajenaz IV ve dispase II çözeltisinde yeniden askıya alın. Tüpü 37 ° C'de 40 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Tüpü PBS% 2 FBS ve karıştırmak için vorteks ile 25 mL'ye kadar doldurun. 50 mL tüpün içeriğini 100 μm hücre süzgeci aracılığıyla yeni bir 50 mL tüpe aktarın. Eski 50 mL tüpe 15 mL PBS% 2 FBS ekleyin ve çözeltiyi aynı hücre süzgeci aracılığıyla aynı yeni 50 mL tüpe aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj.
  4. Süpernatantı atın ve hücre peletini RT'de 5 mL RBC lizis tamponunda (1x) birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. RT'de 2 dakikalık bir inkübasyonun ardından, 15 mL PBS% 2 FBS ekleyin.
  5. 50 mL'lik tüpü 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peleti hala kırmızımsı görünüyorsa, adım 4.4'e geri dönün. Değilse, süpernatanı atın, pelet 200 μL PBS% 2 FBS'de yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu boyama için 96 delikli bir V tabanlı plaka kuyusuna aktarın. Plakayı 500 x g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
  6. Stromal boyama yapıyorsanız, adım 4.7'ye geçin. EC boyama işlemi yapıyorsanız, adım 4.12'ye geçin.
  7. Plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın ve peleti 100 μL stromal birincil boyama kokteylinde yeniden askıya alın. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  8. 100 μL PBS% 2 FBS ekleyin ve yıkamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Plakayı 4 ° C'de 3 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin, plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın ve peleti 100 μL stromal ikincil boyama çözeltisinde yeniden askıya alın. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  9. 100 μL PBS% 2 FBS ekleyin ve yıkamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Plakayı 500 x g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın.
  10. Peletin 250 μL PBS% 2 FBS'de yeniden askıya alınması ve hücre süspansiyonunun 40 μm hücre süzgeci aracılığıyla 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarılması. Işıktan korunan buzda tutun.
  11. Sitometreye gitmeden hemen önce, akış sitometri analizi için hücre süspansiyonunu içeren tüpe 35 μL DAPI boyama çözeltisi ekleyin ve tüpü RT'de karanlıkta 5 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyonu takiben, akış sitometrisi analizine kadar ışıktan korunan buz üzerinde tutun.
  12. Plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın ve peleti 100 μL ECs boyama kokteylinde tekrar askıya alın. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  13. 100 μL PBS% 2 FBS ekleyin ve yıkamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Plakayı 500 x g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
  14. Plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantı atın. Peletin 250 μL PBS% 2 FBS'de yeniden askıya alınması ve hücre süspansiyonunun 40 μm hücre süzgeci aracılığıyla 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarılması. Işıktan korunan buzda tutun.
  15. Sitometreye gitmeden hemen önce, akış sitometri analizi için hücre süspansiyonunu içeren tüpe 35 μL DAPI boyama çözeltisi ekleyin ve tüpü RT'de karanlıkta 5 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyonu takiben, akış sitometrisi analizine kadar ışıktan korunan buz üzerinde tutun.
    NOT: Stromal ve endotel hücre popülasyonlarının mutlak sayılarını belirlemekle ilgileniyorsanız, sitometre16'da analizden önce polistiren tüplerine Kalibrit Boncuklar ekleyin.

5. Ezilmiş ve yıkanmış BM'de hematopoetik hücre popülasyonlarının analizi için numune işleme

  1. Bir Petri kabına bir femur yerleştirin ve steril bir neşter kullanarak kemiğin uçlarını kesin.
  2. Ölü hacimsiz 0.5 mL insülin şırıngası kullanarak ve çözeltiyi 1 mL PBS% 2 FBS içeren bir mikrosantrifüj tüpünde toplayarak kemiğin orta kısmını (diyafiz) kemiğin iç kısmından her iki taraftan bir kez geçirerek yıkayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 4 mL PBS% 2 FBS içeren yıkanmış BM olarak etiketlenmiş 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Buz üzerinde tutun.
  3. Kemiğin uçlarını buz gibi soğuk PBS% 2 FBS ile bir harç içine yerleştirin ve havaneli kullanarak harç duvarına hafifçe bastırarak ezin. Elde edilen hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı doğru pipetleyin, homojenize edin ve 40 μm'lik bir hücre süzgeci aracılığıyla ezilmiş BM olarak etiketlenmiş 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. Ezilmiş kemik bu noktada beyaz görünmüyorsa, harç üzerine daha fazla PBS% 2 FBS ekleyin ve ezmeyi tekrarlayın. Daha sonra pipetle yukarı ve aşağı doğru pipet yapın ve çözeltiyi aynı 40 μm hücre süzgecinden aynı 50 mL tüpe (ezilmiş BM) aktarın.
  5. Harcı biraz daha PBS% 2 FBS ile durulayın ve çözeltiyi aynı 40 μm hücre süzgecinden aynı 50 mL tüpe (ezilmiş BM) aktarın.
  6. Yıkanmış ve ezilmiş numunelere karşılık gelen 50 mL tüpleri 500 x g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
  7. Yıkanmış ve ezilmiş BM numuneleri ile 3.5 ila 3.13 (bölüm 3) arasındaki adımları izleyin.

6. Akış sitometri analizi için tek renkli kontrollerin (SCC'ler) hazırlanması

  1. Ana analiz için kullanılmayan hayvanlardan birinden ekstra bir kemikle 3.1 ila 3.6 (bölüm 3) arasındaki adımları izleyin ve son hücre süspansiyonunu 96 delikli bir V tabanlı plaka kuyusu yerine 1 mL PBS% 2 FBS içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  2. Hücre süspansiyonunun 100 μL'sini 96 delikli bir V-taban plakasının 8 kuyucuğuna, 100 μL'yi DAPI SCC olarak etiketlenmiş 100 μL PBS% 2 FBS içeren 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe ve kalan hücre süspansiyonunu lekesiz olarak etiketlenmiş 100 μL PBS% 2 FBS içeren 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarın. Tüpleri buz üzerinde ışıktan koruyun.
  3. Plakayı 500 x g'de 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantları atın.
  4. Bir peleti 100 μL floresan boya boyama çözeltisinde ve geri kalanları 100 μL PBS% 2 FBS'de tekrar askıya alın.
  5. PBS% 2 FBS'de hücre süspansiyonuna sahip kuyucukların her birine 2 μL ekleyen antikorların soy kokteyli ve 0.3 μL ekleyen PECy7 CD31 antikoru dışında, aşağıdaki antikorlardan 0.5 μL ekleyin (kuyu başına bir antikor, ana analiz panellerinde kullanılan aynı antikorlar veya benzer floresan yoğunluğuna ve epitop bolluğuna sahip aynı florofor antikorları): biyotin soyağacı kokteyli, immünofloresan etiketli 510 anti-fare CD150 (SLAM), PE anti-fare Flk2 (CD135), PerCP anti-fare Ly-6A/E (Sca-1), immünofloresan etiketli 647 anti-fare CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 anti-fare CD48 ve APC/Cyanine7 anti-fare CD117 (c-kit). Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Her bir kuyucuğa 100 μL PBS% 2 FBS ekleyin ve yıkamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Plakayı 500 x g'de 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve plakayı emici kağıda çevirerek süpernatantları atın.
  7. 180 μL PBS% 2 FBS'de antikorların soy kokteyli ile inkübe edilen hücrelere karşılık gelen dışındaki tüm peletleri tekrar askıya alın ve hücre süspansiyonlarını 40 μm hücre süzgeçlerinden 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere aktarın. Akış sitometrisi analizine kadar ışıktan korunan buz üzerinde tutun.
  8. Antikorların soy kokteyli ile inkübe edilen hücreleri 100 μL HSC / stromal sekonder boyama çözeltisi içinde yeniden askıya alın. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  9. 100 μL PBS% 2 FBS ekleyin ve yıkamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Plakayı 500 x g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
  10. Peletin 180 μL PBS% 2 FBS'de yeniden askıya alınması ve hücre süspansiyonunun 40 μm hücre süzgeci aracılığıyla 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarılması. Akış sitometrisi analizine kadar ışıktan korunan buz üzerinde tutun.
  11. Sitometreye gitmeden hemen önce, DAPI SCC tüpüne 35 μL DAPI boyama çözeltisi ekleyin ve tüpü RT'de karanlıkta 5 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyonu takiben, akış sitometrisi analizine kadar ışıktan korunan buz üzerinde tutun.

Sonuçlar

Sağlıklı bir genç yetişkin C57Bl/6 farede HSC'lerin ve MPP'lerin akış sitometri analizinin temsili grafikleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Geçit stratejisi, ISEH13 tarafından önerilen en son uyumlaştırıcı isimlendirmeyi takip eder. Enfeksiyon veya kanser gibi bir pertürbasyonun etkisini analiz ederken, normal kapılar için referans olarak bir kontrol faresi kullanmak önemlidir. Floresan eksi bir (FMO) kontrolleri, kapıların sınırlarını tanımla...

Tartışmalar

Açıklanan protokol basit ve gerçekleştirilmesi kolay olsa da, belirli adımlara özel dikkat gösterilmelidir. Örneğin, yıkanmış BM elde ederken (adım 5.2), PBS% 2 FBS'yi kemiğin orta kısmının içinden geçirmek için belirtilen hacim veya sayı aşılmamalıdır, çünkü bu, yıkanmış numunenin endosteal hücre popülasyonları tarafından önemli ölçüde kontaminasyonuna neden olabilir.

Araştırmacı tarafından yürütülmesini kolaylaştırmak için protokolde değişik...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

LM, Lady Tata Memorial Trust'tan bir hibe ile desteklendi. JR, Fundação para a Ciência e Tecnologia'dan (FCT; FCT bursu UI/BD/150833/2021). ML, FCT'den bir doktora bursu (FCT bursu 2021.04773.BD) ile desteklenmiştir. DD, Amerikan Hematoloji Derneği, Pablove Vakfı, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522/2021) ve Portekiz Hematoloji Derneği'nden gelen hibelerle desteklendi. i3s'deki TRACY tesisinden Dr. Catarina Meireles ve Emilia Cardoso'nun desteğine teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibodyBioLegend116114
APC StreptavidinBioLegend405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibodyBioLegend105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibodyBioLegend103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibodyBioLegend116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibodyBioLegend100304
Biotin anti-mouse CD4 antibodyBioLegend100404
Biotin anti-mouse CD8a antibodyBioLegend100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibodyBioLegend108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibodyBioLegend116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibodyBioLegend101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibodyBioLegend103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibodyBioLegend115929
Calibrite 2 Color BeadsBD Biosciences349502
Collagenase IVMerck Life ScienceC1889
Dispase IIMerck Life ScienceD4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America OriginThermoFisher Scientific10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
Mouse Leptin R Biotinylated AntibodyR&D systemsBAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)ThermoFisher ScientificR37606DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibodyThermoFisher Scientific12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibodyBioLegend102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibodyBioLegend103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibodyBioLegend108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tabletsMerck Life ScienceP4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibodyBioLegend101302
RBC lysis buffer 10xBioLegend420302
Zombie Violet Fixable Viability DyeBioLegend423114fluorescent dye

Referanslar

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekmeSay 187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır