Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale

Riepilogo

Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.

Abstract

Il midollo osseo (BM) è il tessuto molle trovato all'interno delle ossa dove si verifica principalmente l'ematopoiesi, il processo mediante il quale vengono generate nuove cellule del sangue. Come tale, contiene cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), oltre a sostenere le cellule stromali che contribuiscono al mantenimento e alla regolazione delle HSPC. I disturbi ematologici e altri disturbi del BM interrompono l'ematopoiesi colpendo direttamente le cellule ematopoietiche e/o attraverso l'alterazione della nicchia BM. Qui, descriviamo un metodo per studiare l'ematopoiesi in salute e malignità attraverso l'analisi fenotipica di BM HSPC murini e popolazioni di nicchia stromali mediante citometria a flusso. Il nostro metodo descrive in dettaglio i passaggi necessari per arricchire le cellule BM nelle frazioni BM endostali e centrali, nonché le strategie di gating appropriate per identificare i due tipi di cellule di nicchia chiave coinvolte nella regolazione HSPC, le cellule endoteliali e le cellule staminali mesenchimali. L'analisi fenotipica qui proposta può essere combinata con mutanti murini, modelli di malattia e saggi funzionali per caratterizzare il compartimento HSPC e la sua nicchia.

Introduzione

La citometria a flusso è un metodo inestimabile per caratterizzare e isolare prospetticamente le cellule immunitarie ed ematopoietiche. Viene anche sempre più utilizzato per analizzare popolazioni stromali ed epiteliali di diversi tessuti. La cellula staminale ematopoietica (HSC) ha proprietà uniche di auto-rinnovamento e multipotenza. Nei mammiferi adulti, le HSC risiedono principalmente nel midollo osseo (BM), dove ricevono segnali di quiescenza e sopravvivenza dal microambiente circostante o dalla nicchia¹. Le HSC sono formalmente definite secondo i saggi funzionali². Tuttavia, diversi documenti di riferimento hanno dimostrato l'utilità della citometria a flusso per identificare le HSC. Attraverso l'uso di marcatori di superficie cellulare limitati, è possibile discriminare popolazioni ematopoietiche che sono altamente arricchite in HSCs³. La citometria a flusso è, quindi, un metodo centrale nel campo delle cellule staminali. È stato ampiamente utilizzato per valutare l'impatto di tipi di cellule di nicchia putativi e fattori di nicchia sulle HSC. Combinando la citometria a flusso con l'imaging e i saggi funzionali, è stato dimostrato che le HSC sono supportate criticamente dalle cellule staminali mesenchimali perivascolari (MSC) e dalle cellule endoteliali (ECs). Le MSC BM sono un gruppo eterogeneo e hanno diversi contributi di citochine⁴, ma è ben noto che le MSC del recettore della leptina (LepR)⁺ sono cellule di nicchia chiave¹. Le EC BM sono anche altamente eterogenee e possono far parte di sinusoidi, arteriole e vasi transizionali di tipo H^/ 5. Diversi studi hanno dimostrato il contributo sfumato di queste diverse CE. Ad esempio, le EC sinusoidali endostre sono spazialmente più vicine alle HSC quiescenti⁶, mentre le HSC non migratorie con livelli più bassi di specie reattive dell'ossigeno si trovano vicino alle EC arteriolari⁷. Anche la posizione endostale rispetto alla posizione centrale delle nicchie è molto importante. I vasi endostali di tipo H sono associati alle cellule stromali perivascolari che vengono perse con l'invecchiamento, portando alla perdita di HSC⁸. Nella leucemia mieloide acuta, le EC centrali sono espanse, mentre i vasi endostali e le HSC endostali vengono persi⁹.

La maggior parte degli studi sul campo si sono concentrati sull'ematopoiesi stessa e sulla regolazione estrinseca delle HSC da parte della cellula. È stato, tuttavia, sempre più riconosciuto che vi è la necessità di caratterizzare meglio le nicchie che regolano altri progenitori, vale a dire i progenitori multipotenti (MPP), in particolare considerando che sono i principali driver dell'ematopoiesi allo stato stazionario¹⁰. In contrasto con una struttura gerarchica fissa, studi recenti hanno dimostrato che l'ematopoiesi è un continuum in cui le HSC si differenziano in MPP distorte in una fase iniziale¹¹. Le MPP sono state nominate in base a diversi schemi di classificazione¹², ma un recente documento di consenso della Società internazionale per l'ematologia sperimentale (ISEH) ha proposto che le MPP fossero discriminate come MPP precoci e in base alla loro distorsione linfoide (MPP-Ly), megacariocitica ed eritroide (MPP-Mk / E) e mieloide (MPP-G / M)¹³. L'uso della citometria a flusso sarà fondamentale per studiare ulteriormente l'importanza delle nicchie BM nella regolazione di queste popolazioni. Gli attuali metodi di citometria a flusso utilizzano strategie di gating variabili per differenziare le HSPC e identificare le cellule stromali, vale a dire le EC, utilizzando marcatori incoerenti. L'obiettivo del metodo attuale è quello di presentare un flusso di lavoro semplice e riproducibile di colorazione BM per identificare sottopopolazioni HSPC, gruppi eterogenei di EC e MSC ^{LepR +}. Riteniamo che questa tecnica, sebbene comparabile con i metodi precedentemente riportati (vedi, ad esempio, riferimento 14), fornisca un protocollo aggiornato e facile da implementare per l'analisi fenotipica delle cellule ematopoietiche nelle due aree funzionali del midollo, endostale e BM centrale ^8,15, nonché delle cellule di nicchia stromale BM.

Protocollo

Gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati alloggiati presso la struttura per animali i3S in specifiche condizioni prive di agenti patogeni in un ciclo luce-buio di 12 ore e in un ambiente a temperatura controllata. È stato fornito l'accesso gratuito al chow e all'acqua standard dei roditori. Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane secondo i criteri delineati dalla Federazione delle associazioni europee di scienze degli animali da laboratorio per la cura e la manipolazione degli animali da laboratorio (Direttiva UE 2010/63 / UE). La procedura sperimentale eseguita sugli animali (eutanasia) è stata approvata dal Comitato etico animale i3S (rif. DD_2019_15) e dalla Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. I dettagli dei materiali utilizzati in questo protocollo sono disponibili nella tabella dei materiali.

1. Preparazione di soluzioni e cocktail coloranti

1. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): sciogliere cinque compresse di PBS in 1 L di acqua distillata. Conservare a temperatura ambiente (RT).
2. Siero bovino fetale PBS al 2% (FBS): aggiungere 10 ml di FBS a 500 ml di PBS. Conservare a 4 °C.
3. Tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) (1x): aggiungere 50 ml di tampone di lisi 10x RBC a 450 mL di acqua deionizzata. Conservare a 4 °C.
4. Soluzione di collagenasi IV e dispasi II: sciogliere 30 mg di collagenasi IV e 60 mg di dispasi II in 30 ml di HBSS per una soluzione di collagenasi IV da 1 mg/mL e 2 mg/ml di dispasi II. Preparare fresco prima dell'uso.
5. Soluzione di blocco dei recettori Fc: aggiungere 10 μL di anticorpo purificato CD16/32 anti-topo a 490 μL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C fino all'uso.
6. Soluzione colorante fluorescente per la vitalità delle cellule: aggiungere 2 μL di colorante di vitalità cellulare fluorescente a 1 mL di PBS. Preparare fresco prima dell'uso.
7. Cocktail di lignaggio della biotina: mescolare 100 μL di ciascuno dei seguenti anticorpi: biotina anti-topo CD3ε, biotina anti-topo CD4, biotina anti-topo CD8a, biotina anti-topo / umano CD11b, biotina anti-topo / umano CD45R / B220, biotina anti-topo Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) e biotina anti-topo TER-119 / cellule eritroidi. Conservare a 4 °C fino all'uso.
8. Cocktail di colorazione primaria HSCs: aggiungere 10 μL di cocktail di linea di biotina, 10 μL di 510 CD150 (SLAM) anti-topo etichettati con immunofluorescenza, 10 μL di ficoeritrina (PE) anti-topo Flk2 (CD135), 10 μL di peridinina-clorofilla-proteina (PerCP) anti-topo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL di PE/Cyanine7 anti-topo CD48 e 10 μL di alloficocianina (APC)/Cyanine7 anti-topo CD117 (c-kit) a 940 μL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'uso.
9. Cocktail di colorazione primaria stromale: aggiungere 5 μL di anticorpo biotinilato R leptina di topo, 6,7 μL di anticorpo endomucina PE anti-topo, 10 μL di PerCP anti-topo Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL di PE/Cyanine7 anti-topo CD31, 10 μL di APC/Cyanine7 anti-topo CD45 e 10 μL di cellule APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/eritroidi a 954 μL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'uso.
10. Soluzione di colorazione secondaria HSCs/stromale: aggiungere 1 μL di streptavidina APC a 1 mL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'uso.
11. Cocktail di colorazione CE: aggiungere 10 μL di anticorpo endomucina PE anti-topo, 10 μL di PerCP anti-topo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL di PE/Cyanine7 anti-mouse CD31, 10 μL di Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1, 10 μL di APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 e 10 μL di cellule APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/eritroidi a 940 μL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'uso.
12. Soluzione colorante DAPI: aggiungere 1 goccia di reagente DAPI a 500 μL di PBS. Preparare fresco prima dell'uso.

2. Estrazione del campione

1. Eutanasia dell'animale per lussazione cervicale (i dettagli degli animali utilizzati per produrre i dati presentati in questo studio sono disponibili nella tabella supplementare 1). Posizionare l'animale con la pancia in su su una piastra di Petri e spruzzare con etanolo al 70%. Fai un taglio sopra l'addome usando le forbici e tira via la pelle fino alle caviglie.
2. Prendi una gamba e, usando le forbici, taglia sul fondo (dove si trova l'articolazione tra la gamba e l'anca) per separarla dall'animale. Questo passo servirà anche come metodo secondario di conferma dell'eutanasia. Rimuovere il piede dalla gamba tagliando la caviglia. Posiziona la gamba in PBS 2% FBS ghiacciato. Se necessario, ripetere il passaggio con l'altra gamba.
3. Afferrare l'osso dell'anca e, usando le forbici, tagliare dietro di esso per separarlo dall'animale. Posizionare l'osso dell'anca in PBS 2% FBS ghiacciato. Se necessario, ripetere il passaggio con l'altro osso dell'anca.
4. Posizionare le gambe e le ossa dell'anca in una capsula di Petri e, usando un bisturi sterile, pulire le ossa. Separare la tibia e il femore tagliando il ginocchio con il bisturi. Posizionare le ossa pulite in PBS 2% FBS ghiacciato.

3. Elaborazione di campioni per l'analisi di popolazioni cellulari ematopoietiche nel midollo osseo totale

1. Metti un femore o una tibia in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato e schiaccia l'osso premendolo delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello. Le cellule BM vengono rilasciate nella soluzione contenuta nella malta.
2. Pipettare la sospensione cellulare risultante su e giù usando una pipetta da 10 mL per omogeneizzare e trasferire in una provetta da 50 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm posto sopra il tubo.
3. Se le ossa frantumate non sembrano bianche a questo punto, aggiungere più PBS 2% FBS alla malta e ripetere la frantumazione, quindi pipettare su e giù e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 ml attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 μm.
4. Risciacquare la malta con un altro PBS 2% FBS e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 mL attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 μm. Centrifugare il tubo da 50 mL a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi RBC (1x) a RT mediante pipettaggio su e giù più volte. Dopo un'incubazione di 2 minuti a RT, aggiungere 15 ml di PBS 2% FBS.
6. Centrifugare il tubo da 50 mL a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Se il pellet cellulare appare ancora rossastro, tornare al punto 3.5. In caso contrario, scartare il surnatante, risospendere il pellet in 200 μL di PBS e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra inferiore a V a 96 pozzetti per la colorazione.
7. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 200 μL di soluzione colorante fluorescente. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
8. Centrifugare in piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 200 μL di PBS 2% FBS per lavare.
9. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C, scartare il surnatante capovolgendo su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di soluzione bloccante dei recettori Fc. Incubare la piastra per 10 minuti a 4 °C al riparo dalla luce.
10. Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C, scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di cocktail di colorazione primaria HSC. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
11. Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C, scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di soluzione colorante secondaria HSC. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
12. Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante capovolgendo su carta assorbente.
13. Risospendere il pellet in 250 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
    NOTA: Se interessati a determinare il numero assoluto di popolazioni di cellule ematopoietiche, aggiungere Perle di Calibrite ai tubi di polistirene prima dell'analisi nel citometro¹⁶.

4. Elaborazione di campioni per l'analisi di popolazioni di cellule stromali nel midollo osseo totale

1. Metti un femore o una tibia in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato e schiaccia l'osso premendolo delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello. Tagliare la punta di una punta P1000 usando le forbici e usarla per trasferire tutto il contenuto della malta in un tubo da 50 ml (non passare attraverso un colino cellulare).
2. Centrifugare il tubo da 50 mL a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 3 mL di soluzione di collagenasi IV e dispasi II. Incubare il tubo a 37 °C per 40 min.
3. Riempire il tubo a 25 ml con PBS 2% FBS e vortice da miscelare. Trasferire il contenuto del tubo da 50 mL in un nuovo tubo da 50 mL attraverso un filtro cellulare da 100 μm. Aggiungere 15 mL di PBS 2% FBS al vecchio tubo da 50 mL e trasferire la soluzione nello stesso nuovo tubo da 50 mL attraverso lo stesso filtro cellulare. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi RBC (1x) a RT mediante pipettaggio su e giù più volte. Dopo un'incubazione di 2 minuti a RT, aggiungere 15 ml di PBS 2% FBS.
5. Centrifugare il tubo da 50 mL a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Se il pellet cellulare appare ancora rossastro, tornare al punto 4.4. In caso contrario, scartare il surnatante, risospendere il pellet in 200 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra inferiore a V a 96 pozzetti per la colorazione. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C.
6. Se si esegue la colorazione stromale, procedere al passaggio 4.7. Se si esegue la colorazione EC, procedere al punto 4.12.
7. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di cocktail di colorazione primaria stromale. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
8. Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di soluzione di colorazione secondaria stromale. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
9. Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente.
10. Risospendere il pellet in 250 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce.
11. Poco prima di andare al citometro, aggiungere 35 μL di soluzione colorante DAPI alla provetta contenente la sospensione cellulare per l'analisi della citometria a flusso e incubare la provetta a RT per 5 minuti al buio. Dopo questa incubazione, tenere il ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
12. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di cocktail colorante CE. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
13. Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C.
14. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente. Risospendere il pellet in 250 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce.
15. Poco prima di andare al citometro, aggiungere 35 μL di soluzione colorante DAPI alla provetta contenente la sospensione cellulare per l'analisi della citometria a flusso e incubare la provetta a RT per 5 minuti al buio. Dopo questa incubazione, tenere il ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
    NOTA: Se interessati a determinare il numero assoluto di popolazioni di cellule stromali ed endoteliali, aggiungere Perle di Calibrite ai tubi di polistirene prima dell'analisi nel citometro¹⁶.

5. Elaborazione di campioni per l'analisi di popolazioni cellulari ematopoietiche in BM frantumato e lavato

1. Metti un femore su una piastra di Petri e taglia le estremità dell'osso usando un bisturi sterile.
2. Lavare la parte centrale dell'osso (diafisi) facendo passare 100 μL di PBS 2% FBS attraverso l'interno dell'osso una volta da ciascun lato utilizzando una siringa da insulina da 0,5 mL senza volume morto e raccogliendo la soluzione in una provetta da microcentrifuga contenente 1 mL di PBS 2% FBS. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL etichettato come BM lavato contenente 4 mL di PBS 2% FBS. Mantenere il ghiaccio.
3. Posizionare le estremità dell'osso in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato e schiacciarlo premendo delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello. Pipettare la sospensione cellulare risultante su e giù usando una pipetta da 10 mL per omogeneizzare e trasferire in un tubo da 50 mL etichettato come BM frantumato attraverso un filtro cellulare da 40 μm.
4. Se l'osso schiacciato non sembra bianco a questo punto, aggiungere più PBS 2% FBS al mortaio e ripetere la frantumazione. Quindi pipettare su e giù e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 mL (BM frantumato) attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 μm.
5. Risciacquare la malta con un altro PBS 2% FBS e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 mL (BM frantumato) attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 μm.
6. Centrifugare le provette da 50 mL corrispondenti ai campioni lavati e frantumati a 500 x g per 3 minuti a 4 °C.
7. Seguire i punti da 3.5 a 3.13 (sezione 3) con i campioni di BM lavati e frantumati.

6. Preparazione di controlli monocromatici (SCC) per l'analisi citometrica a flusso

1. Seguire i punti da 3.1 a 3.6 (sezione 3) con un osso supplementare di uno degli animali non utilizzati per l'analisi principale, trasferendo la sospensione cellulare finale in una provetta da microcentrifuga contenente 1 mL di PBS 2% FBS invece di un pozzetto di una piastra con fondo a V a 96 pozzetti.
2. Trasferire 100 μL della sospensione cellulare in 8 pozzetti di una piastra inferiore a V da 96 pozzetti, 100 μL in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL contenente 100 μL di PBS 2% FBS etichettato come DAPI SCC e la restante sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL contenente 100 μL di PBS 2% FBS etichettato come non colorato. Tenere i tubi sul ghiaccio al riparo dalla luce.
3. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C ed eliminare i surnatanti capovolgendo la piastra su carta assorbente.
4. Risospendere un pellet in 100 μL di soluzione colorante fluorescente e i restanti in 100 μL di PBS 2% FBS.
5. Aggiungere 0,5 μL dei seguenti anticorpi, oltre al cocktail di anticorpi di linea per i quali aggiungere 2 μL e l'anticorpo PECy7 CD31 per il quale aggiungere 0,3 μL, a ciascuno dei pozzetti con sospensione cellulare in PBS 2% FBS (un anticorpo per pozzetto, stessi anticorpi utilizzati nei pannelli di analisi principali o stessi anticorpi fluorofori con intensità di fluorescenza e abbondanza di epitopi simili): cocktail di lignaggio di biotina, immunofluorescente marcato 510 anti-topo CD150 (SLAM), PE anti-topo Flk2 (CD135), PerCP anti-topo Ly-6A/E (Sca-1), immunofluorescente marcato 647 anti-topo CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 anti-topo CD48 e APC/Cyanine7 anti-topo CD117 (c-kit). Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
6. Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS a ciascun pozzetto e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C ed eliminare i surnatanti capovolgendo la piastra su carta assorbente.
7. Risospendere tutti i pellet tranne quello corrispondente alle cellule incubate con il cocktail di anticorpi di lignaggio in 180 μL di PBS 2% FBS e trasferire le sospensioni cellulari in tubi di polistirene a fondo tondo da 5 mL attraverso filtri cellulari da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
8. Risospendere le cellule incubate con il cocktail di anticorpi della linea in 100 μL di soluzione di colorazione secondaria HSCs/stromale. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
9. Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C.
10. Risospendere il pellet in 180 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di polistirene a fondo tondo da 5 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
11. Poco prima di andare al citometro, aggiungere 35 μL di soluzione colorante DAPI al tubo DAPI SCC e incubare il tubo a RT per 5 minuti al buio. Dopo questa incubazione, tenere il ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.

Risultati

I grafici rappresentativi dell'analisi citometrica a flusso di HSC e MPP in un topo C57Bl/6 adulto sano sono mostrati nella Figura 1. La strategia di gating segue l'ultima nomenclatura armonizzante proposta dall'ISEH¹³. Quando si analizza l'impatto di una perturbazione, come un'infezione o un cancro, è importante utilizzare un mouse di controllo come riferimento per le porte normali. I controlli a fluorescenza meno uno (FMO) possono essere particolarmente utili per d...

Discussione

Mentre il protocollo descritto è semplice e facile da eseguire, è necessario prestare particolare attenzione a passaggi specifici. Ad esempio, quando si ottiene BM lavato (fase 5.2), il volume o il numero di volte indicato per passare PBS 2% FBS attraverso l'interno della parte centrale dell'osso non deve essere superato, in quanto ciò potrebbe comportare una contaminazione significativa del campione lavato da popolazioni di cellule endosteali.

È possibile apportare modifiche al protocollo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody	BioLegend	116114
APC Streptavidin	BioLegend	405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody	BioLegend	105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody	BioLegend	103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody	BioLegend	116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody	BioLegend	100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody	BioLegend	100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody	BioLegend	100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody	BioLegend	108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody	BioLegend	116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody	BioLegend	101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody	BioLegend	103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody	BioLegend	115929
Calibrite 2 Color Beads	BD Biosciences	349502
Collagenase IV	Merck Life Science	C1889
Dispase II	Merck Life Science	D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	ThermoFisher Scientific	10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody	R&D systems	BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)	ThermoFisher Scientific	R37606	DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody	ThermoFisher Scientific	12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135)	ThermoFisher Scientific	12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody	BioLegend	102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody	BioLegend	103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody	BioLegend	108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets	Merck Life Science	P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody	BioLegend	101302
RBC lysis buffer 10x	BioLegend	420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye	BioLegend	423114	fluorescent dye