ショウジョウバエ微生物叢に適用された96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニットカウント

Ren Dodge; William  B. Ludington

doi:10.3791/64298

Method Article

ショウジョウバエ微生物叢に適用された96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニットカウント

DOI:

10.3791/64298

⸱

January 13th, 2023

Ren Dodge¹, William B. Ludington¹^,²

¹Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, ²Department of Biology, Johns Hopkins University

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要約

この方法は、96ウェルプレートフォーマットを使用してコロニー形成単位(CFU)をプレート化し、ハエホモジネートサンプル全体の ショウジョウバエ 微生物叢に適用します。CFUは、ここで提供される自動画像解析ソフトウェアでカウントされます。

要約

動物の腸は共生微生物によってコロニー形成され、宿主の発達、健康、行動に影響を与えます。コロニー形成の正確な定量は、微生物組成を検証し、その影響を研究するために、宿主と微生物の間の複雑な相互作用を研究するために不可欠です。 ショウジョウバエメラノガスターは、天然微生物の多様性が低く、定義された微生物組成で飼育するのに経済的であり、腸内細菌叢を研究するためのモデル生物として浮上しています。個々の生物の微生物叢を分析するには、どの微生物種が存在するかを特定し、それらの絶対的な存在量を定量化する必要があります。この記事では、多数の個々のハエの微生物叢を分析する方法を紹介します。ハエは96ウェルプレートで調製され、一度に多数のサンプルを処理することができます。微生物の存在量は、1つの寒天プレート上に最大96個の全フライホモジネートを一連のスポットでメッキし、各スポットで成長するコロニー形成単位(CFU)をカウントすることによって定量化されます。このメッキシステムは、プレートの写真撮影、蛍光コロニーの分化、ImageJプラグインを使用したコロニーの自動カウントを組み込んだ自動CFU定量プラットフォームとペアになっています。利点は、(i)この方法は処理間の違いを検出するのに十分な感度であり、(ii)スポットめっき法は従来のめっき方法と同じくらい正確であり、(iii)自動計数プロセスは手動計数よりも正確で高速です。ここで紹介するワークフローは、多数の反復におけるCFUのハイスループット定量を可能にし、 in vitro やその他の小動物モデルを含む他の微生物学研究システムに適用できます。

概要

腸内細菌叢とその動物宿主との関係は、微生物叢の菌株組成が宿主生理学にとって重要であることを示す生物学的研究¹の最前線にますます進んでいます2,3,4。発見のペースは、高い自然の個体間変動やコロニー形成細菌の多様性の高さなどの交絡因子によって制限されてきました^5,6,7。ショウジョウバエ、ショウジョウバエメラノガスターは、その自然に多様性の低い微生物叢、取り扱いの容易さ、および堅牢な宿主遺伝学のために有望なモデルとして浮上しています8,9,10,11。ハエは無菌にすることができ、定義された微生物^叢12と再関連させることができ、フローラがハエの生理学的形質に影響を与えることが示されています^13,14。先天的な細菌叢は、すべて培養可能な限られた細菌のセットで構成されており、これらの近親者も、乳酸菌、プロテオバクテリア、腸球菌などの哺乳類の腸に内因性です¹⁵。

宿主形質に対するマイクロバイオームの影響を研究するには、存在する種とその絶対存在量の両方の観点からマイクロバイオームを定量化する必要があります¹⁶。ハエマイクロバイオームを分析する主な方法は、コロニー形成単位(CFU)カウント^17、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング⁹、および^16S rRNA遺伝子のqPCR18です。CFUカウントは、高価な試薬なしで得ることができ、それらは細菌細胞の生存率を確認する¹⁹。qPCRを含む16S技術には、微生物の成長要件やコロニーの形態に関係なく、微生物の分類学的同一性を確認できるという利点があります²⁰。

実験で既知の細菌の定義された微生物叢を持つハエを使用する場合(グノトバイオティックハエ)、CFUカウントはシーケンシング²¹よりも特に有利です。シーケンシングは高価であり、相対的な存在量を得るためには、DNA抽出、PCRベースのライブラリ調製、およびハイスループットシーケンシングが必要です²²。コストが高いため、ハイスループットシーケンシング法は、通常、サンプルあたりの価格を下げるために一括で実行する必要があります²³。絶対存在量を得るためには、qPCRなどのさらなる方法が必要です¹⁶。対照的に、CFUカウントは迅速かつ安価であり、生細胞の絶対数を示します。ショウジョウバエ⁸と、ワームを含む他の小さな微生物叢モデル24、Caenorhabditis elegans^25,26、および幼虫のゼブラフィッシュ、ダニオレリオは、グノトビオティックに成長しました27、既知の成長特性²⁸を持つ細菌の範囲が限られています。これらの場合、特にグノトバイオティック動物では、CFUカウントは、多種の腸内コミュニティ内のすべての種の細菌を区別することができます²¹、²⁷^、²⁹。ハイスループットCFU計数法は、マイクロバイオームの組成を測定する費用対効果と速度をさらに向上させ、他の多くの微生物学実験に適用できます。

寒天ベースの増殖培地上の細菌懸濁液の段階希釈プレーティングによるCFUの計数は、微生物学の分野全体の標準的な方法です。プレート上で成長するコロニーは、手動でカウントされます。希釈により、研究者はカウント可能なコロニーの密度(例えば、プレートあたり~100CFU)を選択できるため、コロニーは互いに成長せず、妥当な時間でカウントできます。ほとんどの微生物学者は、140年前にRobert Kochの研究室で開発されたのと本質的に同じCFU計数法を使用しており、多くのアプリケーションでは、この方法は依然として適切です。しかしながら、多数のサンプルを定量しようとすると問題が生じる。単一のサンプルでは、カウント可能なCFUを得るためにサンプルの1〜10段階希釈をメッキする必要がある場合があるため、数十を超えるサンプルを含む実験には負担がかかります。CFU列挙の効率を高めるために、さまざまな方法が開発されています。自動スパイラルメッキにより、連続希釈³⁰が不要になり、CFUカウントに必要なプレートは1つだけになりますが、サンプルをプレート化する時間が長くなります。シングルプレートシリアル希釈スポッティング(SP-SDS)は、サンプル³¹あたりのより少ないプレートからのCFU推定を可能にします。これらの方法は、従来のスプレッドプレーティング法を改良したものですが、細菌サンプルの取り扱いとメッキを単独で行う必要があるため、ハイスループットには理想的ではありません。96ウェルプレートでサンプルを処理し、それらの96サンプルを長方形の寒天プレートにスポットプレーティングすることで、サンプル¹⁹のスループットが大幅に向上します。

マイクロバイオームは通常、複数の株と種で構成されています。種はしばしばコロニー形態または成長培地によって区別することができるが、蛍光は、異なるタイプの細菌およびそれらの成長形質をさらに区別するために使用することができる³²。例えば、同じ種の異なる遺伝子型は、異なる遺伝的にコードされた蛍光タンパク質で標識することができる。蛍光を組み込んだプレートイメージング法により、研究者はCFUベースのアッセイ³²においてこれらの遺伝的手法を利用することができる。蛍光をハイスループットCFU計数法に組み込むことで、その有用性がさらに高まります。

サンプル数が多い場合、CFUを手動でカウントするのは面倒になります。CFUの自動計数は、プレートを撮影し、専用ソフトウェア³³を用いて画像を処理することによって行うことができる。Sieuwertsらは、スポットプレーティングの改善されたメッキ効率と、従来のデジタル写真とImageJソフトウェアを使用した自動コロニーカウントを組み合わせました¹⁹。

特定の微生物の表現型と宿主の関連をスクリーニングするハイスループット法は、微生物叢のコミュニティアセンブリと宿主の健康とフィットネスへの影響の研究に役立ちます。 ショウジョウバエ の微生物叢の研究には、ハイスループット微生物学プラットフォームには、96ウェルプレートフォーマットでのフライサンプルの取り扱い、細菌溶解なしのフライ溶解、スポットプレーティングの効率、蛍光を使用して複数の蛍光色素を区別する機能、CFUプレートの再現性のあるイメージングのための制御された光環境、および信頼性の高い自動コロニーカウントソフトウェアが組み込まれます。この記事では、グノトバイオティックハエのCFUアッセイに最適化された、シンプル、高速、自動化された方法について説明します。このプロトコルは、以前に発表された最良の方法を組み合わせて、 ショウジョウバエの腸内細菌叢を探索するために最適化された新しいワークフローの概要を示しています。

プロトコル

1.ハエの植民地化

注:この方法は、CFUの成長プレーティングによる培養可能な腸内細菌叢を持つハエの定量分析に適しています。グノトバイオティックハエを飼育するための詳細なプロトコルは、以前に公開されています¹²。

共生細菌種による安定したコロニー形成を確立する。
1. 新鮮な細菌培養物を準備し、室温で3分間400 x gで遠心分離してペレット化し、細胞ペレットをPBSに再懸濁してOD600を1.0にします。このプロトコルのために、Lactiplantibacillus plantarum(以前はLactobacillus plantarumとして知られていた)を一晩でOD600の2.0に増殖させた。
2. フライバイアル内の食品に100 μLをピペットで送ります( 材料の表を参照)。均等に広げ、液体を15〜30分間吸収させます。
3. 20匹の無菌ハエを、標準バイアルからバイアルへの反転技術³⁴を用いてこのバイアルに移す。各ハエはほぼ同量の細菌量³⁵を食べるでしょう。あるいは、無菌卵を加えることができます。
4. ハエを新鮮な滅菌食品に3日間毎日移します。これらすべてをバイオセーフティキャビネットで行い、滅菌技術を使用します(図1A-1)。
CFU負荷を測定する前に、ハエを滅菌寒天水を含むバイアルに4時間移して、腸から一過性の細菌を取り除きます。寒天水バイアルは、ハエに水分源を提供しますが、ハエや表面のバクテリアには栄養を与えません。それらは標準的な食品と同じ滅菌フライバイアルで調製されますが、脱イオン水と1.5%寒天のみが含まれています。

2. 96ウェルPCRプレートで個別にホモジナイジングフライ

ビードビータープレートを事前に準備してください。
1. 0.5 μmのガラスビーズ( 材料の表を参照)をビーズ測定トレイに注ぎます( 補足コーディングファイル1 S1-bead-measurer.stlを使用して3Dプリント)。すべてのウェルがいっぱいで水平になるようにトレイにビーズを広げてから、余分なビーズを円錐形のチューブに払い落として回収します。
2. セミスカートPCRプレート( 材料表を参照)を測定トレイに逆さまに置き、測定トレイのくぼみにはめ込んでウェルに合わせます。次に、すばやく裏返してビーズを移します。
3. PCRプレート表面から余分なビーズを取り除き、ホイルで覆います。PCRプレートを検査して、すべてのウェルにビーズが含まれていることを確認します。必要に応じて計量スクープを使用して、単一のウェルにビーズを追加します。静電気が原因でビーズがプレート表面に付着している場合は、測定トレイとPCRプレートの背面を70%エタノールで拭くかスプレーします。
4. アルミホイルで覆います。多くのプレートはこの方法で調製し、オートクレーブ滅菌して後で使用するために保管することができます。使用の準備ができたら、96チャンネルピペッターを使用して各ウェルに100 μLのPBSを追加します(材料の表を参照)。
均質化する前に、微生物コロニー化したハエを70%エタノールで表面滅菌します(ステップ1を参照)。
1. ハエを100%CO₂で5秒間麻酔します。小さな漏斗を使用して、麻酔をかけたハエをバイアルから1.5 mLの微量遠心チューブに移します(図1A-2)。この研究では、通常、チューブごとに25匹のハエが追加されました。
2. 直ちに~1 mLの70%エタノールをチューブにスプレーし、チューブを閉じて10秒間反転混合します。次に、ハエを吸引しないように注意しながら、P1000ピペットでエタノールを吸引します。エタノールでもう一度繰り返し、次に滅菌PBSで2回繰り返します(図1A-3)。
最後のPBS洗浄後、チューブを閉じ、キャップ側を下にして、ハエがキャップに入るようにベンチで数回強くたたきます。
チューブを開き、鉗子を使用してハエをウェルに分注します(図1A-4)。各ウェルに1匹のフライを置きます(図1A-5)。ハエに麻酔をかけ続けるために、ロード中はプレートを氷の上に保ちます。
サーマルボンドヒートシールフォイルを使用してプレートをシールします(材料の表を参照)。
1. まず、ウェルの近くにある浮遊ビーズは、ホイルシールの漏れを引き起こす可能性があるため、取り除きます。ホイルの鈍い側がプレート上で下向きで、光沢のある側がヒートシーラーに向かって上を向いていることを確認してください。ヒートシーラー(材料の表を参照)を5秒間しっかりと押し下げます(図1A-6)。ハンドアプリケーター(材料の表を参照)で磨き、ホイルを固定します。
  注意: シーリング不良はサンプル損失の原因です。
プレートをプレートシェーカーに固定します。5分間ホモジナイズします(図1A-7)。ビードプレートをミニプレートスピナー(材料の表を参照)で350 x gで30秒間スピンダウンして、シーリングフォイルから液体を取り除きます。
プレートを保持しながらホイルを取り除き、ウェルからフライホモジネートの液滴をはねかけないようにします。

3.フライホモジネートの段階希釈とCFUプレートへのスポッティング

4つの長方形のMRS寒天成長プレート( 材料の表を参照)をバイオセーフティキャビネットに入れ、蓋を取り外します。このプロトコルでは、MRS寒天が L.プランタルムの成長に使用されました。これらのプレートを少なくとも10分間乾燥させます(注ぎたてまたは保管から冷やした場合は20分)。
注:プレートが濡れている場合、96ウェルプレートからの液滴が一緒に流れ、カウントが台無しになります。
96チャンネルピペッターを使用して、滅菌96ウェルプレートの各ウェルに100 μLのPBSを添加して、3つの希釈プレートを調製します。P20チップのラックを96チャンネルピペッターにロードします。
セクション2で調製したサンプルプレートから11.1 μLのホモジネートを吸引することにより、1:10希釈を行います(図1A-8)。フライホモジネートとガラスビーズがピペットを詰まらせるため、ウェルの底ではなくウェルの中央から必ず引き出してください。ビーズが沈み、ハエの粒子が浮き、中間層がほとんど透明になります。
11.1 μLを、ウェルあたり100 μLの滅菌PBSがすでに含まれている最初の希釈プレートに分注します。希釈プレートをプレートシェーカーに600rpmで10秒間保持します。5サイクル上下にピペッティングして再度混合します。11.1 μLを第1希釈プレートから第2希釈プレートに移し、次の2つの希釈プレートに対して混合ステップを繰り返します。
下記のように希釈系列めっきを行う。
1. バイオセーフティキャビネットから成長プレートを取り出します。
2. 最も希薄なプレートから始めて、96ウェルピペッターを使用して、各ウェルから寒天プレートに2 μLスポットします(図1A-9)。
  1. 寒天に刺さらないように注意しながら、ピペッターヘッドをゆっくりとプレートの上に下げます。プレートを注意深く調べ、すべてのスポットが分配されていることを確認します。そうでない場合は、適切な位置に手動で2 μLを追加します。液体スポットが寒天にすばやく浸り、一緒に流れないことを確認してください。
  2. スポットが一緒に走る場合は、新しい寒天プレートのセットを長期間乾燥させ、スポッティングをやり直します。複数のプレートタイプがある場合(例:異なる培地または抗生物質を使用)、それらも見つけてください。残りの溶液を希釈プレートに分注し、次に高い濃度に進みます。
    注意: 希釈液を見つけるときは、次の希釈液を5回混合して、ピペットチップの内容物から前の希釈液が確実に除去されるようにします。希釈プレートは、コロニー数³⁵に影響を与えることなく、4°Cで>8時間保存できます。
残りの希釈プレートについてステップ3.5で説明したようにメッキプロセスを繰り返し、元のホモジネートを含むプレートまで、最も希薄なものから最も濃縮されたものへと進行します。
すべての液体が寒天に吸収されたら、プレートを反転させてインキュベーターに入れます(図1A-10)。ショウジョウバエ由来のラクチプランチバチルスおよびアセトバクターの場合、MRS培地の最適温度は30°Cです。コロニーが最適なサイズに達するまでインキュベートします:コロニーはそれらをはっきりと見るのに十分な大きさですが、それらが融合したり互いの成長を妨げたりするほど大きくはありません(最適なサイズの定量化については、代表的な結果を参照してください)。
注:最適な成長条件は菌株に依存し、経験的に決定する必要があります。ショウジョウバエ由来のラクチプランチバチルスの場合、最適なインキュベーション時間はMRS寒天培地で26時間から30時間です。ショウジョウバエ由来のアセトバクターの場合、最適なインキュベーション時間は、菌株に応じてMRSで30時間から48時間です。
インキュベーション後、必要に応じてプレートを4°Cでカウントする準備ができるまで保管します。

4. CFUの定量化

プレートを撮影し、以下に詳述するように、自動化されたソフトウェアを使用してコロニーをカウントすることにより、CFUを定量化します。プレートを4°Cで保管する場合は、まず室温に到達させて、プレートに結露があってグレアが発生しないようにします。
プレートを論理的な順序で整理し、撮影中にその順序で保持すると、ファイルに名前を付けやすくなります。A1がすべてのプレートの左上隅になるように、すべてのプレートの向きを設定します。写真が混同されないように、A1コーナーに一意のIDのラベルを付けることをお勧めします。各希釈系列を順番に積み重ねます。
プレートの蓋を外し、A1を正しい隅に向けてプレートをステージに置きます。プレートフォトボックス(補足ファイル1、補足ファイル2)のデザインは、これらのトレイプレートの撮影に最適化されており、蛍光コロニーを画像化するための照明とフィルターのオプションが含まれています。
プレートをイメージします。カメラ( 材料表を参照)を手動設定で使用して、プレート間で一貫した露出レベルを実現します。遠近法の歪みを最小限に抑えるために、焦点距離を長く設定することをお勧めします。手ぶれによるぼやけを最小限に抑えるために、リモートシャッターを使用して写真をキャプチャします。
画像をコンピューターに転送し、実験名、培地の種類、希釈係数、その他の関連する詳細など、名前を変更します。一部のオペレーティングシステム( 材料表を参照)には、Finderで選択したファイルを右クリックして便利なバッチ名前変更機能があります。

5. Count-On-Itスイートを使用した自動コロニーカウント(補足ファイル3)

ImageJ用に提供されているCroptacularプラグイン(補足コーディングファイル2)を使用して画像をトリミングします。このプラグインは、画像を整然としたサブ領域の配列に分割するのに役立ちます(たとえば、96ウェルプレートの場合は8 x 12)。サブリージョンは個別にカウントされます。
注:サーカスと呼ばれる円形プレートをカウントするための別のプラグインは、 補足コーディングファイル3 Circus_.ijmに記載されています。
1. 定量化のために処理する画像をフォルダーに整理します。プレートを区別するファイル名を選択します。これらのファイル名は、カウントのセットごとに列タイトルになります。このフォルダ内で、「トリミング済み」および「レシート」という名前のサブフォルダを作成します。
2. クロプタキュラーを起動し、[OK]をクリックしてトリミングを開始します。
  メモ:デフォルト設定が表示され、通常は十分です。画像の解像度、照明、スポットサイズなどに応じて、基本パラメータを調整すると便利な場合があります。
3. 画像がすでにまっすぐになっている場合は、 スペースキーを押すだけです。それ以外の場合は、水平になるはずのエッジに沿って線を引いて画像をまっすぐにします。それでも画像がまっすぐに表示されない場合は、必要な回数だけ線を再描画します。
4. 次に、カウントを行う領域の境界ボックスを描画します。すべてのスポットがセル内に入るまで、サイズと比率を調整します。カーソルを境界ボックスの外側にドラッグして、グリッドを更新します。グリッドに問題がなければ、 Space キーを押します。
5. 次の画像が最初の画像と同じ角度に自動的に回転することを確認します。プラグインは、すべての写真が同じ位置に配置されていることを前提としています。これが正確な場合は、 スペース キーを押して続行します。それ以外の場合は、前と同じように画像を傾き補正します。グリッドは、前の画像と同じ位置も呼び出します。必要に応じて調整し、 Space キーを押します。
提供されている Count-On-It: Gridiron プラグイン for ImageJ (補足コーディングファイル 4) を使用して、プレート上のコロニーを列挙します。プラグインのインストールと使用の詳細な手順は、 補足ファイル3に含まれています。
1. グリッドアイアン>カウントオンイットを起動します。クロプタキュラーと同じグリッド設定を使用します。ユーザーは、フォルダー全体をバッチ処理したり、1 つの画像を分析したり、現在の画像から開始したりできます。
2. ピクセル強度の上限と下限に基づいてしきい値を設定します。すべてのコロニーを選択しながら、しきい値をできるだけ厳しくします。理想的には、選択したコロニーの間にいくらかのスペースがありますが、ソフトウェアはブロブをある程度セグメント化することができます。しきい値が満足のいく場合は、[アクションが必要]ダイアログボックスで [OK ]をクリックします。
3. 結果を調べるには、拡大してコロニー数をより詳しく調べます。[キャンセル] をクリックすると、プラグインが中止されます。[ OK] をクリックして続行します。
4. 最初の画像で、続行するか、セットアップメニューに戻るオプション(たとえば、最小コロニーサイズを変更する)が指定されていることを確認します。バッチ処理を続行するには、[ OK] をクリックします。次に、領収書と結果のテーブルを保持するフォルダーを選択します。「領収書」フォルダを使用するか、新しいフォルダを作成します。
5. 最初の画像の後、次の画像はデフォルトで前の設定と同じしきい値になります。[ OK ] をクリックしてこれらの設定を使用するか、設定を調整します。写真に一貫性があり、設定が正確な場合は、[アクションが必要]ダイアログボックスで [OK ]をクリックします。
  注:バッチ内のすべての画像が完了すると、結果テーブルは領収書と同じフォルダに自動的に保存されます。
6. ソフトウェアによって生成されたカウントレシートを確認し、カウントエラーを手動で修正します。ImageJ プラグインは統計的に正確ですが、エラーが発生します。領収書を証明して外れ値を調べ、ミスカウントを特定します。ソフトウェアは、CFUデータをレシートと同じフォルダに.csvファイルとして保存します。
ユーザーが好むソフトウェアを使用してデータを分析します。

結果

コロニー形成アッセイを使用した96ウェルプレートフォーマットでの数百匹の個々のハエのCFUの列挙
多くの個々のハエの微生物叢の構成を理解するために、付属のプロトコルを使用してCFUを測定し、存在する種、コロニーに生息するハエの割合、および各ハエの細菌の絶対存在量を特定できました。微生物叢組成で観察された個人間の大きな変動の理由はよく理解されておらず、コロニー形成の統計的分布を定量化することは、この変動を研究するのに役立ちます^36,37。かなりの数の生物学的複製を得るために、CFUカウントを使用して多くの個々のハエの微生物の存在量を定量するためのハイスループットパイプラインが開発されました(図1A)。

CFUの最終的な定量は、表面滅菌、細菌の消費からの時間、腸からの一過性細菌のクリアランスなどの要因など、分析前のハエの処理方法によって影響を受ける可能性があります。まず、ショウジョウバエの共生細菌種L. plantarum(Lp;Obadia et ^al.36のLp株WFを参照)に焦点を当て、ハエに10~10⁵ CFUのLpを与え、バイアルあたり25匹のハエのグループで飼育した。これらのハエは、同じバイアルに3日間保管するか、毎日新鮮な滅菌食品に移しました(図1B)。次に、未移送のハエをエタノールで洗浄して表面の細菌を除去する(洗浄)か、洗浄しない(未洗浄)かのいずれかでした。洗浄は、測定された総CFUの有意な減少をもたらし(図1B)、これらの高度に制御された接種条件下では、ハエの表面が3日間で細菌によって有意にコロニー形成されないことを示しています。ハエの他のグループは、食物の成長による細菌の蓄積を減らすために毎日移動されました(転送)。さらに、グループをサンプリング前に4時間生鮮食品に移すか(ポストトランスファー)、または滅菌寒天水のみを入れたバイアルに4時間入れ(クリア)、一時的に摂取した微生物を腸から除去できるようにしました。より厳密なコロニー形成測定を提供するためのこれらの各ステップは、エタノールでの表面洗浄を除いて、ハエのCFUの存在量の統計的に有意な減少をもたらした。測定前の4時間、無菌食品(移管後)または寒天水(クリア)に移すと、見分けがつかない効果が得られ、測定の4時間前に無菌状態に移すと細菌負荷が軽減されることが示されました。この結果は、ハエ腸内の一部の腸内細菌は一過性であり、他の細菌はより安定に関連しているという解釈と一致しています³⁵。Lpの存在量は、クリアされたハエの1 x 10 4.3 CFU/フライから、洗浄されていないハエの1 x 10^4.9 CFUの範囲でした(n = 724ハエ)。

次に、ハエの腸にコロニーを形成するグラム陰性菌であるアセトバクター・インドネシアエンシス(Ai)を用いて同様のアッセイを行った(図1C;Obadia et al.36の株Ai SB003を参照)。 Lpコロニー化されたハエと同様に、表面滅菌はCFUの有意な減少をもたらしませんでした。同様に、無菌食品への毎日の移動は細菌負荷を大幅に減少させ、均質化前の4時間の無菌条件への移動は細菌負荷のさらなる減少をもたらした。Aiの存在量は、クリアされたハエの1 x 10^4.7 CFU/フライから、洗浄されていないハエの1 x 10^5.0 CFUの範囲でした(n = 528ハエ)。したがって、腸内細菌の正確な定量は、移植日を含む移入の頻度に依存する。エタノール中で洗浄することによって外部細菌負荷を除去することは有意な効果を有しなかったが、異なる細菌株または異なる培養条件に対してより有意な効果が観察され得る。これらの要因は実験的に制御する必要があります。

CFUカウントに対する均質化法の潜在的な影響もテストされました。ハエは、100 μLのPBS中に0.5 μmのガラスビーズを含むビーズビーターを使用して均質化され、細菌細胞の生存率を低下させる可能性がありました。まず、培養液からのLp細菌の懸濁液をPBSで調製し、次に播種してCFUをポジティブコントロールとしてカウントしました。同じ培養物をビーズビータープレートに入れ、(i)ビーズでホモジナイズ、(ii)ビーズおよび無菌フライでホモジナイズ、または(iii)ビーズなしでPBSでホモジナイズした(図1D)。ハエがいたときのビーズの均質化は、溶液中の生細胞の存在量に大きな影響を与えませんでしたが、ハエの不在下での細菌の均質化は、かなりの数の細菌細胞を殺しました。ビーズを含まないPBSでのホモジナイズも、生細胞の数を大幅に減少させました。同様に、Aiの生存率は、ハエの存在下でホモジナイズした場合に維持されましたが、ハエなしでホモジナイズすると、溶液中の生細胞の数が減少しました(図1E)。これらの結果は、ハエ組織がホモジナイズ中にビーズによって破壊されるのから細菌を保護することを示しています。ただし、図1Dおよび図1Eの実験は、ウェルあたり10個を超える^8CFUを使用して実行されました。実際には、1ウェルあたり~10⁶細胞以下のウェルは、ビーズをフライなしで使用した場合、細胞損失がほとんど見られないことがわかりました。ビーズビートの途中でプレートを氷上で冷却すると、細胞の生存率も向上します。これらの結果の重要性は、読者がこれらの潜在的な問題を認識し、特定のユースケースに適したコントロールを設計する必要があることです。

ハイスループットCFU定量のためのスポットプレーティング96ウェルプレートの精度
目標は数百から数千の個々のハエのCFU存在量を測定することであるため、従来のスプレッドメッキ法は法外に時間と材料集約的です。スポットメッキは、CFUの成長と列挙のための効果的かつ効率的な方法です^19,31。スポットプレーティング法では、96チャンネルのピペッターを使用して、長方形のトレイプレートで調製した培地に2 μLの細菌懸濁液を分注します(図2A)。各スポットは1つのサンプルの細菌負荷を表すため、1枚のプレートで96匹のハエを分析できます(図2B)。スポットプレーティングの精度は、両方の方法でまったく同じ0.0001 ODのLp懸濁液を使用して成長プレートを接種することにより、従来のメッキと比較されました。懸濁液をPBS中で5回連続希釈して2倍にした。直接比較として、50 μLの接種材料を個々の丸いプレートに広げるか、2 μLのスポットを長方形のMRSプレートに作成しました。次いで、プレートをコロニーが計数可能になるまで30°Cでインキュベートした。得られた各希釈液のCFUカウントを使用して、懸濁液の元の濃度を計算し、比較した(図2C)。50〜500 CFUの丸板をコントロールとしてカウントしました。高スループットと従来の丸型めっき法の間に有意差は見られませんでした。

コロニーの密度はそれらの成長と定量に影響を与える可能性があるため、最終カウントに対するCFU密度の影響がテストされました。スポットあたり2〜25コロニーのスポットは、従来の丸板法と比較して最終カウントに差を示さなかった(図2C)。平均35コロニーのスポットは、対照スプレッドプレートよりもわずかに低い歪みの結果を生み出しました(図2C; p = 0.0017)。個々のスポットの写真を詳しく調べると、このスキューは密集したスポットでコロニーが重なっているためであることが示されました。スポットあたり平均11コロニーのスポットに基づく測定は、スプレッドプレートに基づく濃度に最も近い濃度をもたらしました(図2C;スプレッドプレート:平均= 1 x 10^4.4 CFU;SD = 0.086 vs. 11の平均コロニーを持つスポット: 平均 = 1 x 10^4.4 CFU;SD = 0.12, p = 0.42, ウェルチのt検定)。

白色光または蛍光のいずれかを備えた特殊な写真プラットフォームを使用して、定量化用の高品質画像を生成
ハイスループットのスポットプレーティングは、自然に多数のターゲット領域を生成し、正確にカウントする必要があります。高品質の写真を使用して、データを文書化し、CFUのカウントを容易にすることができます。市販の材料を使用して、堅牢でわかりやすい写真プラットフォームが開発されました(図3A)。デジタルカメラは、FluoroBoxと呼ばれるカスタムビルドのライトボックスの上部にあるブラケットに取り付けられ、プレートの中心に垂直に真下に向けられました。着色された発光フィルターは、フィルタースライダーを使用してレンズの前に任意に配置されました。ライトシールドは、下のLEDストリップからの直接光を遮断することにより、レンズフレアを防ぎました。LEDストリップは、プレートのまぶしさを防ぐために、上ではなく側面からプレートを照らしました。白色光に加えて、単色の青色および緑色のLEDを使用して、それぞれ緑色および赤色の蛍光タンパク質を励起した。プレートは引き出しのプレートホルダーで所定の位置に保持され、引き出しにはプレートを簡単に挿入できるように引き出しスライダーが装備されていました。完全な設計は、 補足ファイル 1 および 補足ファイル 2 で入手できます。

Lpコロニーのスポットプレートの写真は、白色光LEDとデジタルカメラを使用して撮影され、コロニーを数え、さまざまな色と形態を区別するのに役立ちます(図3B)。照明強度が均一であることを検証するために、寒天の背景強度をプレート写真のさまざまな領域で測定しました(図3C)。コロニーがバックグラウンドと明確に区別できることを実証するために、プレートの異なる部分上の10の異なるコロニーの直径にわたる強度を測定し、バックグラウンドよりも約~300%高いことがわかりました(図3C)。プレートにmCherry蛍光タンパク質発現プラスミドと、プラスミドを含まないLpを接種したため、コロニーはmCherry陽性またはmCherry陰性のいずれかでした。これら2種類のコロニーを区別するために、緑色のLEDライト(515-525 nm)と赤色のフィルター(Tiffen #29)を備えた同じカメラを使用してプレートを撮影し、mCherry陽性コロニーを蛍光させました(図3D)。mCherry陽性とmCherry陰性の間の強度の差は、コロニーのサンプル(n=10コロニー)にわたる強度を測定することによって定量化した。mCherry陽性コロニーは、mCherry陰性コロニーよりも~1,000%高い強度であった(図3E)。GFPを発現するAiのコロニーおよび蛍光を発現しないAiのコロニーを、青色LEDライト(465-475nm)および緑色フィルター(Tiffen #58)を用いて撮影した(図3F)。GFP陽性コロニーは、GFP陰性よりも200%高い強度を示した(図3G)。

カスタム ImageJ プラグイン Count-On-It を使用したスポットプレート上の CFU の自動カウント
写真だけでコロニーのカウントに役立ちます(たとえば、データの保存、データの共有、ズームイン、オーバーレイのマーキング、色の分離など)。ただし、何百ものスポットの結果を手動でカウントして整理する作業は、面倒で時間がかかり、最終的なカウントに人間と人間の違いが生じやすい場合があります。カウントプロセスを高速化し、カウントの再現性を標準化するために、Count-On-Itと呼ばれる特殊なImageJプラグインが開発されました(図4A)。このプラグインは、寒天プレート上のCFUの正確な半自動カウントを可能にします。ユーザーは、最初に追加のCroptacularプラグインを使用して画像をトリミングおよび調整することにより、カウント用の画像を準備します。写真はオプションでバッチ処理でき、プレートごとにしきい値を調整できます。他のいくつかのオプションを使用すると、光の波長(RGB画像)の調整、コロニーサイズの範囲(ピクセル単位)の設定、最大アスペクト比の変更、アクティブな選択グリッドのサイズのカスタマイズなど、プレートカウントの精度を高めることができます。カウントオンイットは、各プレートがCFUカウントの列として表された結果のテーブルを出力します。また、オーバーレイを示す写真レシートを生成して、カウント結果を視覚的に文書化し、手動のエラー修正を支援します(図4B)。誤差は発生しますが、手動でカウントされたコロニーの数をこのプラグインを使用してカウントされたコロニーの数と比較すると(図4C)、関係は概ね同等であり、手動カウントと自動カウントの間の線形回帰は90%以上の精度で0.95の傾きを示しました(^R2 = 0.93)が、コロニー数が20を超えると誤差は増加しました。

Count-On-Itは、FluoroBoxの蛍光機能を使用して蛍光コロニーを個別にカウントするためにも使用できます。ソフトウェアプラグイン対手動によるmCherry陽性コロニー数(図4D)は、0.92の^R2を有していた(図4E)。同様に、ソフトウェアプラグインで計数したGFP陽性コロニー(図4F)は、手動と比較して^R2が0.90であった(図4G)。蛍光コロニーと非蛍光コロニーは単一のサンプル内で区別でき、コロニーのサイズと形状はさらに別々の亜集団を区別するために使用できます(図4H-K)。写真の領収書は、ユーザーがカウントの精度をすばやく確認し、エラーを手動で修正できる記録を提供します。図4C、E、G、I、Kでは、読者がメソッドの生の出力を確認できるように、カウント精度を向上させるために写真の領収書は使用されていません。図4Gのように、手動で1カウントすると21の自動カウントになるケースは、写真の領収書を使用してすばやく検出できます。この場合、プレートの端のグレアはコロニーとしてカウントされたブロブを作成しました。ユースケースごとに、高スループットカウントの前にソフトウェアプラグインの最適な設定を決定する必要があります。

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図1:コロニー形成アッセイは、96ウェルプレートフォーマットを使用して数百匹の個々のハエのCFUを測定します。 (A)プロトコルのセクションに記載されているように使用されるコロニー形成アッセイおよびハイスループット定量法の絵の概要。(B)コロニー形成アッセイ後のハエにおける ラクチプランティバチルスプランタルム (Lp)の存在量を、ハイスループットCFU定量法を用いて様々な条件下で測定した。ハエを同じバイアルに3日間保管し、次に均質化してメッキし(未洗浄)、プレーティング前にエタノールで洗浄し(洗浄)、毎日洗浄して移し(転送)、毎日移してからプレーティング前に滅菌食品に保管(ポストトランスファー)、または水のみでバイアルに4時間保持(クリア)しました(n = 合計724匹のハエ、3回の生物学的複製、~72匹のハエの治療あたり)。(C)(B)と同様のアッセイをアセト バクター・インドネシアエンシス (Ai)を用いて行った(n=528匹のハエ)。(D) Lp 細菌懸濁液をPBS中で調製し、次いでCFUをカウントするためにプレーティングするか、またはビーズ叩いて最初に均質化するか、無菌(GF)フライと組み合わせてビーズ叩くか、またはビーズまたはフライなしでビーズビーター上で振盪する(n = 236サンプルウェル)。(E)ホモジナイズ後の Ai 生存率は、(D)(n=282サンプルウェル)と同様の方法で試験した。パネルの統計的有意性(B-E)は、クラスカル-ウォリス検定とそれに続くボンフェローニの多重比較補正によるペアワイズウィルコクソン順位和検定を使用して計算されました。ボックスは四分位範囲を与えます。線は中央値を示します。ひげは全範囲を与えます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:ハイスループットCFU定量のためのスポットプレーティング96ウェルプレートの精度。 (A)96チャンネルピペッターを使用して、長方形トレイプレートで調製した培地に2 μLを分注するスポットプレーティング。(B) Lp コロニーの96スポットを有するMRS寒天成長プレート。(C)従来の丸板(n = 24プレート)からのCFUカウントに基づく Lp 懸濁液の濃度と、スポットプレートからのCFUカウントに基づく濃度(n = 680スポット)を連続希釈し、スポットあたりの平均コロニー数で配置しました(3つの複製プレートの単一希釈係数ごとに~48スポットをカウントしました)。各データポイントはスポットあたりの正確なコロニーを表し、各列はその希釈の平均コロニーを表します。横の点線は、播種した培養液の計算CFU数を示す。緑色の輪郭のポイントは、従来の丸板の数を強調しています。赤で塗りつぶされたポイントは、2 μLスポットあたり11 CFUの最適なコロニー密度を強調しています。統計的有意性は、ボンフェローニの多重比較補正を用いて、各列の平均をスプレッドプレートコントロールカラムの平均と比較する通常の一元配置分散分析を使用して計算されました。ボックスは四分位範囲を与えます。線は中央値を示します。ひげは全範囲を与えます。**p < 0.01ns = 有意ではない。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:写真プラットフォームは、白色光または蛍光を使用してプレートの定量化可能な画像を生成します。 (A)フロロボックス設計の概要。(B)白色光を用いた Lp コロニーのスポットプレートの写真。(c)バックグラウンドの強度と比較した白色光下での単一コロニーの強度プロファイル(BKG)(n=10コロニー、破線は標準偏差を表す)。(D)(B)と同じスポットプレートの写真で、緑色光と赤色フィルターの単色を用いて、mCherry陽性Lp コロニーを選択した。(E)mCherry発光の有無にかかわらずコロニーの違いを示す単一コロニーの強度プロファイル。(F) Ai コロニーを含むスポットプレートの写真で、そのうちのいくつかはGFP標識を有する。(g)GFP陰性コロニーとGFP陽性コロニーの違いを示す単一コロニーの強度プロファイル。E、F、G:n=各プロットにつき10コロニー。コロニーの直径は約1.5 mmです。破線はSDです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:Count-On-It ImageJプラグインによるスポットプレートの正確なカウント。 (A) プラグイン設定ウィンドウのスクリーンショット。(B) プラグインは、ドキュメントカウントの領収書を生成し、エラー修正を支援します。 はめ込み： 各スポット領域でカウントされたコロニーの数とオーバーレイします。黄色のアウトラインは単一のコロニーがカウントされたことを示し、赤色は複数のコロニーがカウントされたことを示します。(C)白色光画像を使用したときにプラグイン(自動)を使用してカウントされたコロニーの数と比較して手動でカウントされたコロニーの数を示すプロットで、グラフ上の各ポイントは手動または自動でカウントされた単一のスポットを表します(フィットの傾き= 0.95、シアン線、1:1の線は赤で点線。R² = 0.93、ピアソンの相関係数、 p < 0.0001)。(D)フォトボックスの蛍光機能を用いてmCherry陽性コロニーを選択したときのプラグインからのフォトレシート画像。(E)赤色蛍光を使用した場合の自動法と比較した手動を使用してカウントされたmCherry陽性コロニーの数を示すプロット(フィットの傾き= 1.1、シアン線、1:1線は赤点線;^R2 = 0.92、ピアソンの相関係数、 p < 0.0001)。外れ値とエラーは、 E、G、I、Kの分析レシートを使用して修正されていないことに注意してください。(F)フォトボックスの緑色蛍光機能を使用してGFP陽性コロニーを選択し、プラグインで緑色チャネルを選択した場合のプラグインからのフォトレシート画像。(G)緑色蛍光照明を使用した場合の自動法と比較した手動を使用してカウントされたGFP陽性コロニーの数を示すプロット(フィットの傾き= 1.1、シアン線、1:1線は赤色の点線;^R2 = 0.90、ピアソン相関係数、 p < 0.0001)。(h)混合コロニー形態から選択されるmCherry陽性コロニーをプラグインで高い蛍光閾値を用いる。(I)赤色蛍光照明を使用した場合の自動法と比較した手動を使用してカウントされたmCherry陽性コロニーの数を示すプロット(フィットの傾き= 0.99;^R2 = 0.91、ピアソンの相関係数、 p < 0.0001)。(j)低蛍光閾値を用いた混合コロニー形態から選択されるmCherry陰性コロニー。(k)非蛍光コロニーを選択するために強度閾値を設定した場合の自動法と比較して、手動を使用してカウントされたmCherry陰性コロニーの数を示すプロット(フィットの傾き= 1.1;R² = 0.85、ピアソンの相関係数、 p < 0.0001)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:フルオロボックスの組み立て手順。 このファイルは、ビデオで使用される制御された照明ボックスの構築を段階的に読者に説明します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:フルオロボックスアクリルレーザーカット。 このファイルは、制御された照明ボックスのアクリル片をレーザーカットするためのカットテンプレートを提供します。ファイルは、レーザーカットされたアクリルベンダーに送信できます。このプロトコルで使用されているベンダーの 材料表 を参照してください。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:ソフトウェアの説明。 このファイルは、このプロトコルで提供されるCroptacularおよびCount-On-Itソフトウェアのインストールと使用法を段階的に説明します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル1:ビーズ測定トレイ用の3D印刷コード (S1-bead-measurer.stl)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル2:長方形プレートフォトクロッパーImageJプラグイン (Croptacular_.ijm)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル3:丸板フォトクロッパープラグイン (Circus_.ijm)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル4:長方形プレート96スポットカウンタープラグイン (Gridiron_.ijm)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで紹介する詳細な手法により、CFUカウント実験で評価できるサンプル数を>100倍に増やすことができます。この技術は、ショウジョウバエ^12,35,36におけるマイクロバイオーム実験の既存の方法を、⁹⁶ウェルプレートフォーマットを使用して個々のハエをアッセイすることにより進歩させます。さらに、より効率的なスポットプレーティング法¹⁹^、³¹および写真およびコロニー計数プラットフォームを備えた自動化されたワークフローを適用する。ショウジョウバエにとってのこの方法の意義は、実験を96ウェルプレートフォーマットに標準化し、CFUのハイスループット定量化を自動化して多数の生物学的複製を同時に処理できるようにすることです。

96ウェルプラットフォームは、移動頻度の増加と一過性細菌の「除去」が、平均存在量とサンプル間の変動の両方を大幅に減少させることを示しており(図1B、C)、この改善されたプロトコルの厳密さを示しています。コハウジングハエの1つの制限は、ハエ間の細菌の水平移動です。提案された解決策は、ハエを96ウェルプレートフォーマット(Whole Animal Feeding Flat³⁸など)に個別に保管することです。

ハエをエタノールで洗浄した場合、細菌量の有意な減少は観察されなかったが、これらのハエは外部細菌の存在下で3日間しか飼育されていなかった。長期間収容すると、より大きな細菌負荷が蓄積する可能性があります³⁹。したがって、エタノールでの洗浄が依然として推奨されます。

ハエを96ウェルプレートに移すことは、ワークフローを設定するための重要な最初のステップです(図1A)。ハエが洗浄されると、それらは一度に1つずつウェルに分配されます。プレートチャートは、この段階で、各ウェルにどの条件が存在するかを記録し、「ハエが失われた」などのメモを追加するのに役立ちます。均質化は、いくつかの重要な注意点があるもう一つの重要なステップです。バクテリアはハエの存在下で均質化プロセスを生き延び(図1D、E)、おそらくこの原理はバクテリアがハエの腸内にいる場合にも当てはまります。しかし、細菌はビーズビータープレートのみで均質化されると死滅し、均質化が特定の状況で細菌細胞を殺すことができることを実証しており、例えば解剖された腸を均質化する場合に重要であり得る制限。特に、均質化時のCFUの損失はサンプル中のCFUの数に依存し、ウェルあたり~10⁵ CFUを使用した場合の損失は最小限に抑えられます。CFUのさらなる保存は、均質化を途中で停止し、氷上でプレートを冷却することによって達成することができる。

このプロトコルでは、既知の数のCFUを無菌ハエと混合した対照実験に基づいて均質化を5分間実行し、これはハエ菌に対して経験的に機能しました。叩解が少ないとフライパーツが大きくなり、ピペッティングが妨げられますが、均質化時間が~10分と大幅に長くなると、CFUカウントの変動が大きくなります。円錐プレートウェルの体積と角度の付いた形状が小さいと、円筒形の2 mLチューブと比較してビーズの叩解効率が低下することが観察されました。この一般的なアプローチには、どの細菌株、どのビーズビート容器、どのビーズ、どのハエ遺伝子型が使用されるかなど、多くのバリエーションが可能です。個々のユーザーケースでは、ポジティブコントロールを使用してアプローチを確立する必要があります。

スポットプレーティング法は、PBS中の L. plantarum WFの1:2希釈をMRSプレートにスポットし、30°Cで2日間インキュベートするという特定の方法で採用されました(より小さなコロニーサイズを生成するために、より短いインキュベーション時間を実施できます)。この方法では、主にビーズビーターと96チャンネルピペッター(図2A)などの装置への先行投資が必要であり、希釈シリーズとスポットメッキの両方が必要です。ただし、スロット付きピンを備えた96ウェルプレートリプリケーターなど、より安価なオプションが利用可能です。希釈シリーズは、CFU計数結果の精度に影響を与える重要なステップです。故障モードに関しては、フライ部品やガラスビーズでピペットチップを詰まらせたり、ピペットチップがピペッターに適切にシールされなかったり、その他の理由で故障したりする可能性があります。これらすべての問題は、影響を受ける井戸の過小評価をもたらすため、監視する必要があります。希釈シリーズの各ステップでの適切な混合も重要です。各希釈液は、プレートをプレートシェーカーに置くか、チップをすすぐのにも役立つ15〜20回上下にピペッティングすることによって完全に混合する必要があります。最も希薄なプレートから最も希薄でないプレートまでスポッティングすることで、チップを希釈シリーズ全体に再利用できます。1:2希釈では、2〜25コロニーの範囲でカウントが正確であり、桁違いにまたがります(図2C)。したがって、1:10希釈は時間と材料を節約できます。利用できる別の変数はインキュベーション時間であり、これはより小さなコロニーを生成するように調整することができ、したがって、隣接するコロニーの合流を防ぐことによってカウント可能なスポットの範囲を広げることができる。

プレートの高品質な写真は、CFUが分析され、無期限にアーカイブできる生のソースデータになるため、不可欠です。FluoroBoxは、寒天表面のまぶしさを最小限に抑える均一な光強度でプレートの写真を生成するように設計されています。さらに、この設計は、単色LEDライトとカラーフォトフィルターを使用して蛍光コロニーを選択的に撮影することができます(図3A)。照明とカメラの設定を制御したFluoroBoxのようなセットアップを構築することで、自動分析に重要なCFU画像の再現性を大幅に向上させることができます。コロニーの形態、蛍光強度、コロニーの成長に対する時間または密度の影響は、写真を使用して分析できる特性のほんの一部です。フォトボックスは、蛍光細菌を使用しない場合、カラーフィルターと単色ライトなしで構築できるため、コストと複雑さが軽減されます。ラボで異なる蛍光色素を使用する場合は、ここで推奨されているものの代わりに異なる励起光と発光フィルターを使用できます。アプリを使用してWiFi経由でタブレットに接続されているカメラは、揺れを防ぐための自動シャッター機能とデータ転送の容易さの両方に役立ちます。画像はタブレットに転送してから、ワイヤレスファイル転送ソフトウェアを使用してラップトップに転送できます。これらの機能を備えた推奨カメラは、 材料の表に示されています。

カウントオンイットは、ImageJで書かれたプラグインです。自動CFU計数ソフトウェアは、プレート画像を均一な96ウェルグリッドに分割し、各グリッドセルのコロニーをカウントし、結果を単純なスプレッドシートにバッチ処理します。プレート上と写真内のスポットグリッドの位置は常に変動するため、ユーザーはCroptacularプラグインを使用してグリッドを写真に手動で適合させる必要があります。これは、グレアのあるプレートエッジ近くの領域を除外するのにも役立ちます。しきい値の設定は、画像から最も正確なCFUカウントを取得するための鍵です。しきい値の設定が高すぎると、コロニーがマージされます。しきい値の設定が低すぎると、コロニーは除外されます。閾値が設定されると、マクロはガウスぼかしを適用してエッジを柔らかくし、エイリアシングを減らし、流域フィルターは重なり合うコロニーを分割し、ブロブはパーティクルの分析を使用してカウントされます。

時々、コロニーの密度が特定の場所で高すぎる。Count-On-Itは、これに対処する方法を提供します。部分的に結合したコロニーを有するグリッドセル内のコロニー数を推定するために、最初にプレート全体からの円形ブロブの平均面積を_Cavgとする。次に、ブロブA₁の面積を円形ブロブA_の平均面積1 / C_平均で割る_。この数値は最も近い整数に丸められ、BLOB 内のコロニー数の推定値になります。この関数は、しきい値がカウント結果に影響を与える可能性がある理由の 1 つです: 相対的な平均コロニー面積とマージされたブロブ面積は、しきい値がマージされたブロブにどのように影響したかによって異なります。

提示されたメソッドにはいくつかの制限があります。これには、96ウェルプレートから液体媒体を正確に分注するための機器の必要性が含まれます。この装置は、96チャンネルのピペッターまたはスロット付きレプリケーターピンツールのいずれかで、入手に数千ドルかかる可能性があります。より安価な代替手段は存在しますが、精度は低くなります。カウントオンイット による 自動カウントには、いくつかの制限もあります。たとえば、混合母集団の 2 つのコロニータイプがサイズのみに基づいて区切られている場合、BLOB カウントではコロニーを正しいタイプに割り当てることができません。この場合、ブロブのあるスポットはカウントから削除する必要があります。形態学に基づくコロニーのさらなる分化は、現在実施されていない方法の貴重な拡張となるであろう。菌株特異的栄養素や抗生物質などの選択培地を使用することで、複雑な画像解析の必要性が簡素化されます。

ショウジョウバエ実験を96ウェルプレートで維持すると、1回の実験でテストできるサンプル数と条件が増え、 ショウジョウバエと細菌の関連表現型のハイスループットスクリーニングが容易になります。この方法は、選択培地を使用して複雑な混合物中の多くの細菌株を区別することにより拡張できると考えています。この方法は、ハエの微生物叢の研究に限定されない。CFUの定量化は、飲料水中の大腸菌群数から病原体の特定まで、微生物学の多くのアプリケーションで一般的です。ここで紹介するCFUメッキシステムは、ハイスループットスクリーンだけでなく、結果の取得、処理、保存、および配信を自動化します。

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

Kerwyn Casey Huang博士、Andrés Aranda-Díaz博士、Ted Cooper、およびLudington Labのメンバーは、このプロトコルの開発に関する貴重な意見を提供しました。資金は、NSF IOS助成金2032985、NIH助成金DP5OD017851、カナダカーネギー研究所助成金、およびカーネギー科学研究所の基金によって提供されました。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bead beating and spot plating
Fly vials	Genesee	32-121	autoclavable
Fly vial stoppers	Genesee	59-201	autoclavable
Hand Applicator	3M	3M PA1
Heat Sealer	Eppendorf	5390
Mini-Beadbeater 96	BioSpec	1001
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm	BioSpec	11079105
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner	Labnet	LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor	Mettler Toledo	30296705	Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural	USA scientific	1402-9220	Must be polypropylene for heat sealer
Thermal Bond Heat Seal Foil	4titude	4ti-0591	Keep sterile
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile	SPL Life Sciences	31001	For making rectangular agar plates
Photobox construction
¼”-20 X ½” Bolts (X2)	Amazon	ASIN: B07BP1WR3H	To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.
¼”-20 x ½” Connector Nut	Amazon	UPC: 799862376780	AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.
¼”-20 x ¾” bolts (X3)	Amazon	ASIN: B003QZSZY4	For the plate holder. Brand not important.
1/8” x ½” washer	Amazon	UPC: 611982484599	Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft	Superbrightleds.com	WP18-2
22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4	Superbrightleds.com	WN-R2210
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3	Superbrightleds.com	SCFP-2218
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3	Superbrightleds.com	SBL-MA2P-8-2
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3	Superbrightleds.com	SBL-MA2P-8-1
6” drawer handle	Amazon	ASIN: B07Z331P99	Any drawer handle should work.
6” Drawer slides	Btibpse	UPC: 712243424979	Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.
8-32 x ½” Cap Nuts (x4)	Amazon	ASIN: B00HYLZB98	Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4)	Amazon	ASIN: B07KX9T7NF	To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
Acrylic Glue	SCIGRIP	Ean: 7844908489337	SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle
Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long	Superbrightleds.com	CT-B04-10
Camera L-Bracket	WLPREOE, Vikerer, Unbranded	ASIN: B09X46YKQZ	The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Canon T series camera for tethering option OR	Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc..	1894C002	The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters	Superbrightleds.com	STN-BBLU-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters	Superbrightleds.com	STN-BGRE-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters	Superbrightleds.com	STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Drill with ¼”, 1/8” drill bits	Black & Decker	‎BDCDD12PK	Brand not important.
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte	Rustoleum	331182	Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.
Laser Cut Acrylic Walls	Big Blue Saw	www.bigbluesaw.com	Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera
Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt	Superbrightleds.com	LPV-20-24
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer	Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.	DMC-ZS100K	Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good.
Quick Release Plate	Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch	ASIN: B07417F21D	Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Rubber Bands, Assorted sizes	BAZIC Products	Alliance Rubber 26649	Rubber bands go on the plate holder. Brand not important.
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4	Superbrightleds.com	CTMB-20
SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3	Superbrightleds.com	RRS-SP
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm	Tiffen	72R29
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm	Tiffen	7258
Software
ImageJ64	https://imagej.net/downloads	N/A	Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSX	Apple	N/A	Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it.
Unix	BSD	N/A	64 bit
Windows	Microsoft	N/A	64 bit