Schnelle Koloniebildung im 96-Well-Plattenformat aufgebracht auf das Drosophila-Mikrobiom

Zusammenfassung

Diese Methode quantifiziert die mikrobielle Häufigkeit unter Verwendung eines 96-Well-Plattenformats für Plattenkoloniebildungseinheiten (CFUs) und wird auf das Drosophila-Mikrobiom in ganzen Fliegenhomogenatproben angewendet. CFUs werden mit einer hier bereitgestellten automatisierten Bildanalysesoftware gezählt.

Zusammenfassung

Der Darm von Tieren wird von kommensalen Mikroben besiedelt, die die Entwicklung, die Gesundheit und das Verhalten des Wirts beeinflussen. Eine genaue Quantifizierung der Kolonisation ist unerlässlich, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Mikrobe zu untersuchen, um sowohl die mikrobielle Zusammensetzung zu validieren als auch ihre Auswirkungen zu untersuchen. Drosophila melanogaster, das eine geringe native mikrobielle Vielfalt aufweist und mit definierter mikrobieller Zusammensetzung wirtschaftlich zu züchten ist, hat sich als Modellorganismus für die Untersuchung des Darmmikrobioms herausgestellt. Die Analyse des Mikrobioms eines einzelnen Organismus erfordert die Identifizierung der vorhandenen mikrobiellen Arten und die Quantifizierung ihrer absoluten Häufigkeit. Dieser Artikel stellt eine Methode zur Analyse einer großen Anzahl einzelner Fliegenmikrobiome vor. Die Fliegen werden in 96-Well-Platten vorbereitet, was die Handhabung einer großen Anzahl von Proben gleichzeitig ermöglicht. Die mikrobielle Häufigkeit wird quantifiziert, indem bis zu 96 ganze Fliegenhomogenate auf einer einzigen Agarplatte an einer Reihe von Flecken plattiert und dann die koloniebildenden Einheiten (CFUs) gezählt werden, die an jedem Punkt wachsen. Dieses Beschichtungssystem ist mit einer automatisierten CFU-Quantifizierungsplattform gepaart, die Fotografie der Platten, die Differenzierung fluoreszierender Kolonien und die automatisierte Zählung der Kolonien mit einem ImageJ-Plugin umfasst. Die Vorteile sind, dass (i) diese Methode empfindlich genug ist, um Unterschiede zwischen Behandlungen zu erkennen, (ii) die Spot-Plating-Methode so genau ist wie herkömmliche Beschichtungsmethoden und (iii) der automatisierte Zählprozess genau und schneller ist als die manuelle Zählung. Der hier vorgestellte Workflow ermöglicht die Hochdurchsatz-Quantifizierung von CFUs in einer großen Anzahl von Replikaten und kann auf andere mikrobiologische Studiensysteme einschließlich in vitro und anderen Kleintiermodellen angewendet werden.

Einleitung

Die Beziehung zwischen intestinalen Mikrobiota und ihrem tierischen Wirt steht zunehmend im Vordergrund biologischer Studien¹, die zeigen, dass die Stammzusammensetzung des Mikrobioms für die Wirtsphysiologie wichtig ist ^2,3,4. Das Tempo der Entdeckung wurde durch Störfaktoren wie hohe natürliche interindividuelle Variation und hohe Vielfalt kolonisierender Bakterien begrenzt ^5,6,7. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, hat sich aufgrund ihres von Natur aus wenig diversitätsarmen Mikrobioms, der einfachen Handhabung und der robusten Wirtsgenetik als vielversprechendes Modell erwiesen 8,9,10,11. Fliegen können keimfrei gemacht und wieder mit einer definierten Mikrobiota^{assoziiert werden 12}, und es wurde gezeigt, dass die Flora die physiologischen Merkmale der Fliegen^{beeinflusst 13,14}. Die angeborene Flora besteht aus einer begrenzten Anzahl von Bakterien, die alle kultivierbar sind, und nahe Verwandte davon sind auch endogen für den Darm von Säugetieren, einschließlich Laktobazillen, Proteobakterien und Enterokokken¹⁵.

Die Untersuchung des Einflusses des Mikrobioms auf Wirtsmerkmale erfordert eine Quantifizierung des Mikrobioms sowohl in Bezug auf die vorhandenen Arten als auch auf ihre absolute Häufigkeit¹⁶. Die vorherrschenden Methoden zur Analyse des Fliegenmikrobioms sind koloniebildende Einheit (CFU)^{Zählungen 17}, 16S rRNA-Genamplikonsequenzierung⁹ und qPCR des 16S rRNA-Gens¹⁸. KBE-Zahlen können ohne teure Reagenzien erhalten werden, und sie bestätigen die Lebensfähigkeit der Bakterienzellen¹⁹. Die 16S-Techniken einschließlich qPCR haben den Vorteil, dass taxonomische Identitäten von Mikroben unabhängig von ihren Wachstumsanforderungen oder Koloniemorphologien bestimmt werden können²⁰.

In Experimenten mit Fliegen mit einem definierten Mikrobiom bekannter Bakterien (gnotobiotische Fliegen) haben die KBE-Zählungen besondere Vorteile gegenüber der Sequenzierung²¹. Die Sequenzierung ist teuer und erfordert DNA-Extraktion, PCR-basierte Bibliotheksvorbereitung und Hochdurchsatzsequenzierung, um relative Häufigkeiten zu erhalten²². Aufgrund der hohen Kosten müssen Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden in der Regel in großen Mengen durchgeführt werden, um den Preis pro Probe zu senken²³. Weitere Methoden wie qPCR sind erforderlich, um absolute Häufigkeiten¹⁶ zu erhalten. Im Gegensatz dazu sind die KBE-Zahlen schnell und billig und geben die absolute Anzahl lebensfähiger Zellen an. Drosophila⁸ und andere kleine Mikrobiommodelle 24, einschließlich des Wurms, Caenorhabditis elegans 25,26, und des Larvenzebrafisches, Danio rerio, gnotobiotisch gezüchtet²⁷, haben eine begrenzte Anzahl von Bakterien^, die bekannte Wachstumsmerkmale^{aufweisen 28}. In diesen Fällen, insbesondere bei gnotobiotischen Tieren, kann die KBE-Zählung alle Bakterienarten innerhalb der Multispezies-Darmgemeinschaften^{unterscheiden 21,27,29}. Hochdurchsatz-CFU-Zählmethoden würden die Kosteneffizienz und Geschwindigkeit der Messung der Zusammensetzung des Mikrobioms weiter verbessern und könnten auf viele andere mikrobiologische Experimente angewendet werden.

Die Zählung von KBE durch serielle Verdünnung einer Bakteriensuspension auf Agar-basierten Wachstumsmedien ist eine Standardmethode im Bereich der Mikrobiologie. Die Völker, die auf den Platten wachsen, werden dann manuell gezählt. Die Verdünnungen ermöglichen es dem Forscher, eine Dichte von Kolonien auszuwählen, die zählbar ist (z. B. ~ 100 KBE pro Platte), was bedeutet, dass die Kolonien nicht ineinander wachsen und in einer angemessenen Zeit gezählt werden können. Die meisten Mikrobiologen verwenden im Wesentlichen die gleiche KBE-Zählmethode, die vor 140 Jahren im Labor von Robert Koch entwickelt wurde, und für viele Anwendungen ist diese Methode immer noch ausreichend. Ein Problem ergibt sich jedoch, wenn versucht wird, eine große Anzahl von Stichproben zu quantifizieren. Eine einzelne Probe kann 1 bis 10 serielle Verdünnungen der Probe erfordern, um zählbare CFUs zu erhalten, so dass Experimente mit mehr als ein paar Dutzend Proben anstrengend werden. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die Effizienz der CFU-Enumeration zu erhöhen. Die automatisierte Spiralbeschichtung macht serielle Verdünnungen³⁰ überflüssig, so dass nur eine Platte für die CFU-Zählung erforderlich ist, aber die Zeit für die Beschichtung der Probe verlängert wird. Single Plate-Serial Dilution Spotting (SP-SDS) ermöglicht CFU-Schätzungen von weniger Platten pro Probe³¹. Diese Methoden stellen eine Verbesserung gegenüber der traditionellen Streumethode dar, erfordern jedoch immer noch die Handhabung und Beschichtung von Bakterienproben einzeln und sind daher nicht ideal für einen hohen Durchsatz. Die Handhabung von Proben in 96-Well-Platten und die Punktbeschichtung dieser 96 Proben auf rechteckigen Agarplatten verbessert den Durchsatz von Proben¹⁹ erheblich.

Mikrobiome bestehen typischerweise aus mehreren Stämmen und Spezies. Während Arten oft durch Koloniemorphologie oder Wachstumsmedien unterschieden werden können, kann Fluoreszenz verwendet werden, um verschiedene Arten von Bakterien und ihre Wachstumsmerkmale weiter zu unterscheiden³². Zum Beispiel können verschiedene Genotypen derselben Art mit verschiedenen genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen markiert werden. Plattenbildgebungsmethoden, die Fluoreszenz beinhalten, ermöglichen es Forschern, diese genetischen Techniken in CFU-basierten Assays zu nutzen³². Die Einbeziehung von Fluoreszenz in Hochdurchsatz-CFU-Zählmethoden würde ihren Nutzen weiter verbessern.

Das manuelle Zählen von CFUs wird umständlich, wenn eine große Anzahl von Proben vorhanden ist. Die automatisierte Zählung von KBE kann durch Fotografieren der Platte und Verarbeitung des Bildes mit einer speziellen Software³³ durchgeführt werden. Sieuwerts et al. kombinierten die verbesserte Beschichtungseffizienz der Punktbeschichtung mit automatisierter Koloniezählung unter Verwendung herkömmlicher Digitalfotografie und ImageJ-Software¹⁹.

Eine Hochdurchsatzmethode zum Screening der Phänotypen spezifischer Mikroben- und Wirtsverbände würde Studien zur Zusammenführung von Mikrobiomgemeinschaften und den Auswirkungen auf die Gesundheit und Fitness des Wirts unterstützen. Für Studien des Drosophila-Mikrobioms würde eine mikrobiologische Hochdurchsatzplattform die Handhabung von Fliegenproben im 96-Well-Plattenformat, die Fliegenlyse ohne bakterielle Lyse, die Effizienz der Spot-Plattierung, die Fähigkeit, Fluoreszenz zu verwenden und mehrere Fluorophore zu unterscheiden, eine kontrollierte Lichtumgebung für die reproduzierbare Bildgebung von CFU-Platten und eine zuverlässige automatisierte Koloniezählsoftware umfassen. Dieser Artikel beschreibt eine für die Bestimmung von CFUs in gnotobiotischen Fliegen optimierte Methode, die einfach, schnell und automatisiert ist. Dieses Protokoll skizziert einen neuartigen Workflow, der die besten bisher veröffentlichten Methoden kombiniert und für die Erforschung des Darmmikrobioms bei Drosophila optimiert ist.

Protokoll

1. Fliegenkolonisierung

HINWEIS: Diese Methode eignet sich für die quantitative Analyse von Fliegen mit einem kultivierbaren Darmmikrobiom durch Wachstumsplattierung von CFUs. Ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht gnotobiotischer Fliegen wurde zuvor veröffentlicht¹².

1. Stellen Sie eine stabile Besiedlung durch eine kommensale Bakterienart her.
   1. Bereiten Sie eine frische Bakterienkultur vor, pelletieren Sie durch Zentrifugation bei 400 x g für 3 min bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS auf einen OD600 von 1,0. Für dieses Protokoll wurde Lactiplantibacillus plantarum (früher bekannt als Lactobacillus plantarum) über Nacht auf OD600 von 2,0 angebaut.
   2. In einer Durchstechflasche mit der Fliege 100 μl auf das Futter pipettieren (siehe Materialtabelle). Gleichmäßig verteilen und die Flüssigkeit 15-30 min einziehen lassen.
   3. 20 keimfreie Fliegen werden mit der Standard-Fläschchen-zu-Fläschchen-Flipping-Technik³⁴ in diese Durchstechflasche überführt. Jede Fliege frisst ungefähr die gleiche Menge der Bakteriendosis³⁵. Alternativ können keimfreie Eier hinzugefügt werden.
   4. Übertragen Sie die Fliegen täglich für 3 Tage in frisches steriles Futter. Tun Sie all dies in einer Biosicherheitswerkbank und verwenden Sie sterile Technik (Abbildung 1A-1).
2. Vor der Messung der CFU-Belastung die Fliegen für 4 h in eine Durchstechflasche mit sterilem Agarwasser geben, um vorübergehende Bakterien aus dem Darm zu entfernen. Die Agar-Wasser-Fläschchen bieten eine Feuchtigkeitsquelle für die Fliege, aber keine Nahrung für die Fliege oder Bakterien an der Oberfläche. Sie werden in den gleichen sterilen Fliegenfläschchen wie Standardfutter zubereitet, enthalten jedoch nur entionisiertes Wasser und 1,5% Agar.

2. Homogenisieren von Fliegen einzeln in einer 96-Well-PCR-Platte

1. Bereiten Sie Perlenschlagplatten im Voraus vor.
   1. Gießen Sie 0,5 μm Glasperlen (siehe Materialtabelle) auf die Perlenmessschale (3D-gedruckt mit Hilfe der Supplemental Coding File 1 S1-bead-measurer.stl). Verteilen Sie die Perlen auf dem Tablett, so dass alle Vertiefungen voll und eben sind, und bürsten Sie dann überschüssige Perlen in ein konisches Rohr, um sie wiederherzustellen.
   2. Legen Sie eine halbbeschichtete PCR-Platte (siehe Materialtabelle) kopfüber auf die Messschale und richten Sie sie mit den Vertiefungen aus, indem Sie sie in die Vertiefung auf der Messschale einpassen. Drehen Sie es dann schnell um, um die Perlen zu übertragen.
   3. Entfernen Sie überschüssige Perlen von der PCR-Plattenoberfläche und bedecken Sie sie mit Folie. Untersuchen Sie die PCR-Platte, um sicherzustellen, dass alle Vertiefungen Perlen enthalten. Verwenden Sie bei Bedarf eine Wiegeschaufel, um Perlen zu einem einzelnen Vertiefung hinzuzufügen. Wenn statische Elektrizität dazu führt, dass Perlen auf den Plattenoberflächen haften, wischen oder besprühen Sie die Rückseite des Messfachs und der PCR-Platte mit 70% Ethanol.
   4. Abdeckung mit Aluminiumfolie. Viele Platten können auf diese Weise vorbereitet und dann autoklaviert und für den späteren Gebrauch gelagert werden. Wenn Sie gebrauchsfertig sind, geben Sie 100 μL PBS mit dem 96-Kanal-Pipettierer in jede Vertiefung (siehe Materialtabelle).
2. Oberflächensterilisieren Sie die mikrobenbesiedelten Fliegen (siehe Schritt 1) vor der Homogenisierung mit 70% Ethanol.
   1. Betäuben Sie die Fliegen mit 100% CO₂ für 5 s. Die betäubten Fliegen aus der Durchstechflasche werden mit einem kleinen Trichter in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt (Abbildung 1A-2). In dieser Studie wurden typischerweise 25 Fliegen pro Röhre hinzugefügt.
   2. Sprühen Sie sofort ~ 1 ml 70% Ethanol in das Röhrchen, schließen Sie das Röhrchen und mischen Sie es durch Inversion für 10 s. Dann saugen Sie das Ethanol mit einer P1000-Pipette ab und achten Sie darauf, keine Fliegen abzusaugen. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal mit Ethanol, dann zweimal mit sterilem PBS (Abbildung 1A-3).
3. Nach dem letzten PBS-Waschen schließen Sie die Tube und klopfen Sie mit der Kappenseite nach unten einige Male hart auf die Bank, damit die Fliegen in die Kappe gehen.
4. Öffnen Sie das Röhrchen und geben Sie die Fliegen mit einer Pinzette in die Vertiefungen ab (Abbildung 1A-4). Legen Sie eine Fliege in jede Vertiefung (Abbildung 1A-5). Halten Sie die Platte während des Beladens auf Eis, um die Fliegen betäubt zu halten.
5. Versiegeln Sie die Platte mit Thermal Bond Heißsiegelfolie (siehe Materialtabelle).
   1. Entfernen Sie zunächst alle verirrten Perlen, die sich in der Nähe der Vertiefungen befinden, da diese zu Leckagen in der Foliendichtung führen können. Stellen Sie sicher, dass die stumpfe Seite der Folie auf der Platte und die glänzende Seite nach oben zum Heißsiegelgerät ausgerichtet ist. Drücken Sie das Heißsiegelgerät (siehe Materialtabelle) 5 s lang fest nach unten (Abbildung 1A-6). Mit dem Handapplikator brünieren (siehe Materialtabelle), um die Folie zu sichern.
      HINWEIS: Eine schlechte Versiegelung ist eine Ursache für Probenverlust.
6. Befestigen Sie die Platte im Tellerschüttler. 5 min homogenisieren (Abbildung 1A-7). Drehen Sie die Wulstplatte für 30 s in einem Miniplattenspinner (siehe Materialtabelle) bei 350 x g herunter, um Flüssigkeit aus der Siegelfolie zu entfernen.
7. Entfernen Sie die Folie, während Sie die Platte halten, um keine Tröpfchen von Fliegenhomogenat aus den Vertiefungen zu spritzen.

3. Serielle Verdünnung von Fliegenhomogenat und Spotting auf CFU-Platten

1. Legen Sie vier rechteckige MRS-Agar-Wachstumsplatten (siehe Materialtabelle) in die Biosicherheitswerkbank und entfernen Sie deren Deckel. In diesem Protokoll wurde MRS-Agar für das Wachstum von L. plantarum verwendet. Lassen Sie diese Platten mindestens 10 Minuten trocknen (20 Minuten, wenn sie frisch gegossen oder kalt aus der Lagerung sind).
   HINWEIS: Wenn die Platten nass sind, laufen die Tröpfchen von der 96-Well-Platte zusammen und ruinieren die Zählungen.
2. Bereiten Sie drei Verdünnungsplatten vor, indem Sie 100 μL PBS in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-Platte mit einem 96-Kanal-Pipettor geben. Legen Sie ein Rack mit P20-Spitzen auf den 96-Kanal-Pipettor.
3. Eine Verdünnung von 1:10 wird vorgenommen, indem 11,1 μl Homogenat aus der in Abschnitt 2 vorbereiteten Probenplatte angesaugt werden (Abbildung 1A-8). Achten Sie darauf, aus der Mitte der Vertiefungen und nicht vom Boden der Vertiefungen zu ziehen, da das Fliegenhomogenat und die Glasperlen die Pipetten verstopfen. Die Perlen sinken und die Fliegenpartikel schwimmen, so dass die mittlere Schicht weitgehend klar bleibt.
4. Geben Sie die 11,1 μL in die erste Verdünnungsplatte, die bereits 100 μL steriles PBS pro Vertiefung enthält. Lassen Sie die Verdünnungsplatte 10 s bei 600 U/min auf dem Plattenschüttler. Mischen Sie erneut, indem Sie fünf Zyklen lang auf und ab pipettieren. 11,1 μl werden von der ersten Verdünnungsplatte in die zweite Verdünnungsplatte überführt, und wiederholen Sie die Mischschritte für die nächsten beiden Verdünnungsplatten.
5. Führen Sie eine Verdünnungsreihenbeschichtung wie unten beschrieben durch.
   1. Holen Sie die Wachstumsplatten aus der Biosicherheitswerkbank.
   2. Beginnend mit der am stärksten verdünnten Platte 2 μL von jeder Vertiefung auf die Agarplatten mit dem 96-Well-Pipettierer (Abbildung 1A-9).
      1. Senken Sie den Pipettierkopf langsam auf die Platte und achten Sie darauf, nicht in den Agar zu stechen. Untersuchen Sie die Platte sorgfältig und stellen Sie sicher, dass alle Stellen abgegeben wurden. Wenn nicht, fügen Sie manuell 2 μL an die entsprechende Position hinzu. Stellen Sie sicher, dass die flüssigen Stellen schnell in den Agar eindringen und nicht zusammen laufen.
      2. Wenn die Flecken zusammenlaufen, trocknen Sie einen neuen Satz frischer Agarplatten für einen längeren Zeitraum und wiederholen Sie die Fleckenbildung. Wenn es mehrere Plattentypen gibt (z. B. verschiedene Medien oder mit Antibiotika), erkennen Sie auch diese. Die verbleibende Lösung wird wieder in die Verdünnungsplatte gegeben und mit der nächsthöheren Konzentration fortgefahren.
         HINWEIS: Wenn Sie Verdünnungen erkennen, mischen Sie die nächste Verdünnung fünfmal, um sicherzustellen, dass der Inhalt der Pipettenspitzen von der vorherigen Verdünnung befreit ist. Die Verdünnungsplatten können >8 h bei 4 °C gelagert werden, ohne die Koloniezahl^{zu beeinflussen 35}.
6. Wiederholen Sie den in Schritt 3.5 beschriebenen Beschichtungsvorgang für die verbleibenden Verdünnungsplatten, wobei von der verdünntesten zur konzentriertesten Platte übergegangen wird, bis die Platte das ursprüngliche Homogenat aufweist.
7. Wenn die gesamte Flüssigkeit in das Agar absorbiert wurde, drehen Sie die Platten um und legen Sie sie in den Inkubator (Abbildung 1A-10). Für Lactiplantibacillus und Acetobacter von Drosophila beträgt die optimale Temperatur 30 °C auf MRS-Medien. Inkubieren, bis die Kolonien die optimale Größe erreicht haben: Kolonien sind groß genug, um sie deutlich zu sehen, aber nicht so groß, dass sie verschmelzen oder das Wachstum der anderen stören (siehe die repräsentativen Ergebnisse zur Quantifizierung der optimalen Größe).
   HINWEIS: Optimale Wachstumsbedingungen sind dehnungsabhängig und müssen empirisch bestimmt werden. Für Lactiplantibacillus von Drosophila beträgt die optimale Inkubationszeit 26 h bis 30 h auf MRS-Agar. Für Acetobacter aus Drosophila beträgt der optimale Inkubationszeitpunkt je nach Stamm 30 h bis 48 h MRS.
8. Nach der Inkubation lagern Sie die Platten bei Bedarf bei 4 °C, bis sie zum Zählen bereit sind.

4. Quantifizierung der KBE

1. Quantifizieren Sie CFUs, indem Sie die Platten fotografieren und dann die Kolonien mit automatisierter Software zählen, wie unten beschrieben. Wenn die Platten bei 4 °C gelagert wurden, lassen Sie sie zuerst Raumtemperatur erreichen, damit keine Kondensation auf den Platten entsteht, die Blendung erzeugt.
2. Organisieren Sie die Platten in einer logischen Reihenfolge und halten Sie sie beim Fotografieren in dieser Reihenfolge - es erleichtert die Benennung der Dateien. Richten Sie alle Platten so aus, dass sich A1 in der oberen linken Ecke für alle Platten befindet. Es wird empfohlen, die A1-Ecke mit einer eindeutigen ID zu beschriften, um sicherzustellen, dass die Fotos nicht verwechselt werden. Stapeln Sie jede Verdünnungsreihe der Reihe nach.
3. Entfernen Sie den Plattendeckel und stellen Sie den Teller auf die Bühne, wobei A1 in der richtigen Ecke ausgerichtet ist. Designs sind für die Plattenfotobox (Supplemental File 1, Supplemental File 2) enthalten, die für das Fotografieren dieser Tablettplatten optimiert ist und Beleuchtungs- und Filteroptionen zur Abbildung fluoreszierender Kolonien enthält.
4. Stellen Sie sich die Platten vor. Verwenden Sie die Kamera (siehe Materialtabelle) mit manuellen Einstellungen, um eine konsistente Belichtungsstufe zwischen den Platten zu erreichen. Eine lange Brennweiteneinstellung wird empfohlen, um perspektivische Verzerrungen zu minimieren. Nehmen Sie das Foto mit einem Fernauslöser auf, um Unschärfe durch Verwacklungen zu minimieren.
5. Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer und benennen Sie sie um, einschließlich des Experimentnamens, des Medientyps, des Verdünnungsfaktors und aller anderen relevanten Details. Einige Betriebssysteme (siehe Materialtabelle) verfügen über eine nützliche Stapelumbenennungsfunktion im Finder, indem Sie mit der rechten Maustaste auf eine Auswahl von Dateien klicken.

5. Automatisierte Koloniezählung mit der Count-On-It-Suite (Supplemental File 3)

1. Schneiden Sie die Bilder mit dem mitgelieferten Croptacular Plugin (Supplemental Coding File 2) für ImageJ zu. Dieses Plugin hilft, das Bild in eine geordnete Reihe von Unterbereichen zu unterteilen (z. B. 8 x 12 für eine 96-Well-Platte). Die Subregionen werden einzeln gezählt.
   HINWEIS: Ein separates Plugin zum Zählen von kreisförmigen Platten namens Circus ist in der Supplemental Coding File 3 Circus_.ijm beschrieben.
   1. Organisieren Sie die zur Quantifizierung zu verarbeitenden Bilder in einem Ordner. Wählen Sie Dateinamen, die die Platten unterscheiden, da diese Dateinamen zu Spaltentiteln für jeden Satz von Zählungen werden. Erstellen Sie in diesem Ordner Unterordner mit den Namen "cropped" und "receipts".
   2. Starten Sie Croptacular, und klicken Sie auf OK , um mit dem Zuschneiden zu beginnen.
      HINWEIS:Die Standardeinstellungen werden angezeigt und sind in der Regel ausreichend. Je nach Auflösung des Bildes, Beleuchtung, Spotgröße etc. kann es hilfreich sein, die Basisparameter anzupassen.
   3. Wenn das Bild bereits gerade ist, drücken Sie einfach die Leertaste. Andernfalls richten Sie das Bild aus, indem Sie eine Linie entlang einer Kante zeichnen, die horizontal werden soll. Zeichnen Sie die Linie so oft wie nötig neu, wenn das Bild immer noch nicht gerade angezeigt wird.
   4. Als nächstes zeichnen Sie ein Begrenzungsfeld des Bereichs, für den gezählt werden soll. Passen Sie die Größe und Proportion an, bis sich alle Flecken in ihren Zellen befinden. Ziehen Sie den Cursor aus dem Begrenzungsfeld heraus, um das Raster zu aktualisieren. Wenn das Raster gut aussieht, drücken Sie die LEERTASTE.
   5. Stellen Sie sicher, dass das nächste Bild automatisch in den gleichen Winkel gedreht wird wie das erste. Das Plugin geht davon aus, dass alle Fotos gleich ausgerichtet sind. Wenn dies korrekt ist, drücken Sie die LEERTASTE , um fortzufahren. Andernfalls richten Sie das Bild wie zuvor aus. Das Raster erinnert sich auch an die gleiche Position wie das vorherige Bild. ggf. anpassen, und drücken Sie dann die LEERTASTE.
2. Zählen Sie die Kolonien auf den Platten mit dem mitgelieferten Count-On-It: Gridiron-Plugin für ImageJ (Supplemental Coding File 4) auf. Detaillierte Anweisungen zur Installation und Verwendung des Plugins finden Sie in Supplemental File 3.
   1. Starten Sie Count-On-It > Gridiron. Verwenden Sie dieselben Rastereinstellungen wie beim Zuschneiden. Benutzer können einen ganzen Ordner stapeln, ein einzelnes Bild analysieren oder mit dem aktuellen Abbild beginnen.
   2. Legen Sie den Schwellenwert basierend auf einem oberen und einem unteren Pixelintensitätswert fest. Machen Sie den Schwellenwert so streng wie möglich, während Sie immer noch alle Kolonien auswählen. Im Idealfall gibt es etwas Platz zwischen den ausgewählten Kolonien, aber die Software ist in der Lage, die Blobs bis zu einem gewissen Grad zu segmentieren. Klicken Sie im Dialogfeld "Aktion erforderlich" auf OK , wenn der Schwellenwert zufriedenstellend ist.
   3. Um die Ergebnisse zu überprüfen, zoomen Sie hinein und schauen Sie sich die Koloniezahlen genauer an. Wenn Sie auf Abbrechen klicken, wird das Plugin abgebrochen. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
   4. Stellen Sie auf dem ersten Bild sicher, dass die Option zum Fortfahren oder Zurückkehren zum Setup-Menü gegeben ist, z. B. um die minimale Koloniegröße zu ändern. Klicken Sie auf OK, um mit dem Stapelvorgang fortzufahren. Wählen Sie dann einen Ordner aus, in dem die Belege und die Ergebnistabelle gespeichert werden sollen. Verwenden Sie den Ordner "Quittungen" oder erstellen Sie einen neuen Ordner.
   5. Nach dem ersten Bild wird für die nächsten Bilder standardmäßig der gleiche Schwellenwert wie bei den vorherigen Einstellungen angezeigt. Klicken Sie auf OK , um diese Einstellungen zu verwenden oder die Einstellungen anzupassen. Wenn die Fotos konsistent sind und die Einstellung korrekt ist, klicken Sie im Dialogfeld "Aktion erforderlich" auf OK .
      HINWEIS: Sobald alle Bilder im Stapel fertiggestellt sind, wird die Ergebnistabelle automatisch im selben Ordner wie die Belege gespeichert.
   6. Überprüfen Sie die von der Software erzeugten Zählbelege und korrigieren Sie manuell alle Zählfehler. Das ImageJ-Plug-In ist statistisch genau, es treten jedoch Fehler auf. Prüfen Sie die Quittungen, um Ausreißer zu untersuchen und Fehlzählungen zu identifizieren. Die Software speichert die CFU-Daten als .csv Datei im selben Ordner wie die Belege.
3. Analysieren Sie die Daten mit der vom Benutzer bevorzugten Software.

Ergebnisse

Zählung von CFUs in Hunderten von einzelnen Fliegen im 96-Well-Plattenformat mittels Kolonisationstest
Um die Zusammensetzung vieler einzelner Fliegenmikrobiome zu verstehen, wurden CFUs mit dem begleitenden Protokoll gemessen, das die Identifizierung der vorhandenen Arten, des Prozentsatzes der besiedelten Fliegen und der absoluten Bakterienhäufigkeit in jeder Fliege ermöglichte. Die Gründe für die große beobachtete Variation von Individuum zu Individuum in der Zusammensetzung des Mikrobioms sind kaum verstanden, und die Quantifizierung der statistischen Verteilung der Kolonisation kann helfen, diese Variation zu untersuchen^36,37. Um eine signifikante Anzahl biologischer Replikate zu erhalten, wurde eine Hochdurchsatz-Pipeline zur Quantifizierung der Mikrobenhäufigkeit in vielen einzelnen Fliegen unter Verwendung von CFU-Zählungen entwickelt (Abbildung 1A).

Die endgültige Quantifizierung von CFUs kann davon beeinflusst werden, wie Fliegen vor der Analyse behandelt werden, z. B. Faktoren wie Oberflächensterilisation, Zeit seit dem Verzehr von Bakterien und Entfernung von vorübergehenden Bakterien aus dem Darm. Erstens, konzentriert auf die Drosophila kommensale Bakterienspezies L. plantarum (Lp; siehe Lp-Stamm WF in Obadia et al.36), wurden Fliegen mit einer Dosis von ~10⁵ KBE Lp gefüttert und in Gruppen von 25 Fliegen pro Fläschchen gehalten. Diese Fliegen wurden entweder 3 Tage lang in derselben Durchstechflasche gehalten oder täglich (Transferred) auf frisches, steriles Futter übertragen (Abbildung 1B). Nicht übertragene Fliegen wurden dann entweder in Ethanol gewaschen, um Oberflächenbakterien zu entfernen (gewaschen) oder nicht gewaschen (ungewaschen). Das Waschen führte zu einer nicht signifikanten Verringerung der gesamten gemessenen KBE (Abbildung 1B), was darauf hindeutet, dass unter diesen streng kontrollierten Impfbedingungen die Fliegenoberfläche innerhalb von 3 Tagen nicht signifikant von Bakterien besiedelt wird. Die anderen Gruppen von Fliegen wurden jeden Tag übertragen, um die Ansammlung von Bakterien aus dem Wachstum auf Nahrung zu reduzieren (Transferred); Zusätzlich wurde eine Gruppe vor der Probenahme für 4 h in frisches Futter überführt (Post-Transferred), oder sie wurden in Fläschchen mit nur sterilem Agarwasser für 4 h (Cleared) gegeben, damit vorübergehend aufgenommene Mikroben aus dem Darm entfernt werden konnten. Jeder dieser Schritte zur Bereitstellung einer strengeren Kolonisationsmessung führte zu einer statistisch signifikanten Verringerung der Häufigkeit von KBE in den Fliegen, mit Ausnahme der Oberflächenwäsche in Ethanol. Der Transfer in steriles Lebensmittel (Post-Transferred) oder Agarwasser (Cleared) für 4 h vor der Messung ergab ununterscheidbare Effekte, was darauf hindeutet, dass der Transfer in sterile Bedingungen 4 h vor der Messung die Bakterienbelastung reduziert. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Interpretation, dass einige Darmbakterien im Fliegendarm vorübergehend sind, während andere stabiler assoziiert sind³⁵. Die Häufigkeit von Lp reichte von 1 x 10 4,3 KBE/Fliege in geklärten Fliegen bis zu 1 x 10^4,9 KBE in den ungewaschenen Fliegen (n = 724 Fliegen).

Als nächstes wurde derselbe Test mit Acetobacter indonesiensis (Ai) durchgeführt, einem gramnegativen Bakterium, das den Fliegendarm besiedelt (Abbildung 1C; siehe Stamm Ai SB003 in Obadia et ^al.36). Wie bei Lp-besiedelten Fliegen führte die Oberflächensterilisation zu einer nicht signifikanten Reduktion der KBE. Ebenso reduzierte der tägliche Transfer in sterile Lebensmittel die Bakterienbelastung signifikant, und der Transfer in sterile Bedingungen für 4 Stunden vor der Homogenisierung führte zu einer weiteren Verringerung der Bakterienbelastung. Die Häufigkeit von Ai reichte von 1 x 10^4,7 KBE/Fliege in geklärten Fliegen bis zu 1 x 10^5,0 KBE in den ungewaschenen Fliegen (n = 528 Fliegen). Daher hängt die genaue Quantifizierung von Darmbakterien von der Häufigkeit der Übertragung ab, einschließlich des Tages des Transfers. Das Entfernen der äußeren Bakterienlast durch Waschen in Ethanol hatte einen nicht signifikanten Effekt, aber signifikantere Effekte können für verschiedene Bakterienstämme oder unterschiedliche Kulturbedingungen beobachtet werden. Diese Faktoren sollten experimentell kontrolliert werden.

Der mögliche Einfluss der Homogenisierungsmethode auf die KBE-Zählung wurde ebenfalls getestet. Die Fliegen wurden mit einem Perlenschläger mit 0,5 μm Glasperlen in 100 μL PBS homogenisiert, was die Lebensfähigkeit von Bakterienzellen verringern konnte. Zuerst wurde eine Suspension von Lp-Bakterien aus Kultur in PBS hergestellt und dann plattiert, um CFUs als Positivkontrolle zu zählen. Die gleiche Kultur wurde in die Perlenschlagplatte gegeben und (i) mit Perlen homogenisiert, (ii) mit Perlen und einer keimfreien Fliege homogenisiert oder (iii) in PBS ohne Perlen homogenisiert (Abbildung 1D). Die Homogenisierung in Perlen, wenn eine Fliege vorhanden war, hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Häufigkeit lebensfähiger Zellen in Lösung, während die Homogenisierung von Bakterien in Abwesenheit einer Fliege eine signifikante Anzahl von Bakterienzellen tötete. Die Homogenisierung in PBS ohne Beads reduzierte auch die Anzahl der lebensfähigen Zellen signifikant. In ähnlicher Weise blieb die Ai-Lebensfähigkeit erhalten, wenn sie in Gegenwart einer Fliege homogenisiert wurde, während die Homogenisierung ohne Fliege die Anzahl der lebensfähigen Zellen in Lösung reduzierte (Abbildung 1E). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Fliegengewebe die Bakterien davor schützt, während der Homogenisierung durch die Perlen zerstört zu werden. Die Experimente in Abbildung 1D und Abbildung 1E wurden jedoch mit mehr als 10 ⁸ KBE pro Bohrloch durchgeführt. In der Praxis wurde festgestellt, dass Wells mit ~ 10⁶ Zellen pro Vertiefung oder weniger einen geringen Zellverlust zeigten, wenn Perlen ohne Fliege verwendet wurden. Das Abkühlen der Platte auf Eis auf halbem Weg durch Perlenschlagen verbessert auch die Zelllebensfähigkeit. Die Bedeutung dieser Ergebnisse besteht darin, dass sich die Leser dieser potenziellen Probleme bewusst sein und geeignete Kontrollen für ihren spezifischen Anwendungsfall entwerfen sollten.

Genauigkeit der Punktbeschichtung von 96-Well-Platten für die CFU-Quantifizierung mit hohem Durchsatz
Da das Ziel darin besteht, die KBE-Häufigkeiten für Hunderte bis Tausende von Einzelfliegen zu messen, sind herkömmliche Streubeschichtungsmethoden unerschwinglich zeit- und materialintensiv. Die Spotplattierung ist eine effektive und effiziente Methode für das Wachstum und die Zählung von KBE^19,31. Das Spot-Plattierungsverfahren verwendet einen 96-Kanal-Pipettierer, um 2 μL Bakteriensuspension auf Medien zu dosieren, die in rechteckigen Schalenplatten vorbereitet sind (Abbildung 2A). Jeder Spot repräsentiert die Bakterienbelastung einer einzelnen Probe, so dass 96 Fliegen mit einer einzigen Platte analysiert werden können (Abbildung 2B). Die Genauigkeit der Punktbeschichtung wurde mit der herkömmlichen Beschichtung verglichen, indem Wachstumsplatten mit genau derselben 0,0001 OD-Suspension von Lp für beide Methoden beimpft wurden. Die Suspension wurde in PBS fünfmal seriell verdünnt. Als Kopf-an-Kopf-Vergleich wurden 50 μL des Inokulums auf einzelne runde Platten verteilt oder 2 μL Spots auf rechteckigen MRS-Platten gemacht. Die Platten wurden dann bei 30 °C inkubiert, bis die Kolonien zählbar waren. Die resultierenden KBE-Zahlen für jede Verdünnung wurden verwendet, um die ursprüngliche Konzentration der Suspension zu berechnen und zu vergleichen (Abbildung 2C). Runde Platten mit 50-500 KBE wurden als Steuerung gezählt. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Hochdurchsatz- und herkömmlichen Rundbeschichtungsverfahren beobachtet.

Da die Dichte von Kolonien ihr Wachstum und ihre Quantifizierung beeinflussen kann, wurde der Effekt der KBE-Dichte auf die Endzählung getestet. Flecken mit 2 bis 25 Kolonien pro Fleck zeigten keinen Unterschied in der Endzählung im Vergleich zur traditionellen Rundplattenmethode (Abbildung 2C). Flecken mit durchschnittlich 35 Kolonien lieferten Ergebnisse, die etwas niedriger waren als die Kontrollstreuplatten (Abbildung 2C; p = 0,0017). Eine genaue Untersuchung der Fotos einzelner Flecken zeigte, dass diese Schiefe auf Kolonien zurückzuführen war, die sich in dichten Flecken überlappen. Messungen auf der Grundlage von Spots mit durchschnittlich 11 Kolonien pro Spot ergaben Konzentrationen, die denen der Spreadplatten am nächsten kamen (Abbildung 2C; Streuplatten: Mittelwert = 1 x 10^4,4 KBE; SD = 0,086 vs. Flecken mit 11 durchschnittlichen Kolonien: Mittelwert = 1 x 10^4,4 KBE; SD = 0,12, p = 0,42, Welchscher t-Test).

Erzeugung hochwertiger Bilder zur Quantifizierung mit einer speziellen Fotoplattform mit Weißlicht oder Fluoreszenz
Hochdurchsatz-Spot-Plating erzeugt natürlich eine große Anzahl von Zielbereichen, die genau gezählt werden müssen. Qualitätsfotos können verwendet werden, um die Daten zu dokumentieren und die Zählung von CFUs zu erleichtern. Eine robuste und unkomplizierte Fotoplattform wurde unter Verwendung kommerziell erhältlicher Materialien entwickelt (Abbildung 3A). Eine Digitalkamera wurde an einer Halterung oben auf einem speziell angefertigten Leuchtkasten namens FluoroBox befestigt und direkt nach unten gerichtet, senkrecht zur Mitte der Platte. Optional wurde ein farbiger Emissionsfilter über einen Filterschieber vor der Linse positioniert. Eine Lichtabschirmung verhinderte Linsenreflexe, indem sie direktes Licht von den darunter liegenden LED-Streifen blockierte. LED-Streifen beleuchteten die Platte von den Seiten und nicht von oben, um eine Blendung auf der Platte zu verhindern. Zusätzlich zu weißem Licht wurden einfarbige blaue und grüne LEDs verwendet, um grüne bzw. rot fluoreszierende Proteine anzuregen. Die Platte wurde von einem Plattenhalter auf der Schublade gehalten, und die Schublade war mit Schubladenschiebern ausgestattet, um das Einsetzen der Platte zu erleichtern. Vollständige Geschmacksmuster sind in Supplemental File 1 und Supplemental File 2 verfügbar.

Ein Foto einer Fleckplatte von Lp-Kolonien wurde mit Weißlicht-LEDs und einer Digitalkamera aufgenommen, um das Zählen von Kolonien und die Unterscheidung verschiedener Farben und Morphologien zu unterstützen (Abbildung 3B). Um zu bestätigen, dass die Lichtintensität gleichmäßig war, wurde die Hintergrundintensität des Agars über verschiedene Regionen eines Plattenfotos gemessen (Abbildung 3C). Um zu zeigen, dass die Kolonien deutlich vom Hintergrund unterschieden werden können, wurde die Intensität über den Durchmesser von 10 verschiedenen Kolonien an verschiedenen Teilen der Platte gemessen und als etwa ~ 300% höher als der Hintergrund gefunden (Abbildung 3C). Die Platte wurde mit Lp mit einem mCherry-fluoreszierenden Protein-exprimierenden Plasmid sowie etwas Lp beimpft, das das Plasmid nicht enthielt, so dass die Kolonien entweder mCherry-positiv oder mCherry-negativ waren. Um diese beiden Arten von Kolonien zu unterscheiden, wurde die Platte mit derselben Kamera mit grünem LED-Licht (515-525 nm) und einem Rotfilter (Tiffen #29) fotografiert, wodurch mCherry-positive Kolonien fluoreszieren (Abbildung 3D). Der Intensitätsunterschied zwischen mCherry-positiv und mCherry-negativ wurde quantifiziert, indem die Intensität über eine Stichprobe von Kolonien gemessen wurde (n = 10 Kolonien). mCherry-positive Kolonien hatten ~1.000% höhere Intensität als mCherry-negative (Abbildung 3E). Kolonien von Ai, die GFP exprimieren, und Kolonien von Ai, die keine Fluoreszenz exprimieren, wurden mit blauen LED-Lichtern (465-475 nm) und einem Grünfilter (Tiffen #58) fotografiert (Abbildung 3F). GFP-positive Kolonien zeigten eine 200% höhere Intensität als GFP-negative (Abbildung 3G).

Automatische Zählung von CFUs auf Spotplatten mit dem benutzerdefinierten ImageJ-Plug-in Count-On-It
Fotos allein helfen beim Zählen von Kolonien (z. B. durch Speichern der Daten, Teilen der Daten, Vergrößern, Markieren einer Überlagerung, Trennen von Farben usw.). Das manuelle Zählen und Organisieren der Ergebnisse von Hunderten von Punkten kann jedoch mühsam, zeitaufwendig und anfällig für Unterschiede von Mensch zu Mensch bei der endgültigen Zählung sein. Um den Zählprozess zu beschleunigen und die Reproduzierbarkeit von Zählungen zu standardisieren, wurde ein spezielles ImageJ-Plug-in namens Count-On-It (Abbildung 4A) entwickelt. Dieses Plug-in ermöglicht eine genaue halbautomatische Zählung von KBE auf Agarplatten. Der Benutzer bereitet Bilder für die Zählung vor, indem er sie zunächst mit dem zusätzlichen Croptacular Plug-in zuschneidet und begradigt. Die Fotos können optional stapelverarbeitet werden, und der Schwellenwert kann für jede Platte angepasst werden. Mehrere andere Optionen ermöglichen es dem Benutzer, die Genauigkeit der Plattenzählung zu erhöhen, einschließlich der Anpassung der Lichtwellenlängen (RGB-Bilder), der Einstellung eines Bereichs der Koloniegröße (in Pixeln), des Änderns des maximalen Seitenverhältnisses und des Anpassens der Abmessungen des aktiven Auswahlrasters. Count-On-It gibt eine Ergebnistabelle aus, wobei jede Platte als Spalte mit CFU-Zählungen dargestellt wird. Es generiert auch einen Fotobeleg mit einem Overlay, um die Zählergebnisse visuell zu dokumentieren und die manuelle Fehlerkorrektur zu unterstützen (Abbildung 4B). Während Fehler auftreten, wenn die Anzahl der manuell gezählten Kolonien mit der Anzahl der mit diesem Plug-In gezählten Kolonien verglichen wurde (Abbildung 4C), war die Beziehung im Allgemeinen äquivalent, wobei die lineare Regression zwischen der manuellen und der automatisierten Zählung eine Steigung von 0,95 mit einer Genauigkeit von über 90% zeigte (R² = 0,93), obwohl der Fehler zunahm, wenn die Anzahl der Kolonien 20 überstieg.

Count-On-It kann auch verwendet werden, um fluoreszierende Kolonien mit der Fluoreszenzfunktion der FluoroBox separat zu zählen. mCherry-positive Koloniezahlen (Abbildung 4D) durch Software-Plug-in im Vergleich zu manuellen hatten ein R² von 0,92 (Abbildung 4E). In ähnlicher Weise hatten GFP-positive Kolonien (Abbildung 4F), die mit Software-Plug-in im Vergleich zu manuell gezählt wurden, einen^R2 von 0,90 (Abbildung 4G). Fluoreszierende und nicht-fluoreszierende Kolonien können innerhalb einer einzigen Stichprobe unterschieden werden, und Koloniegröße und -form können zusätzlich verwendet werden, um separate Subpopulationen zu unterscheiden (Abbildung 4H-K). Die Fotoquittungen bieten eine Aufzeichnung, die es dem Benutzer ermöglicht, die Genauigkeit der Zählungen schnell zu überprüfen und Fehler manuell zu korrigieren. In Abbildung 4C, E, G, I, K wurden die Fotoquittungen nicht verwendet, um die Zählgenauigkeit zu verbessern, damit die Leser die Rohausgabe der Methode sehen können. Fälle wie in Abbildung 4G, wo eine manuelle Zählung von 1 eine automatisierte Zählung von 21 ergab, können anhand der Fotobelege schnell erkannt werden. In diesem Fall erzeugte Blendung am Rand der Platte Kleckse, die als Kolonien gezählt wurden. Für jeden Anwendungsfall müssen die optimalen Einstellungen für das Software-Plug-in ermittelt werden, bevor ein hoher Durchsatz gezählt wird.

Abbildung 1: Der Kolonisationsassay misst CFUs in Hunderten von einzelnen Fliegen mit einem 96-Well-Plattenformat. (A) Bildlicher Überblick über den Kolonisationsassay und die Hochdurchsatz-Quantifizierungsmethode, die wie im Protokollabschnitt beschrieben verwendet werden. (B) Die Häufigkeit von Lactiplantibacillus plantarum (Lp) in Fliegen nach dem Kolonisationstest wurde unter verschiedenen Bedingungen unter Verwendung der Hochdurchsatz-CFU-Quantifizierungsmethode gemessen. Die Fliegen wurden 3 Tage lang in derselben Durchstechflasche aufbewahrt und dann homogenisiert und plattiert (ungewaschen), vor der Beschichtung in Ethanol gewaschen (gewaschen), täglich gewaschen und übertragen (transferiert), täglich übertragen und dann vor der Beschichtung auf sterilem Futter aufbewahrt (Post-Transferred) oder in Fläschchen mit nur Wasser für 4 h aufbewahrt (Cleared) (n = 724 Fliegen insgesamt, 3 biologische Replikate und ~72 Fliegen insgesamt pro Behandlung). (C) Der gleiche Test wie in (B) wurde mit Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 Fliegen) durchgeführt. (D) Lp-Bakteriensuspension wurde in PBS hergestellt und dann plattiert, um KBE zu zählen, oder zuerst durch Perlenschlagen homogenisiert, perlengeschlagen in Kombination mit einer keimfreien (GF) Fliege oder auf dem Perlenschläger ohne Perlen oder eine Fliege geschüttelt (n = 236 Probenmulden). (E) Die Ai-Lebensfähigkeit nach der Homogenisierung wurde auf die gleiche Weise wie in (D) getestet (n = 282 Probenbohrungen). Die statistische Signifikanz für Panels (B-E) wurde mit einem Kruskal-Wallis-Test berechnet, gefolgt von paarweisen Wilcoxon-Rangsummentests mit Bonferronis Mehrfachvergleichskorrektur. Box gibt den Interquartilsbereich an. Linie gibt den Median an. Schnurrhaare geben Gesamtreichweite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Genauigkeit der Punktbeschichtung von 96-Well-Platten für die CFU-Quantifizierung mit hohem Durchsatz. (A) Spot-Plating mit einem 96-Kanal-Pipettiergerät zur Abgabe von 2 μL auf Medien, die in rechteckigen Schalenplatten vorbereitet sind. (B) MRS-Agar-Wachstumsplatte mit 96 Flecken Lp-Kolonien . (C) Konzentration der Lp-Suspension basierend auf KBE-Zählungen aus traditionellen runden Platten (n = 24 Platten) im Vergleich zur Konzentration basierend auf KBE-Zählungen von Spotplatten (n = 680 Flecken), seriell verdünnt und nach durchschnittlicher Koloniezahl pro Punkt angeordnet (~48 Spots für jeden einzelnen Verdünnungsfaktor für drei Replikatplatten wurden gezählt). Jeder Datenpunkt stellt die genauen Kolonien pro Punkt dar, während jede Spalte die durchschnittlichen Kolonien für diese Verdünnung darstellt. Die horizontale gepunktete Linie zeigt die berechnete KBE-Anzahl der Kultur an, die beschichtet wurde. Grün umrandete Punkte heben die traditionellen runden Plattenzahlen hervor. Rot gefüllte Punkte heben die optimale Koloniedichte von 11 KBE pro 2 μL-Punkt hervor. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer gewöhnlichen Einweg-ANOVA berechnet, bei der der Mittelwert jeder Spalte mit dem Mittelwert der Spreizplattenkontrollsäule mit Bonferronis Mehrfachvergleichskorrektur verglichen wurde. Box gibt den Interquartilsbereich an. Linie gibt den Median an. Schnurrhaare geben Gesamtreichweite. **p < 0,01. ns = nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Eine Fotoplattform erzeugt quantifizierbare Bilder von Platten mit weißem Licht oder Fluoreszenz . (A) Überblick über das FluoroBox-Design. (B) Foto einer Fleckplatte von Lp-Kolonien mit weißem Licht. (C) Intensitätsprofil einzelner Kolonien unter weißem Licht im Vergleich zur Intensität des Hintergrunds (BKG) (n = 10 Kolonien, gestrichelte Linie stellt Standardabweichung dar). (D) Foto der gleichen Spotplatte wie in (B) mit einfarbigen grünen Lichtern und dem Rotfilter zur Auswahl für mCherry-positive Lp-Kolonien . (E) Intensitätsprofil einzelner Kolonien, das den Unterschied zwischen Kolonien mit und ohne mCherry-Emission veranschaulicht. (F) Foto einer Spotplatte mit Ai-Kolonien , von denen einige ein GFP-Etikett haben. (G) Intensitätsprofil einzelner Kolonien, das den Unterschied zwischen GFP-negativen und GFP-positiven Kolonien veranschaulicht. E, F, G: n = 10 Kolonien für jede Parzelle. Die Koloniedurchmesser betragen ca. 1,5 mm. Die gestrichelte Linie ist SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Genaue Zählung von Punktplatten durch das Count-On-It ImageJ-Plug-in. (A) Screenshot des Plug-in-Setup-Fensters. (B) Das Plug-in generiert eine Quittung, um die Zählung zu dokumentieren und bei der Fehlerkorrektur zu helfen. Einsatz: Überlagerung mit der Anzahl der für jede Spotregion gezählten Kolonien; Der gelbe Umriss zeigt an, dass eine einzelne Kolonie gezählt wurde und rot, dass mehrere Kolonien gezählt wurden. (C) Diagramm, das die Anzahl der manuell gezählten Kolonien im Vergleich zur Anzahl der mit dem Plug-in gezählten Kolonien (automatisiert) zeigt, wenn ein Weißlichtbild verwendet wurde, wobei jeder Punkt im Diagramm einen einzelnen Punkt darstellt, der manuell oder automatisch gezählt wird (Steigung der Anpassung = 0,95, Cyanlinie; 1:1-Linie ist rot gepunktet; R2 = 0,93, Korrelationskoeffizient von Pearson, p < 0,0001). (D) Foto Empfangsbild aus dem Plug-in, wenn mCherry-positive Kolonien mit der Fluoreszenzfunktion der Fotobox ausgewählt wurden. (E) Diagramm, das die Anzahl der mCherry-positiven Kolonien zeigt, die manuell gezählt wurden, im Vergleich zur automatisierten Methode, wenn rote Fluoreszenz verwendet wurde (Steigung der Anpassung = 1,1, Cyanlinie; 1:1-Linie ist rot gepunktet; R2 = 0,92, Korrelationskoeffizient von Pearson, p < 0,0001). Beachten Sie, dass Ausreißer und Fehler nicht mit den Analysebelegen für E,G,I,K korrigiert wurden. (F) Fotoempfangsbild vom Plug-in, wenn GFP-positive Kolonien mit der grünen Fluoreszenzfunktion der Fotobox ausgewählt wurden und der grüne Kanal mit dem Plug-in ausgewählt wurde. (G) Diagramm, das die Anzahl der GFP-positiven Kolonien zeigt, die manuell gezählt wurden, im Vergleich zur automatisierten Methode, wenn grüne Fluoreszenzbeleuchtung verwendet wurde (Passungsneigung = 1,1, Cyanlinie; 1:1-Linie ist rot gepunktet; R2 = 0,90, Pearson-Korrelationskoeffizient, p < 0,0001). (H) mCherry-positive Kolonien, die aus gemischten Koloniemorphologien unter Verwendung einer hohen Fluoreszenzschwelle im Plug-in ausgewählt wurden. (I) Diagramm, das die Anzahl der mCherry-positiven Kolonien zeigt, die manuell gezählt wurden, im Vergleich zur automatisierten Methode, wenn rote Fluoreszenzbeleuchtung verwendet wurde (Passungsneigung = 0,99; R2 = 0,91, Korrelationskoeffizient von Pearson, p < 0,0001). (J) mCherry-negative Kolonien, die aus gemischten Koloniemorphologien unter Verwendung einer niedrigen Fluoreszenzschwelle ausgewählt wurden. (K) Diagramm, das die Anzahl der mCherry-negativen Kolonien zeigt, die manuell gezählt wurden, im Vergleich zur automatisierten Methode, wenn der Intensitätsschwellenwert zur Auswahl nicht-fluoreszierender Kolonien festgelegt wurde (Steigung der Anpassung = 1,1; R2 = 0,85, Pearson-Korrelationskoeffizient, p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Datei 1: Montageanleitung für FluoroBox. Diese Datei führt den Leser Schritt für Schritt durch die Konstruktion des im Video verwendeten kontrollierten Beleuchtungskastens. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: FluoroBox Acryl lasergeschnitten. Diese Datei enthält eine Schnittvorlage zum Laserschneiden der Acrylstücke für den gesteuerten Beleuchtungskasten. Die Datei kann an einen lasergeschnittenen Acrylhersteller gesendet werden. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle des in diesem Protokoll verwendeten Anbieters. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Softwareanweisungen. Diese Datei führt den Leser Schritt für Schritt durch die Installation und Verwendung der mit diesem Protokoll gelieferten Croptacular und Count-On-It-Software. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 1: 3D-Druckcode für Wulstmessschale (S1-bead-measurer.stl). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 2: Rechteckige Platte Photo Cropper ImageJ Plugin (Croptacular_.ijm). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 3: Round plate photo cropper plugin (Circus_.ijm). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 4: Rectangular plate 96 spot counter plugin (Gridiron_.ijm). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die hier vorgestellten detaillierten Techniken ermöglichen eine >100-fache Erhöhung der Anzahl der Proben, die in einem KBE-Zählexperiment ausgewertet werden können. Diese Technik erweitert bestehende Methoden für Mikrobiomexperimente in Drosophila 12,35,36, indem das 96-Well-Plattenformat verwendet wird^, um einzelne Fliegen zu untersuchen. Darüber hinaus wendet es eine effizientere Punktbeschichtungsmethode ^19,31 und einen automatisierten Workflow mit einer Foto- und Koloniezählplattform an. Die Bedeutung dieser Methode für Drosophila besteht darin, Experimente auf das 96-Well-Plattenformat zu standardisieren, das die gleichzeitige Handhabung einer großen Anzahl biologischer Replikate mit Automatisierung ermöglicht, um eine Hochdurchsatzquantifizierung von CFUs zu erreichen.

Die 96-Well-Plattform zeigt, dass eine erhöhte Übertragungsfrequenz und die "Entfernung" transienter Bakterien eine signifikante Verringerung sowohl der mittleren Häufigkeit als auch der Variation zwischen den Proben bewirkt (Abbildung 1B,C), was die Stringenz dieses verbesserten Protokolls zeigt. Eine Einschränkung der Co-Unterbringung von Fliegen ist die horizontale Übertragung von Bakterien zwischen Fliegen. Eine vorgeschlagene Lösung besteht darin, Fliegen einzeln in einem 96-Well-Plattenformat zu halten, wie z. B. die Whole Animal Feeding Flat³⁸.

Obwohl keine signifikante Verringerung der Bakterienbelastung beobachtet wurde, wenn Fliegen in Ethanol gewaschen wurden, wurden diese Fliegen nur 3 Tage lang in Gegenwart externer Bakterien gehalten. Die Unterbringung über längere Zeiträume könnte eine größere Bakterienbelastung ermöglichen³⁹. Daher wird das Waschen in Ethanol immer noch empfohlen.

Das Übertragen von Fliegen in die 96-Well-Platte ist der entscheidende erste Schritt für die Einrichtung des Workflows (Abbildung 1A). Sobald die Fliegen gewaschen sind, werden sie nacheinander in die Brunnen verteilt. Ein Plattendiagramm ist in diesem Stadium nützlich, um zu notieren, welche Bedingungen in jedem Bohrloch vorhanden sind, und Notizen wie "Fliege ging verloren" hinzuzufügen. Die Homogenisierung ist ein weiterer kritischer Schritt mit einigen wichtigen Vorbehalten. Bakterien überleben den Homogenisierungsprozess, wenn sie sich in Gegenwart einer Fliege befinden (Abbildung 1D, E), und vermutlich gilt dieses Prinzip auch, wenn sich die Bakterien im Darm der Fliege befinden. Bakterien werden jedoch auch abgetötet, wenn sie allein in Perlenschlagplatten homogenisiert werden, was zeigt, dass die Homogenisierung die Bakterienzellen unter bestimmten Umständen abtöten kann, eine Einschränkung, die wichtig sein kann, wenn man beispielsweise sezierte Eingeweide homogenisiert. Insbesondere hängt der Verlust von CFUs bei der Homogenisierung von der Anzahl der CFUs in der Probe ab, und der Verlust ist minimal, wenn ~ 10⁵ CFUs pro Vertiefung verwendet werden. Eine weitere Konservierung von KBE kann erreicht werden, indem die Homogenisierung auf halbem Weg gestoppt und die Platte auf Eis gekühlt wird.

Die Homogenisierung wurde in diesem Protokoll für 5 Minuten durchgeführt, basierend auf Kontrollexperimenten, bei denen eine bekannte Anzahl von CFUs mit einer keimfreien Fliege gemischt wurde, und dies funktionierte empirisch für Fliegenbakterien. Weniger Schläge führten dazu, dass größere Fliegenteile vorhanden waren, was das Pipettieren störte, während signifikant längere Homogenisierungszeiten von ~ 10 min die CFU-Zählungen variabler machten. Es wurde beobachtet, dass das kleinere Volumen und die abgewinkelte Form konischer Plattenmulden die Effizienz des Perlenschlagens im Vergleich zu zylindrischen 2-ml-Rohren verringern. Viele Variationen dieses allgemeinen Ansatzes sind möglich, einschließlich welcher Bakterienstämme, welcher Perlenschlagbehälter, welche Perlen und welcher Fliegengenotyp verwendet werden. Einzelne Benutzerfälle müssen Positivkontrollen verwenden, um ihren Ansatz zu etablieren.

Die Spot-Plating-Methode wurde auf spezifische Weise angewendet: 1:2-Verdünnungen von L. plantarum WF in PBS wurden auf MRS-Platten gespottet und 2 Tage lang bei 30 °C inkubiert (kürzere Inkubationszeiten können implementiert werden, um kleinere Koloniegrößen zu erzeugen). Das Verfahren erfordert einige Vorabinvestitionen in Ausrüstung, vor allem den Perlenschläger und den 96-Kanal-Pipettierer (Abbildung 2A), die sowohl für die Verdünnungsreihe als auch für die Punktbeschichtung erforderlich sind. Es sind jedoch kostengünstigere Optionen verfügbar, darunter ein 96-Well-Plattenreplikator mit geschlitzten Pins. Die Verdünnungsreihe ist ein kritischer Schritt, der die Genauigkeit der KBE-Zählergebnisse beeinflusst. In Bezug auf Fehlermodi ist es möglich, die Pipettenspitzen mit Fliegenteilen oder Glasperlen zu verstopfen und dass die Pipettenspitzen nicht richtig auf dem Pipettierer abdichten oder aus einem anderen Grund versagen. All diese Probleme führen zu einer Unterzählung der betroffenen Brunnen und sollten überwacht werden. Eine angemessene Durchmischung bei jedem Schritt der Verdünnungsreihe ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Jede Verdünnung sollte gründlich gemischt werden, indem entweder die Platte auf einen Plattenschüttler gelegt oder 15-20 Mal auf und ab pipettiert wird, was auch zum Spülen der Spitzen dient. Durch Spotting von der am stärksten verdünnten zur am wenigsten verdünnten Platte können die Spitzen für die gesamte Verdünnungsserie wiederverwendet werden. Mit 1:2-Verdünnungen ist die Zählung über einen Bereich von 2-25 Kolonien genau, die sich über eine Größenordnung erstrecken (Abbildung 2C). Daher sparen Verdünnungen im Verhältnis 1:10 Zeit und Material. Eine weitere Variable, die genutzt werden kann, ist die Inkubationszeit, die angepasst werden kann, um kleinere Kolonien zu erzeugen und so die Reichweite der zählbaren Punkte zu erhöhen, indem die Verschmelzung benachbarter Kolonien verhindert wird.

Ein qualitativ hochwertiges Foto der Platte ist unerlässlich, da es zu den Rohdaten wird, aus denen die CFUs analysiert und unbegrenzt archiviert werden können. Die FluoroBox wurde entwickelt, um Fotos der Platten mit gleichmäßiger Lichtintensität zu erstellen, wodurch die Blendung auf der Agaroberfläche minimiert wird. Darüber hinaus ist das Design in der Lage, fluoreszierende Kolonien selektiv mit einfarbigen LED-Leuchten und farbigen Fotofiltern zu fotografieren (Abbildung 3A). Der Aufbau eines Aufbaus wie der FluoroBox mit kontrollierter Beleuchtung und Kameraeinstellungen kann die Reproduzierbarkeit von CFU-Bildern erheblich erhöhen, was für die automatisierte Analyse wichtig ist. Koloniemorphologien, Fluoreszenzintensität und die Auswirkungen von Zeit oder Dichte auf das Koloniewachstum sind nur einige der Eigenschaften, die anhand der Fotos analysiert werden können. Die Fotobox kann ohne Farbfilter und einfarbige Lichter konstruiert werden, wenn keine fluoreszierenden Bakterien verwendet werden, was die Kosten und die Komplexität reduziert. Andere Anregungslichter und Emissionsfilter könnten die hier empfohlenen ersetzen, wenn ein anderes Fluorophor von einem Labor verwendet wird. Eine Kamera, die über WLAN über eine App mit einem Tablet verbunden ist, ist sowohl für die automatische Verschlussfunktion zur Vermeidung von Verwacklungen als auch für die einfache Datenübertragung nützlich. Bilder können mithilfe einer drahtlosen Dateiübertragungssoftware auf das Tablet und dann auf einen Laptop übertragen werden. Empfohlene Kameras mit diesen Funktionen sind in der Materialtabelle angegeben.

Count-On-It ist ein Plug-in, das in ImageJ geschrieben wurde. Die automatisierte CFU-Zählsoftware segmentiert das Plattenbild in ein einheitliches 96-Well-Raster, zählt die Kolonien in jeder Rasterzelle und stapelt die Ergebnisse in einer einfachen Tabelle. Da die Position des Spotrasters auf der Platte und im Foto immer variiert, muss der Benutzer das Raster mithilfe des Croptacular Plug-Ins manuell an das Foto anpassen. Dies hilft auch, Bereiche in der Nähe der Plattenkante auszuschließen, die blenden. Das Festlegen des Schwellenwerts ist der Schlüssel, um die genaueste CFU-Anzahl aus dem Bild zu erhalten. Wenn die Schwelle zu hoch eingestellt ist, verschmelzen die Kolonien; Wenn der Schwellenwert zu niedrig angesetzt ist, werden die Kolonien ausgeschlossen. Sobald der Schwellenwert festgelegt ist, wendet das Makro Gaußsche Unschärfe an, um die Kanten weicher zu machen und Aliasing zu reduzieren, der Wassereinzugsgebietsfilter teilt überlappende Kolonien und die Blobs werden mit Analysepartikeln gezählt.

Manchmal ist die Dichte der Kolonien an einer bestimmten Stelle zu hoch. Count-On-It bietet eine Möglichkeit, damit umzugehen. Um die Anzahl der Kolonien in einer Gitterzelle mit teilweise verschmolzenen Kolonien abzuschätzen, wird zunächst die durchschnittliche Fläche eines kreisförmigen Kleckses von der gesamten Platte als C_avg genommen. Dann wird die Fläche von Blob A 1 durch die durchschnittliche Fläche eines kreisförmigen Blobs A₁/C_avg dividiert_. Diese Zahl wird auf die nächste ganze Zahl gerundet, und das ist die Schätzung dafür, wie viele Kolonien sich in einem Blob befinden. Diese Funktion ist ein Grund, warum der Schwellenwert die Zählergebnisse beeinflussen kann: Die relative durchschnittliche Koloniefläche im Vergleich zu einem zusammengeführten Blobbereich unterscheidet sich, je nachdem, wie sich der Schwellenwert auf zusammengeführte Blobs auswirkt.

Die vorgestellten Methoden haben mehrere Einschränkungen. Dazu gehört die Notwendigkeit von Geräten, um flüssige Medien präzise von 96-Well-Platten zu dosieren. Diese Ausrüstung, entweder ein 96-Kanal-Pipettiergerät oder ein geschlitztes Replikator-Pin-Tool, kann Tausende von Dollar kosten. Billigere Alternativen existieren, sind aber weniger genau. Die automatisierte Zählung über Count-On-It weist ebenfalls einige Einschränkungen auf. Wenn beispielsweise zwei Kolonietypen in einer gemischten Population allein aufgrund der Größe abgegrenzt würden, wäre die Blobzählung nicht in der Lage, Kolonien dem richtigen Typ zuzuordnen. In diesem Fall müssten Flecken mit Blobs aus der Zählung eliminiert werden. Eine weitere Differenzierung von Kolonien auf der Grundlage der Morphologie wäre eine wertvolle Erweiterung der Methode, die derzeit nicht implementiert ist. Der Einsatz selektiver Medien wie stammspezifische Nährstoffe und Antibiotika vereinfacht die aufwändige Bildanalyse.

Die Durchführung von Fruchtfliegenexperimenten in 96-Well-Platten vervielfacht die Anzahl der Proben und Bedingungen, die in einem einzigen Experiment getestet werden können, und kann Hochdurchsatz-Screens in Drosophila-Bakterien-Assoziationsphänotypen erleichtern. Wir stellen uns vor, dass diese Methode erweitert werden kann, indem selektive Medien verwendet werden, um viele Bakterienstämme in komplexen Mischungen zu unterscheiden. Die Methode ist nicht auf die Untersuchung des Fliegenmikrobioms beschränkt. Die Quantifizierung von KBE ist in vielen Anwendungen der Mikrobiologie üblich, von der Coliformenzahl im Trinkwasser bis zur Identifizierung von Krankheitserregern. Das hier vorgestellte CFU-Beschichtungssystem ermöglicht Hochdurchsatzsiebe sowie die automatisierte Erfassung, Verarbeitung, Speicherung und Lieferung von Ergebnissen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bead beating and spot plating
Fly vials	Genesee	32-121	autoclavable
Fly vial stoppers	Genesee	59-201	autoclavable
Hand Applicator	3M	3M PA1
Heat Sealer	Eppendorf	5390
Mini-Beadbeater 96	BioSpec	1001
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm	BioSpec	11079105
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner	Labnet	LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor	Mettler Toledo	30296705	Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural	USA scientific	1402-9220	Must be polypropylene for heat sealer
Thermal Bond Heat Seal Foil	4titude	4ti-0591	Keep sterile
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile	SPL Life Sciences	31001	For making rectangular agar plates
Photobox construction
¼”-20 X ½” Bolts (X2)	Amazon	ASIN: B07BP1WR3H	To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.
¼”-20 x ½” Connector Nut	Amazon	UPC: 799862376780	AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.
¼”-20 x ¾” bolts (X3)	Amazon	ASIN: B003QZSZY4	For the plate holder. Brand not important.
1/8” x ½” washer	Amazon	UPC: 611982484599	Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft	Superbrightleds.com	WP18-2
22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4	Superbrightleds.com	WN-R2210
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3	Superbrightleds.com	SCFP-2218
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3	Superbrightleds.com	SBL-MA2P-8-2
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3	Superbrightleds.com	SBL-MA2P-8-1
6” drawer handle	Amazon	ASIN: B07Z331P99	Any drawer handle should work.
6” Drawer slides	Btibpse	UPC: 712243424979	Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.
8-32 x ½” Cap Nuts (x4)	Amazon	ASIN: B00HYLZB98	Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4)	Amazon	ASIN: B07KX9T7NF	To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
Acrylic Glue	SCIGRIP	Ean: 7844908489337	SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle
Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long	Superbrightleds.com	CT-B04-10
Camera L-Bracket	WLPREOE, Vikerer, Unbranded	ASIN: B09X46YKQZ	The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Canon T series camera for tethering option OR	Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc..	1894C002	The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters	Superbrightleds.com	STN-BBLU-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters	Superbrightleds.com	STN-BGRE-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters	Superbrightleds.com	STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Drill with ¼”, 1/8” drill bits	Black & Decker	‎BDCDD12PK	Brand not important.
Flat Black Spray Paint,  2X Ultra-Matte	Rustoleum	331182	Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.
Laser Cut Acrylic Walls	Big Blue Saw	www.bigbluesaw.com	Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera
Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt	Superbrightleds.com	LPV-20-24
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer	Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.	DMC-ZS100K	Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good.
Quick Release Plate	Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch	ASIN: B07417F21D	Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Rubber Bands, Assorted sizes	BAZIC Products	Alliance Rubber 26649	Rubber bands go on the plate holder. Brand not important.
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4	Superbrightleds.com	CTMB-20
SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3	Superbrightleds.com	RRS-SP
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm	Tiffen	72R29
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm	Tiffen	7258
Software
ImageJ64	https://imagej.net/downloads	N/A	Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSX	Apple	N/A	Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it.
Unix	BSD	N/A	64 bit
Windows	Microsoft	N/A	64 bit