Быстрый подсчет колониеобразующих единиц в формате 96-луночной пластины применительно к микробиому дрозофилы

Резюме

Этот метод количественно оценивает микробное изобилие с использованием 96-луночного формата пластины для пластинчатых колониеобразующих единиц (КОЕ) и применяется к микробиому дрозофилы в образцах гомогената цельной мухи. КОЕ подсчитываются с помощью автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений, представленного здесь.

Аннотация

Кишечник животных колонизирован комменсальными микробами, которые влияют на развитие, здоровье и поведение хозяина. Точная количественная оценка колонизации имеет важное значение для изучения сложных взаимодействий между хозяином и микробом как для проверки микробного состава, так и для изучения его эффектов. Drosophila melanogaster, которая имеет низкое нативное микробное разнообразие и экономична для выращивания с определенным микробным составом, появилась в качестве модельного организма для изучения кишечного микробиома. Анализ микробиома отдельного организма требует определения того, какие микробные виды присутствуют, и количественной оценки их абсолютного изобилия. В данной статье представлен метод анализа большого количества отдельных микробиомов мух. Мухи готовятся в 96-луночных пластинах, что позволяет обрабатывать большое количество образцов одновременно. Микробное изобилие измеряется путем покрытия до 96 целых гомогенатов мух на одной агаровой пластине в массиве пятен, а затем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ), которые растут в каждом месте. Эта система покрытия работает в паре с автоматизированной платформой количественной оценки КОЕ, которая включает в себя фотографирование пластин, дифференциацию флуоресцентных колоний и автоматизированный подсчет колоний с использованием плагина ImageJ. Преимущества заключаются в том, что (i) этот метод достаточно чувствителен для обнаружения различий между обработками, (ii) метод точечного покрытия так же точен, как и традиционные методы гальванического покрытия, и (iii) автоматизированный процесс подсчета является точным и быстрым, чем ручной подсчет. Рабочий процесс, представленный здесь, позволяет высокопроизводительную количественную оценку КОЕ в большом количестве реплик и может быть применен к другим системам микробиологических исследований, включая in vitro и другие модели мелких животных.

Введение

Связь между кишечной микробиотой и их животным-хозяином все чаще находится на переднем крае биологических исследований¹, которые показывают, что штаммовый состав микробиома важен для физиологии хозяина ^2,3,4. Темпы открытия были ограничены смешанными факторами, такими как высокая естественная межиндивидуальная изменчивость и высокое разнообразие^{колонизирующих} бактерий ^5,6,7. Плодовая муха, Drosophila melanogaster, стала многообещающей моделью из-за ее естественного микробиома с низким разнообразием, простоты обращения и надежной генетики хозяина 8,9,10,11. Мухи могут быть сделаны свободными от микробов и повторно ассоциироваться с определенной микробиотой¹², и было показано, что флора влияет на физиологические черты^{мухи 13,14}. Врожденная флора состоит из ограниченного набора бактерий, которые все культивируемы, и близкие родственники их также эндогенны для кишечника млекопитающих, включая лактобациллы, протеобактерии и энтерококки¹⁵.

Изучение влияния микробиома на признаки хозяина требует количественной оценки микробиома с точки зрения как того, какие виды присутствуют, так и их абсолютного изобилия¹⁶. Преобладающими способами анализа микробиома мухи являются колониеобразующая единица (КОЕ)¹⁷, секвенирование ампликона гена рРНК^{16S 9} и qPCR гена 16S рРНК¹⁸. Количество КОЕ можно получить без дорогостоящих реагентов, и они подтверждают жизнеспособность бактериальных клеток¹⁹. Методы 16S, включая qPCR, имеют преимущества в том, что таксономические идентичности микробов могут быть установлены без учета их требований к росту или морфологии колоний²⁰.

В случае, когда в экспериментах используются мухи с определенным микробиомом известных бактерий (гнотобиотических мух), количество КОЕ имеет особые преимущества по сравнению с секвенированием²¹. Секвенирование является дорогостоящим и требует экстракции ДНК, подготовки библиотеки на основе ПЦР и высокопроизводительного секвенирования для получения относительного изобилия²². Из-за высокой стоимости высокопроизводительные методы секвенирования обычно необходимо выполнять оптом, чтобы снизить цену за образец²³. Дальнейшие методы, такие как qPCR, необходимы для получения абсолютных количеств¹⁶. Напротив, подсчет КОЕ быстрый и дешевый и дает абсолютное количество жизнеспособных клеток. Drosophila⁸ и другие модели²⁴ малого микробиома, включая червя Caenorhabditis elegans^25,26 и личинку рыбки данио, Danio rerio, выращенные гнотобиотически²⁷, имеют ограниченный спектр бактерий, которые имеют известные характеристики роста²⁸. В этих случаях, особенно у гнотобиотических животных, подсчет КОЕ может дифференцировать все виды бактерий в многовидовых кишечных сообществах 21,27,29. Высокопроизводительные методы подсчета КОЕ еще больше повысят экономическую эффективность и скорость измерения состава микробиома и могут быть применены ко многим другим микробиологическим экспериментам.

Подсчет КОЕ путем последовательного разбавления бактериальной суспензии на питательных средах на основе агара является стандартным методом в области микробиологии. Колонии, которые растут на пластинах, затем подсчитываются вручную. Разведения позволяют исследователю выбрать плотность колоний, которая поддается подсчету (например, ~ 100 КОЕ на пластину), что означает, что колонии не растут друг в друга и могут быть подсчитаны за разумное количество времени. Большинство микробиологов используют по сути тот же метод подсчета КОЕ, разработанный 140 лет назад в лаборатории Роберта Коха, и для многих применений этот метод до сих пор адекватен. Однако возникает проблема при попытке количественно оценить большое количество образцов. Для одного образца может потребоваться нанесение от 1 до 10 последовательных разбавлений образца для получения поддающихся подсчету КОЕ, поэтому эксперименты с участием более нескольких десятков образцов становятся обременительными. Для повышения эффективности перечисления КОЕ разработаны различные методы. Автоматизированное спиральное покрытие устраняет необходимость в последовательных разведениях³⁰, делая только одну пластину необходимой для подсчета КОЕ, но увеличивая время на заполнение образца. Однодисковое последовательное пятнистое разбавление (SP-SDS) позволяет оценивать КОЕ с меньшим количеством пластин на образец³¹. Эти методы являются улучшением традиционного метода нанесения покрытий, но по-прежнему требуют обработки и покрытия бактериальных образцов по отдельности и, таким образом, не идеальны для высокой пропускной способности. Обработка образцов в 96-луночных пластинах и точечное покрытие этих 96 образцов на прямоугольных агаровых пластинах значительно улучшает пропускную способность образцов¹⁹.

Микробиомы обычно состоят из нескольких штаммов и видов. В то время как виды часто можно отличить по морфологии колоний или питательным средам, флуоресценция может быть использована для дальнейшего различения различных типов бактерий и их признаков роста³². Например, различные генотипы одного и того же вида могут быть помечены различными генетически закодированными флуоресцентными белками. Методы визуализации пластин, которые включают флуоресценцию, позволяют исследователям использовать эти генетические методы в анализах на основе КОЕ³². Включение флуоресценции в высокопроизводительные методы подсчета КОЕ еще больше повысит их полезность.

Подсчет КОЕ вручную становится громоздким при наличии большого количества образцов. Автоматизированный подсчет КОУ может проводиться путем фотографирования пластины и обработки изображения с использованием специализированного программного обеспечения³³. Sieuwerts et al. объединили улучшенную эффективность покрытия пятнистого покрытия с автоматизированным подсчетом колоний с использованием обычной цифровой фотографии и программного обеспечения ImageJ¹⁹.

Высокопроизводительный метод скрининга фенотипов конкретных микробов и ассоциаций хозяев поможет исследованиям сборки сообщества микробиома и влияния на здоровье и приспособленность хозяина. Для исследований микробиома дрозофилы высокопроизводительная микробиологическая платформа будет включать обработку образцов мух в формате пластины с 96 лунками, лизис мухи без бактериального лизиса, эффективность точечного покрытия, возможность использовать флуоресценцию и различать несколько флуорофоров, контролируемую световую среду для воспроизводимой визуализации пластин КОЕ и надежное автоматизированное программное обеспечение для подсчета колоний. В этой статье описывается метод, оптимизированный для анализа КОЕ у гнотобиотических мух, который является простым, быстрым и автоматизированным. Этот протокол описывает новый рабочий процесс, сочетающий в себе лучшие из ранее опубликованных методов и оптимизированный для изучения кишечного микробиома у дрозофилы.

протокол

1. Колонизация мух

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод подходит для количественного анализа мух с культивируемым кишечным микробиомом путем покрытия роста КОЕ. Подробный протокол выращивания гнотобиотических мух был ранее опубликован¹².

1. Установить стабильную колонизацию комменсальными видами бактерий.
   1. Готовят свежую бактериальную культуру, гранулируют центрифугированием при 400 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и повторно суспендируют клеточную гранулу в PBS до OD600 1,0. Для этого протокола Lactiplantibacillus plantarum (ранее известный как Lactobacillus plantarum) выращивали ночью до OD600 2,0.
   2. Пипетка 100 мкл на пищу во флаконе (см. Таблицу материалов). Распределите равномерно и дайте жидкости впитаться в течение 15-30 мин.
   3. Перенесите 20 мух без микробов в этот флакон, используя стандартную технику переворачивания флакона во флакон³⁴. Каждая муха съест примерно равное количество бактериальной дозы³⁵. В качестве альтернативы могут быть добавлены яйца без микробов.
   4. Переводите мух на свежую стерильную пищу ежедневно в течение 3 дней. Сделайте все это в шкафу биобезопасности и используйте стерильную технику (рисунок 1А-1).
2. Перед измерением нагрузки КОЕ переведите мух во флакон, содержащий стерильную агар-воду, в течение 4 ч, чтобы очистить кишечник от преходящих бактерий. Флаконы с агаровой водой обеспечивают источник влаги для мухи, но не питают муху или бактерии на поверхности. Они готовятся в тех же стерильных флаконах, что и при стандартной пище, но содержат только деионизированную воду и 1,5% агара.

2. Гомогенизация мух по отдельности в 96-луночной ПЦР-пластине

1. Заранее подготовьте шариковые тарелки.
   1. Вылейте стеклянные бусины размером 0,5 мкм (см. Таблицу материалов) на лоток для измерения бусин (напечатано на 3D-принтере с помощью файла дополнительного кодирования 1 S1-bead-measurer.stl). Выложите бусины на лоток так, чтобы все колодцы были полными и ровными, а затем смахните лишние бусины в коническую трубку, чтобы восстановить их.
   2. Поместите полуплинковую ПЦР-пластину (см. Таблицу материалов) вверх ногами на измерительный лоток и выровняйте ее с колодцами, установив ее в углубление на измерительном лотке. Затем быстро переверните его, чтобы перенести бусины.
   3. Снимите лишние шарики с поверхности ПЦР-пластины и накройте ее фольгой. Осмотрите пластину ПЦР, чтобы убедиться, что все колодцы содержат бусины. Используйте весовой совок, если это необходимо, чтобы добавить бусины в один колодец. Если статическое электричество приводит к тому, что шарики прилипают к поверхностям пластин, протрите или распылите заднюю часть измерительного лотка и пластину ПЦР 70% этанола.
   4. Покрытие алюминиевой фольгой. Многие пластины могут быть приготовлены таким образом, а затем автоклавированы и сохранены для последующего использования. Когда все будет готово к использованию, добавьте 100 мкл PBS в каждую скважину с помощью 96-канального пипетатора (см. Таблицу материалов).
2. Поверхностная стерилизация мух, колонизированных микробами (см. этап 1) 70% этанолом перед гомогенизацией.
   1. Обезболивайте мух 100% CO₂ в течение 5 с. Перенесите обезболенных мух из флакона в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл с помощью небольшой воронки (рисунок 1А-2). В этом исследовании обычно добавляли 25 мух на трубку.
   2. Немедленно распылите ~1 мл 70% этанола в пробирку, закройте трубку и перемешайте путем инверсии в течение 10 с. Затем аспирируйте этанол пипеткой P1000, стараясь не аспирировать мух. Повторить еще раз с этанолом, затем дважды со стерильным PBS (рисунок 1A-3).
3. После окончательной промывки PBS закройте трубку и, опустив крышку вниз, несколько раз сильно постучите по ней по скамейке, чтобы мухи заходили в колпачок.
4. Откройте трубку и дозируйте мухи в колодцы с помощью щипцов (рисунок 1А-4). Поместите по одной мухе в каждую скважину (рисунок 1А-5). Держите пластину на льду во время погрузки, чтобы мухи были обезболены.
5. Запечатайте пластину с помощью термоуплотнительной пленки Thermal Bond (см. Таблицу материалов).
   1. Во-первых, удалите любые блуждающие бусины, которые находятся близко к колодцам, так как они могут вызвать утечку в уплотнении фольги. Убедитесь, что тусклая сторона фольги ориентирована вниз на пластину, а блестящая сторона вверх к термоуплотнителю. Плотно прижмите термоуплотнитель (см. Таблицу материалов) в течение 5 с (рисунок 1А-6). Отполируйте с помощью ручного аппликатора (см. Таблицу материалов) для закрепления фольги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плохая герметизация является причиной потери образца.
6. Закрепите пластину в шейкере пластины. Гомогенизировать в течение 5 мин (рисунок 1А-7). Открутите шариковую пластину в течение 30 с в мини-пластинчатом спиннере (см. Таблицу материалов) при 350 х г, чтобы удалить жидкость из уплотнительной фольги.
7. Снимите фольгу, удерживая пластину, чтобы не выплеснуть капли гомогената мухи из лунок.

3. Последовательное разбавление гомогената мухи и пятнистость на пластинах КОЕ

1. Поместите четыре прямоугольные пластины роста агара MRS (см. Таблицу материалов) в шкаф биобезопасности и снимите их крышки. В этом протоколе агар MRS использовался для роста L. plantarum. Оставьте эти тарелки сохнуть не менее 10 минут (20 минут, если они свежевылиты или холодные из хранилища).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если пластины влажные, капли из 96-луночной пластины будут бежать вместе и портить счетчики.
2. Подготовьте три разбавляющие пластины, добавив 100 мкл PBS в каждую скважину стерильной 96-луночной пластины с помощью 96-канального пипетки. Загрузите стойку наконечников P20 на 96-канальный пипетку.
3. Производят разбавление 1:10 путем аспирации 11,1 мкл гомогената из пробной пластины, подготовленной в разделе 2 (рисунок 1А-8). Обязательно рисуйте с середины колодцев, а не со дна колодцев, потому что муха гомогенатная, а стеклянные бусины будут забивать пипетки. Бусины опускаются, а частицы мухи плавают, оставляя средний слой в основном прозрачным.
4. Дозируйте 11,1 мкл в первую разбавляющую пластину, которая уже содержит 100 мкл стерильного PBS на лунку. Держите разбавляющую пластину на шейкере пластины в течение 10 с при 600 об/мин. Снова перемешайте путем пипетки вверх и вниз в течение пяти циклов. Переложите 11,1 мкл с первой разбавляющей пластины на вторую разбавляющую пластину и повторите этапы смешивания для следующих двух пластин разбавления.
5. Выполните последовательное нанесение покрытий на разбавление, как описано ниже.
   1. Извлеките пластины роста из шкафа биобезопасности.
   2. Начиная с наиболее разбавленной пластины, поместите 2 мкл из каждой скважины на агаровые пластины с помощью 96-луночного пипетки (рисунок 1А-9).
      1. Медленно опустите головку пипетка на пластину, следя за тем, чтобы не врезаться в агар. Внимательно осмотрите тарелку и убедитесь, что все пятна были распределены; если нет, вручную добавьте 2 мкл в соответствующее положение. Убедитесь, что жидкие пятна быстро впитываются в агар и не сбегают вместе.
      2. Если пятна сливаются вместе, высушите новый набор свежих тарелок с агаром в течение более длительного периода и переделайте пятнистость. Если есть несколько типов пластин (например, разные среды или с антибиотиками), обратите внимание и на них. Дозируйте оставшийся раствор обратно в разбавляющую пластину и переходите к следующей более высокой концентрации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При обнаружении пятнистых разведений смешайте следующее разбавление пять раз, чтобы убедиться, что содержимое кончиков пипетки очищено от предыдущего разбавления. Разбавляющие пластины можно хранить >8 ч при 4 °C, не влияя на количество колоний³⁵.
6. Повторите процесс нанесения покрытий, как описано на этапе 3.5, для оставшихся разрежающих пластин, переходя от наиболее разбавленных к наиболее концентрированным до пластины с исходным гомогенатом.
7. Когда вся жидкость будет поглощена агаром, переверните пластины и поместите их в инкубатор (рисунок 1А-10). Для Lactiplantibacillus и Acetobacter от Drosophila оптимальная температура составляет 30 °C на средах MRS. Инкубируйте до тех пор, пока колонии не достигнут оптимального размера: колонии достаточно велики, чтобы четко их видеть, но не настолько велики, чтобы они сливались или мешали росту друг друга (см. репрезентативные результаты для количественной оценки оптимального размера).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные условия роста зависят от штамма и должны определяться эмпирически. Для Lactiplantibacillus от Drosophila оптимальное время инкубации составляет от 26 ч до 30 ч на МРС агар. Для Acetobacter от Drosophila оптимальное время инкубации составляет от 30 ч до 48 ч на МРС в зависимости от штамма.
8. После инкубации храните пластины при температуре 4 °C, если это необходимо, до готовности к подсчету.

4. Количественная оценка КОЕ

1. Количественно оцените КОЕ, сфотографировав пластины, а затем подсчитав колонии с помощью автоматизированного программного обеспечения, как описано ниже. Если пластины хранились при 4 °C, сначала дайте им достичь комнатной температуры, чтобы на пластинах не было конденсата, который производит блики.
2. Организуйте пластины в логической последовательности и держите их в таком порядке во время фотографирования — это облегчает именование файлов. Сориентируйте все пластины так, чтобы A1 находился в левом верхнем углу для всех пластин. Рекомендуется пометить угол А1 уникальным идентификатором, чтобы не было путаницы фотографий. Укладывайте каждую серию разбавления по порядку.
3. Снимите крышку пластины и поместите пластину на сцену с ориентацией A1 в правильном углу. Конструкции включены в фотобокс пластины (Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2), который оптимизирован для фотографирования этих пластин лотка и включает в себя варианты освещения и фильтра для изображения флуоресцентных колоний.
4. Создайте изображение пластин. Используйте камеру (см. Таблицу материалов) с ручными настройками для достижения постоянного уровня экспозиции между пластинами. Рекомендуется установить длинное фокусное расстояние, чтобы свести к минимуму искажения перспективы. Сделайте снимок с помощью дистанционного затвора, чтобы свести к минимуму размытие от дрожания камеры.
5. Перенесите изображения на компьютер и переименуйте их, включая название эксперимента, тип носителя, коэффициент разбавления и любые другие соответствующие сведения. Некоторые операционные системы (см. Таблицу материалов) имеют полезную функцию пакетного переименования в Finder, щелкнув правой кнопкой мыши по выбору файлов.

5. Автоматический подсчет колоний с помощью набора Count-On-It (Дополнительный файл 3)

1. Обрежьте изображения с помощью предоставленного плагина Croptacular (Дополнительный файл кодирования 2) для ImageJ. Этот плагин помогает разделить изображение на упорядоченный массив субрегионов (например, 8 x 12 для 96-луночной пластины). Субрегионы будут подсчитываться индивидуально.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельный плагин для подсчета круглых пластин под названием Circus описан в файле дополнительного кодирования 3 Circus_.ijm.
   1. Организуйте изображения, подлежащие обработке для количественной оценки, в папку. Выберите имена файлов, которые отличают пластины, так как эти имена файлов становятся заголовками столбцов для каждого набора счетчиков. В этой папке создайте вложенные папки с именами «обрезанные» и «квитанции».
   2. Запустите Croptacular и нажмите кнопку ОК, чтобы начать обрезку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки по умолчанию отображаются и обычно достаточны. В зависимости от разрешения изображения, освещения, размера пятна и т. Д., Может быть полезно настроить базовые параметры.
   3. Если изображение уже прямое, просто нажмите клавишу Пробел. В противном случае выпрямите изображение, проведя линию вдоль края, который должен стать горизонтальным. Перерисуйте линию столько раз, сколько необходимо, если изображение по-прежнему не выглядит выпрямленным.
   4. Затем нарисуйте граничное поле области, для которой должен быть выполнен подсчет. Отрегулируйте размер и пропорции, пока все пятна не окажутся в их клетках. Перетащите курсор за пределы поля границы, чтобы обновить сетку. Когда сетка выглядит хорошо, нажмите клавишу Пробел.
   5. Убедитесь, что следующее изображение автоматически поворачивается под тем же углом, что и первое; плагин предполагает, что все фотографии выровнены одинаково. Если это так, нажмите клавишу Пробел , чтобы продолжить. В противном случае выпрямите изображение, как и раньше. Сетка также напоминает то же положение, что и предыдущее изображение; при необходимости отрегулируйте, а затем нажмите клавишу Пробел.
2. Перечислите колонии на пластинах с помощью предоставленного плагина Count-On-It: Gridiron для ImageJ (Дополнительный файл кодирования 4). Подробные инструкции по установке и использованию плагина включены в Дополнительный файл 3.
   1. Запустите Count-On-It > Gridiron. Используйте те же настройки сетки, что и в Croptacular. Пользователи могут пакетировать целую папку, анализировать одно изображение или начинать с текущего образа.
   2. Установите пороговое значение на основе верхнего и нижнего значения интенсивности пикселя. Сделайте порог как можно более строгим, все еще отбирая все колонии. В идеале между выбранными колониями должно быть некоторое пространство, но программное обеспечение способно сегментировать большие двоичные объекты в определенной степени. Нажмите кнопку ОК в диалоговом окне «Требуется действие», когда пороговое значение будет удовлетворительным.
   3. Чтобы проверить результаты, увеличьте масштаб и присмотритесь к подсчетам колоний. Нажатие кнопки отмена приведет к прерыванию плагина. Нажмите кнопку ОК , чтобы продолжить.
   4. На первом изображении убедитесь, что дана опция для продолжения или возврата в меню настройки, например, для изменения минимального размера колонии. Чтобы продолжить пакетный процесс, нажмите кнопку ОК. Затем выберите папку, в которой будут храниться квитанции и таблица результатов. Используйте папку "receipts" или создайте новую папку.
   5. После первого изображения следующие изображения по умолчанию будут иметь то же пороговое значение, что и предыдущие настройки. Нажмите кнопку ОК , чтобы использовать эти параметры или настроить их. Если фотографии согласованы и настройка точна, нажмите кнопку ОК в диалоговом окне «Требуется действие».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только все изображения в пакете завершены, таблица результатов автоматически сохраняется в той же папке, что и квитанции.
   6. Просмотрите квитанции о подсчете, созданные программным обеспечением, и вручную исправьте все ошибки подсчета. Подключаемый модуль ImageJ является статистически точным, но ошибки возникают. Доказательство квитанций, чтобы изучить выбросы и выявить просчеты. Программа сохраняет данные CFU в виде файла .csv в той же папке, что и квитанции.
3. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения, предпочитаемого пользователем.

Результаты

Перечисление КОЕ в сотнях отдельных мух в формате 96-луночной пластины с использованием колонизационного анализа
Чтобы понять состав многих отдельных микробиомов мух, КОЕ были измерены с использованием сопутствующего протокола, который позволил идентифицировать присутствующие виды, процент колонизированных мух и абсолютное количество бактерий в каждой мухе. Причины больших наблюдаемых индивидуальных вариаций в составе микробиома плохо изучены, и количественная оценка статистического распределения колонизации может помочь изучить эту вариацию^36,37. Для получения значительного количества биологических реплик был разработан высокопроизводительный конвейер для количественной оценки численности микробов у многих отдельных мух с использованием подсчета КОЕ (рисунок 1А).

На окончательную количественную оценку КОЕ может влиять то, как обрабатываются мухи до анализа, например, факторы, включая поверхностную стерилизацию, время с момента потребления бактерий и очистку преходящих бактерий из кишечника. Во-первых, сосредоточив внимание на комменсальном бактериальном виде Drosophila L. plantarum (Lp; см. Штамм Lp WF в Obadia et ^al.36), мух кормили дозой ~ 10⁵ КОЕ Lp и держали в группах по 25 мух на флакон. Этих мух либо держали в одном флаконе в течение 3 дней, либо ежедневно переносили (переносили) на свежую, стерильную пищу (рисунок 1В). Затем непередаваемых мух либо промывали в этаноле для удаления поверхностных бактерий (промывали), либо не промывали (немытые). Стирка привела к незначительному снижению общего количества измеренных КОЕ (рисунок 1B), что указывает на то, что в этих строго контролируемых условиях прививки поверхность мухи не становится значительно колонизированной бактериями в течение 3 дней. Остальные группы мух переносили каждый день, чтобы уменьшить накопление бактерий от роста на пище (Перенесено); Кроме того, группу переводили на свежую пищу в течение 4 ч перед отбором проб (Post-Transfered), или их помещали во флаконы только со стерильной агар-водой в течение 4 ч (Очищено), чтобы позволить временно проглоченным микробам очиститься из кишечника. Каждый из этих шагов по обеспечению более строгого измерения колонизации привел к статистически значимому сокращению обилия КОЕ у мух, за исключением поверхностной промывки этанолом. Перенос на стерильную пищу (Post-Transfered) или агар-воду (Очищенный) за 4 ч до измерения давал неразличимые эффекты, свидетельствующие о том, что переход в стерильные условия за 4 ч до измерения снижает бактериальную нагрузку. Этот результат согласуется с интерпретацией, что некоторые кишечные бактерии в кишечнике мухи являются преходящими, в то время как другие более стабильно связаны³⁵. Обилие Lp варьировалось от 1 x 10^4,3 CFU / муха в очищенных мухах до 1 x 10^4,9 CFU в немытых мухах (n = 724 мухи).

Затем такой же анализ проводили с использованием Acetobacter indonesiensis (Ai), грамотрицательной бактерии, которая колонизирует кишечник мухи (Рисунок 1C; см. штамм Ai SB003 в Obadia et al.36). Как и в случае с Мухами, колонизированными Lp, поверхностная стерилизация привела к незначительному сокращению КОЕ. Аналогичным образом, ежедневный переход на стерильную пищу значительно снижал бактериальную нагрузку, а переход в стерильные условия в течение 4 ч до гомогенизации приводил к дальнейшему снижению бактериальной нагрузки. Обилие Ai варьировалось от 1 x 10^4,7 CFU / муха в очищенных мухах до 1 x 10^5,0 CFU в немытых мухах (n = 528 мух). Таким образом, точная количественная оценка кишечных бактерий зависит от частоты переноса, в том числе в день переноса. Снятие внешней бактериальной нагрузки путем промывки в этаноле имело незначительный эффект, но более значительные эффекты могут наблюдаться для разных штаммов бактерий или различных условий культивирования. Эти факторы следует контролировать экспериментально.

Также было проверено потенциальное влияние метода гомогенизации на количество КОЕ. Мухи гомогенизировали с помощью бисерной колотушки со стеклянными шариками 0,5 мкм в 100 мкл PBS, что могло снизить жизнеспособность бактериальных клеток. Сначала суспензию Бактерий Lp из культуры готовили в PBS, а затем покрывали для подсчета КОЕ в качестве положительного контроля. Эту же культуру помещали в пластину бисерной колотушки и (i) гомогенизировали бисером, (ii) гомогенизировали бусинами и мухой без микробов или (iii) гомогенизировали в PBS без бисера (рисунок 1D). Гомогенизация в бусинах при наличии мухи существенно не влияла на обилие жизнеспособных клеток в растворе, тогда как гомогенизация бактерий в отсутствие мухи убивала значительное количество бактериальных клеток. Гомогенизация в PBS без шариков также значительно уменьшила количество жизнеспособных клеток. Аналогичным образом, жизнеспособность Ai сохранялась при гомогенизации в присутствии мухи, в то время как гомогенизация без мухи уменьшала количество жизнеспособных клеток в растворе (рисунок 1E). Эти результаты показывают, что ткань мухи защищает бактерии от уничтожения шариками во время гомогенизации. Однако эксперименты на рисунках 1D и 1E проводились с более чем 10⁸ КОЕ на скважину. На практике было обнаружено, что колодцы с ~ 10⁶ клетками на лунку или менее показывают небольшую потерю клеток, когда шарики использовались без мухи. Охлаждение пластины на льду на полпути через бисерное биение также улучшает жизнеспособность клеток. Важность этих результатов заключается в том, что читатели должны знать об этих потенциальных проблемах и разрабатывать соответствующие элементы управления для их конкретного варианта использования.

Точность точечного покрытия 96-луночных пластин для количественной оценки КОЕ с высокой пропускной способностью
Поскольку цель состоит в том, чтобы измерить обилие КОЕ для сотен и тысяч отдельных мух, традиционные методы разбрасывания покрытий являются непомерно трудоемкими и материалоемкими. Точечное покрытие является эффективным и действенным методом роста и перечисления КОЕ^19,31. Метод точечного покрытия использует 96-канальный пипеттор для дозирования 2 мкл бактериальной суспензии на среду, приготовленную в прямоугольных пластинах лотка (рисунок 2А). Каждое пятно представляет собой бактериальную нагрузку одного образца, поэтому 96 мух могут быть проанализированы с помощью одной пластины (рисунок 2B). Точность точечного покрытия сравнивали с традиционным покрытием путем инокуляции ростовых пластин с использованием одной и той же суспензии Lp 0,0001 OD для обоих методов. Подвеска была в два раза последовательно разбавлена пять раз в PBS. В качестве сравнения лицом к лицу 50 мкл инокулята было нанесено на отдельные круглые пластины, или 2 мкл пятен были сделаны на прямоугольных пластинах MRS. Затем пластины инкубировали при 30 ° C до тех пор, пока колонии не были подсчитаны. Полученные количества КОЕ для каждого разбавления использовали для расчета исходной концентрации суспензии и сравнивали (рисунок 2С). Круглые пластины с 50-500 КОЕ считались контрольными. Существенных различий между высокопроизводительными и традиционными методами круглого покрытия не наблюдалось.

Поскольку плотность колоний может влиять на их рост и количественную оценку, было проверено влияние плотности КОЕ на окончательные подсчеты. Пятна с 2-25 колониями на пятно не показали различий в конечном подсчете по сравнению с традиционным методом круглой пластины (рисунок 2C). Пятна со средним показателем в 35 колоний дали результаты, которые были немного ниже, чем контрольные пластины спреда (рисунок 2C; p = 0,0017). Внимательное изучение фотографий отдельных пятен показало, что этот перекос был обусловлен перекрытием колоний плотными пятнами. Измерения, основанные на пятнах со средним значением 11 колоний на пятно, привели к концентрациям, близким к концентрациям, основанным на пластинах спреда (рисунок 2C; Спредовые пластины: среднее = 1 x 10^4,4 КОЕ; SD = 0,086 по сравнению с пятнами с 11 средними колониями: среднее = 1 x 10^4,4 КОЕ; SD = 0,12, p = 0,42, t-тест Уэлча).

Создание высококачественных изображений для количественной оценки с использованием специализированной фотоплатформы с белым светом или флуоресценцией
Высокопроизводительное точечное покрытие естественным образом генерирует большое количество целевых областей, которые должны быть точно подсчитаны. Качественные фотографии могут использоваться для документирования данных и облегчения подсчета КОЕ. Надежная и простая фотоплатформа была разработана с использованием коммерчески доступных материалов (рисунок 3A). Цифровая камера была прикреплена к кронштейну поверх специально изготовленного светового короба, называемого FluoroBox, и была направлена прямо вниз, перпендикулярно центру пластины. Цветной эмиссионный фильтр был опционально расположен перед объективом с помощью ползунка фильтра. Световой экран предотвращал блики объектива, блокируя прямой свет от светодиодных полос ниже. Светодиодные ленты освещали пластину с боков, а не сверху, чтобы предотвратить блики на пластине. В дополнение к белому свету, одноцветные синие и зеленые светодиоды использовались для возбуждения зеленых и красных флуоресцентных белков соответственно. Пластина удерживалась на месте держателем пластины на ящике, а ящик был оснащен ползунками ящика, чтобы облегчить вставку пластины. Полные проекты доступны в дополнительном файле 1 и дополнительном файле 2.

Фотография пятнистой пластины колоний Lp была сделана с использованием светодиодов белого света и цифровой камеры, чтобы помочь в подсчете колоний и различии различных цветов и морфологий (рисунок 3B). Чтобы подтвердить, что интенсивность освещения была равномерной, интенсивность фона агара измеряли в разных областях фотографии пластины (рисунок 3C). Чтобы продемонстрировать, что колонии можно четко отличить от фона, интенсивность по диаметру 10 различных колоний на разных частях пластины была измерена и оказалась примерно на 300% выше фоновой (рисунок 3C). Пластину прививали Lp флуоресцентной белково-экспрессирующей плазмидой mCherry, а также некоторой Lp , которая не содержала плазмиды, поэтому колонии были либо mCherry-положительными, либо mCherry-отрицательными. Чтобы различить эти два типа колоний, пластину сфотографировали с помощью той же камеры с зеленым светодиодным светом (515-525 нм) и красным фильтром (Tiffen #29), заставляя mCherry-положительные колонии флуоресцировать (рисунок 3D). Разница в интенсивности между mCherry-положительным и mCherry-отрицательным была количественно определена путем измерения интенсивности в выборке колоний (n = 10 колоний). mВишне-положительные колонии были ~1000% выше интенсивности, чем mCherry-отрицательные (рисунок 3E). Колонии Ai , экспрессирующие GFP, и колонии Ai , не выражающие флуоресценцию, были сфотографированы с использованием синих светодиодных огней (465-475 нм) и зеленого фильтра (Tiffen #58) (рисунок 3F). GFP-положительные колонии показали на 200% более высокую интенсивность, чем GFP-отрицательные (рисунок 3G).

Автоматический подсчет КОЕ на точечных пластинах с помощью пользовательского плагина ImageJ Count-On-It
Фотографии сами по себе помогают в подсчете колоний (например, путем хранения данных, обмена данными, увеличения, маркировки наложения, разделения цветов и т. Д.). Тем не менее, акт ручного подсчета и организации результатов сотен пятен может быть утомительным, трудоемким и склонным к различиям между людьми в окончательных подсчетах. Для ускорения процесса подсчета и стандартизации воспроизводимости счетчиков был разработан специализированный плагин ImageJ под названием Count-On-It (рисунок 4A). Этот плагин обеспечивает точный полуавтоматический подсчет КОЕ на агаровых пластинах. Пользователь подготавливает изображения к подсчету, сначала обрезая и выпрямляя их с помощью дополнительного плагина Croptacular. Фотографии могут быть дополнительно обработаны пакетной обработкой, а порог может быть отрегулирован для каждой пластины. Несколько других опций позволяют пользователю повысить точность подсчета пластин, включая настройку длин световых волн (изображения RGB), установку диапазона размера колонии (в пикселях), изменение максимального соотношения сторон и настройку размеров активной сетки выделения. Count-On-It выводит таблицу результатов, причем каждая пластина представлена в виде столбца счетчиков КОЕ. Он также генерирует квитанцию с фотографией, показывающую наложение для визуального документирования результатов подсчета и помощи в ручной коррекции ошибок (рисунок 4B). Хотя ошибки случаются, когда количество колоний, подсчитанных вручную, сравнивалось с количеством колоний, подсчитанных с помощью этого плагина (рисунок 4C), соотношение было в целом эквивалентным, с линейной регрессией между ручными и автоматическими подсчетами, показывающими наклон 0,95 с точностью более 90% (R² = 0,93), хотя погрешность увеличивалась, когда число колоний превышало 20.

Count-On-It также может быть использован для отдельного подсчета флуоресцентных колоний с использованием функции флуоресценции FluoroBox. mВихер-положительное количество колоний (рисунок 4D) по программному плагину по сравнению с ручным имело^R2 0,92 (рисунок 4E). Аналогичным образом, GFP-положительные колонии (рисунок 4F), подсчитанные с помощью программного плагина по сравнению с ручным, имели R² 0,90 (рисунок 4G). Флуоресцентные и нефлуоресцентные колонии могут быть различимы в пределах одного образца, а размер и форма колонии могут быть дополнительно использованы для различения отдельных субпопуляций (рисунок 4H-K). В квитанциях с фотографиями есть запись, которая позволяет пользователю быстро проверить точность подсчетов и вручную исправить ошибки. На рисунке 4C, E, G, I, K, квитанции с фотографиями не использовались для повышения точности подсчета, чтобы читатели могли видеть необработанные выходные данные метода. Случаи, такие как на рисунке 4G, где ручное подсчет 1 дало автоматическое количество 21, могут быть быстро обнаружены с помощью фотоприпасов. В этом случае блики на краю пластины создавали капли, которые считались колониями. Для каждого варианта использования оптимальные настройки программного плагина должны быть определены до подсчета высокой пропускной способности.

Рисунок 1: Анализ колонизации измеряет КОЕ у сотен отдельных мух с использованием 96-луночного формата пластин. (A) Иллюстрированный обзор метода колонизации и высокопроизводительной количественной оценки, используемого в соответствии с описанием в разделе протокола. (B) Обилие Lactiplantibacillus plantarum (Lp) у мух после колонизационного анализа измерялось в различных условиях с использованием метода количественной оценки КОЕ с высокой пропускной способностью. Мух держали в одном флаконе в течение 3 дней, а затем гомогенизировали и покрывали (немытые), промывали этанолом перед покрытием (мыли), промывали и переносили каждый день (переносили), переносили ежедневно, затем держали на стерильной пище перед покрытием (после переноса) или держали во флаконах только с водой в течение 4 часов (очищено) (n = 724 мух всего, 3 биологических реплики и ~ 72 мухи всего за обработку). (C) Тот же анализ, что и в (B), проводили с использованием Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 мух). (D) Бактериальную суспензию Lp готовили в PBS, а затем покрывали для подсчета КОЕ или сначала гомогенизировали путем бисерного взбивания, взбивали бисером в сочетании с мухой без микробов (GF) или встряхивали на бисерной колотушке без шариков или мухи (n = 236 пробоотборных лунок). (E) Жизнеспособность Аи после гомогенизации испытывалась таким же образом, как и в (D) (n = 282 пробные скважины). Статистическая значимость для панелей (B-E) была рассчитана с использованием теста Крускала-Уоллиса, за которым последовали попарные тесты Уилкоксона с поправкой множественных сравнений Бонферрони. Коробка дает межквартильный диапазон. Линия обозначает медиану. Усы дают общий ассортимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Точность точечного покрытия 96-луночных плит для количественной оценки КОЕ с высокой пропускной способностью. (A) Точечное покрытие с использованием 96-канального пипеттера для дозирования 2 мкл на среду, приготовленную в прямоугольных лотковых пластинах. (B) Пластина роста MRS-агара с 96 пятнами колоний Lp . (C) Концентрация суспензии Lp на основе количества КОЕ из традиционных круглых пластин (n = 24 пластины) по сравнению с концентрацией, основанной на количестве КОЕ из точечных пластин (n = 680 пятен), последовательно разбавленных и упорядоченных по среднему количеству колоний на пятно (было подсчитано ~ 48 мест для каждого отдельного коэффициента разбавления для трех реплицированных пластин). Каждая точка данных представляет точные колонии на точку, в то время как каждый столбец представляет средние колонии для этого разбавления. Горизонтальная пунктирная линия указывает рассчитанное количество КОЕ культуры, которая была покрыта. Зелеными очерченными точками выделены традиционные круглые пластины. Красные точки подчеркивают оптимальную плотность колонии 11 КОЕ на пятно 2 мкл. Статистическая значимость была рассчитана с использованием обычного одностороннего ANOVA, сравнивающего среднее значение каждого столбца со средним значением контрольного столба разворотной пластины с поправкой множественных сравнений Бонферрони. Коробка дает межквартильный диапазон. Линия обозначает медиану. Усы дают общий ассортимент. **p < 0,01. ns = незначимый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Фотоплатформа производит количественные изображения пластин с использованием белого света или флуоресценции. (A) Обзор конструкции FluoroBox. (B) Фотография пятнистой пластины колоний Lp с использованием белого света. (C) Профиль интенсивности отдельных колоний при белом свете по сравнению с интенсивностью фона (BKG) (n = 10 колоний, пунктирная линия представляет собой стандартное отклонение). (D) Фотография той же пятнистой пластины, что и в (B), с использованием одноцветных зеленых огней и красного фильтра для выбора колоний Lp с положительным м-вишней. Е) Профиль интенсивности отдельных колоний, иллюстрирующий разницу между колониями с выбросами вишни и без них. (F) Фотография пятнистой пластины, содержащей колонии Ai , некоторые из которых имеют маркировку GFP. (G) Профиль интенсивности отдельных колоний, иллюстрирующий разницу между GFP-отрицательными и GFP-положительными колониями. E, F, G: n = 10 колоний на каждый участок. Диаметр колонии составляет примерно 1,5 мм. Пунктирная линия SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Точный подсчет точечных пластин с помощью плагина Count-On-It ImageJ. (A) Снимок экрана: окно настройки подключаемого модуля. (B) Подключаемый модуль генерирует квитанцию для подсчета документов и помогает в исправлении ошибок. Вкладка: Наложение с количеством колоний, подсчитанных для каждого точечного региона; желтый контур указывает на то, что была подсчитана одна колония, а красный — на то, что было подсчитано несколько колоний. (C) График, показывающий количество колоний, подсчитанных вручную, по сравнению с количеством колоний, подсчитанных с помощью плагина (автоматизированного) при использовании изображения белого света, где каждая точка на графике представляет собой одно пятно, подсчитываемое вручную или автоматически (наклон подгонки = 0,95, голубая линия; линия 1:1 пунктирую красным цветом; ^R2 = 0,93, коэффициент корреляции Пирсона, p < 0,0001). (D) Изображение получения фотографии из подключаемого модуля, когда mCherry-положительные колонии были выбраны с использованием флуоресцентной функции фотоблока. (E) График, показывающий количество мвышне-положительных колоний, подсчитанных с помощью ручного по сравнению с автоматизированным методом, когда использовалась красная флуоресценция (наклон подгонки = 1,1, голубая линия; линия 1:1 пунктирная красным цветом; ^R2 = 0,92, коэффициент корреляции Пирсона, p < 0,0001). Обратите внимание, что выбросы и ошибки не были исправлены с помощью аналитических квитанций для E,G,I,K. (F) Изображение получения фотографии из подключаемого модуля, когда GFP-положительные колонии были выбраны с использованием функции зеленой флуоресценции фотоблока и выбора зеленого канала с помощью плагина. (G) График, показывающий количество GFP-положительных колоний, подсчитанных с помощью ручного по сравнению с автоматизированным методом, когда использовалось зеленое флуоресцентное освещение (наклон подгонки = 1,1, голубая линия; линия 1:1 пунктирная красным цветом; ^R2 = 0,90, коэффициент корреляции Пирсона, p < 0,0001). (H) вишнеположительные колонии, выбранные из смешанных колониальных морфологий с использованием высокого порога флуоресценции в подключаемом модуле. (I) График, показывающий количество мвышне-положительных колоний, подсчитанных с помощью ручного по сравнению с автоматизированным методом при использовании красного флуоресцентного освещения (наклон подгонки = 0,99; ^R2 = 0,91, коэффициент корреляции Пирсона, p < 0,0001). (J) вишнеотрицательные колонии, отобранные из смешанных колониальных морфологий с использованием низкого порога флуоресценции. K) график, показывающий количество мвышнерно-отрицательных колоний, подсчитанных с помощью ручного по сравнению с автоматизированным методом, когда порог интенсивности был установлен для выбора нефлуоресцентных колоний (наклон подгонки = 1,1; ^R2 = 0,85, коэффициент корреляции Пирсона, p < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Инструкции по сборке FluoroBox. Этот файл шаг за шагом проводит читателя через конструкцию управляемого блока освещения, используемого в видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Акриловая лазерная резка FluoroBox. Этот файл предоставляет вырезанный шаблон для лазерной резки акриловых кусочков для контролируемого осветительного блока. Файл может быть отправлен поставщику акриловой резки лазерной резки. Смотрите таблицу материалов для поставщика, используемого в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Инструкции по программному обеспечению. Этот файл шаг за шагом проводит читателя через установку и использование программного обеспечения Croptacular и Count-On-It, поставляемого с этим протоколом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодовый файл 1: код 3D-печати для лотка для измерения бусин (S1-bead-measurer.stl). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодовый файл 2: Прямоугольная пластина фотообрезатель ImageJ плагин (Croptacular_.ijm). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 3: Плагин для обрезки фотографий круглых пластин (Circus_.ijm). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодовый файл 4: Прямоугольная пластина 96 плагин точечного счетчика (Gridiron_.ijm). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Подробные методы, представленные здесь, позволяют увеличить >100 раз количество образцов, которые могут быть оценены в эксперименте по подсчету КОЕ. Этот метод продвигает существующие методы экспериментов с микробиомом в Drosophila 12,35,36 с использованием формата пластины с 96 лунками для анализа отдельных мух. Кроме того, он применяет более эффективный метод точечного покрытия^19,31 и автоматизированный рабочий процесс с платформой для фотографии и подсчета колоний. Значение этого метода для дрозофилы заключается в стандартизации экспериментов в формате пластины с 96 лунками, что позволяет одновременно обрабатывать большое количество биологических реплик с автоматизацией для достижения высокопроизводительной количественной оценки КОЕ.

96-луночная платформа показывает, что увеличение частоты передачи и «очистки» переходных бактерий вызывает значительное снижение как среднего изобилия, так и вариаций между образцами (рисунок 1B, C), демонстрируя строгость этого улучшенного протокола. Одним из ограничений совместного содержания мух является горизонтальный перенос бактерий между мухами. Предлагаемое решение состоит в том, чтобы держать мух по отдельности в формате пластины с 96 лунками, таких как Whole Animal Feeding Flat³⁸.

Хотя значительного снижения бактериальной нагрузки не наблюдалось при промывке мух этанолом, эти мухи содержались только в присутствии внешних бактерий в течение 3 дней. Жилье в течение более длительных периодов времени может позволить большей бактериальной нагрузке накапливать³⁹. Поэтому промывка в этаноле все же рекомендуется.

Перенос мух в пластину с 96 скважинами является критически важным первым шагом для настройки рабочего процесса (рисунок 1A). Как только мухи вымываются, они распределяются по колодцам по одной. Пластинчатая диаграмма полезна на этом этапе, чтобы отметить, какие условия присутствуют в каждой скважине, и добавить любые заметки, такие как «муха была потеряна». Гомогенизация является еще одним критическим шагом с некоторыми важными оговорками. Бактерии выживают в процессе гомогенизации в присутствии мухи (рисунок 1D, E), и, по-видимому, этот принцип также верен, когда бактерии находятся внутри кишечника мухи. Тем не менее, бактерии также погибают, когда они гомогенизируются только в пластинах бисерного битера, демонстрируя, что гомогенизация может убивать бактериальные клетки при определенных обстоятельствах, ограничение, которое может быть важным, например, если гомогенизировать рассеченные кишки. Примечательно, что потери КОЕ при гомогенизации зависят от количества КОЕ в образце, а потери минимальны при использовании ~10⁵ КОЕ на скважину. Дальнейшее сохранение КОЕ может быть достигнуто путем прекращения гомогенизации на полпути и охлаждения пластины на льду.

Гомогенизацию проводили в течение 5 минут в этом протоколе на основе контрольных экспериментов, где известное количество КОЕ было смешано с мухой без микробов, и это эмпирически сработало для бактерий мух. Меньшее биение приводило к присутствию более крупных частей мухи, что мешало пипетке, в то время как значительно более длительное время гомогенизации ~ 10 мин делало количество КОЕ более изменчивым. Наблюдалось, что меньший объем и угловая форма конических пластинчатых колодцев снижают эффективность биения шариков по сравнению с цилиндрическими трубками объемом 2 мл. Возможны многие вариации этого общего подхода, в том числе какие бактериальные штаммы, какие шарики бьют контейнер, какие бусины и какой генотип мухи используются. Отдельные пользовательские случаи должны использовать положительные элементы управления для установления своего подхода.

Метод точечного покрытия был использован специфическим образом: 1:2 разведения L. plantarum WF в PBS были обнаружены на пластинах MRS и инкубированы при 30 °C в течение 2 дней (более короткое время инкубации может быть реализовано для получения меньших размеров колонии). Этот метод требует некоторых первоначальных инвестиций в оборудование, в первую очередь в бисерный битер и 96-канальный пипетчер (рисунок 2А), который необходим как для серии разбавления, так и для точечного покрытия. Тем не менее, доступны менее дорогие варианты, в том числе 96-луночный пластинчатый репликатор с щелевыми штифтами. Серия разбавления является критическим этапом, который влияет на точность результатов подсчета КОЕ. С точки зрения режимов отказа, можно засорить наконечники пипеток деталями мухи или стеклянными шариками, а наконечники пипеток не запечатаны должным образом на пипетке или выйти из строя по какой-либо другой причине. Все эти проблемы приводят к недоучету пострадавших скважин и должны контролироваться. Адекватное смешивание на каждом этапе серии разбавления также имеет решающее значение. Каждое разведение следует тщательно перемешать либо путем помещения тарелки на шейкер пластины, либо путем пипетки вверх и вниз 15-20 раз, что также служит для промывки кончиков. При пятнистости от наиболее разбавленной до наименее разбавленной пластины наконечники могут быть повторно использованы для всей серии разбавления. При разведении 1:2 подсчет является точным в диапазоне 2-25 колоний, охватывающих порядок величины (рисунок 2C). Поэтому разбавления 1:10 экономят время и материалы. Другой переменной, которой можно воспользоваться, является время инкубации, которое может быть скорректировано для получения меньших колоний и, таким образом, увеличения диапазона счетных пятен, предотвращая слияние соседних колоний.

Качественная фотография пластины имеет важное значение, поскольку она становится исходными данными, из которых анализируются КОЕ, и может быть архивирована на неопределенный срок. FluoroBox предназначен для получения фотографий пластин с равномерной интенсивностью света, что сводит к минимуму блики на поверхности агара. Кроме того, конструкция способна выборочно фотографировать флуоресцентные колонии с использованием одноцветных светодиодных фонарей и цветных фотофильтров (рисунок 3A). Конструкция такой установки, как FluoroBox, с контролируемым освещением и настройками камеры, может значительно повысить воспроизводимость изображений КОЕ, что важно для автоматизированного анализа. Морфология колоний, интенсивность флуоресценции и влияние времени или плотности на рост колонии — это лишь некоторые из свойств, которые можно проанализировать с помощью фотографий. Фотобокс может быть построен без цветных фильтров и одноцветных ламп, если не используются флуоресцентные бактерии, что снижает стоимость и сложность. Различные лампы возбуждения и эмиссионные фильтры могут быть заменены на те, которые рекомендуются здесь, если лаборатория использует другой флуорофор. Камера, подключенная к планшету через Wi-Fi с помощью приложения, полезна как для функции автоматического затвора для предотвращения тряски, так и для простоты передачи данных. Изображения могут быть переданы на планшет, а затем на ноутбук с помощью программного обеспечения для беспроводной передачи файлов. Рекомендуемые камеры с такими возможностями указаны в Таблице материалов.

Count-On-It - это плагин, написанный на ImageJ. Автоматизированное программное обеспечение для подсчета КОЕ сегментирует изображение пластины в единую сетку из 96 скважин, подсчитывает колонии в каждой ячейке сетки и пакетирует результаты в простую электронную таблицу. Поскольку положение точечной сетки на пластине и на фотографии всегда меняется, пользователь должен вручную сопоставить сетку с фотографией с помощью плагина Croptacular. Это также помогает исключить области вблизи края пластины, которые имеют блики. Установка порогового значения является ключом к получению наиболее точного подсчета КОЕ из изображения. Если порог установлен слишком высоким, колонии сольются; если порог установлен слишком низко, колонии будут исключены. После установки порогового значения макрос применяет размытие Гаусса для смягчения краев и уменьшения сглаживания, фильтр водораздела разделяет перекрывающиеся колонии, а большие двоичные объекты подсчитываются с помощью анализируемых частиц.

Иногда плотность колоний слишком высока в определенном месте. Count-On-It предоставляет способ справиться с этим. Чтобы оценить количество колоний в ячейке сетки с частично слитыми колониями, сначала среднюю площадь круглого сгустка со всей пластины берут за C_avg. Затем площадь большого двоичного объекта A₁ делится на среднюю площадь круглого большого двоичного объекта A₁/C_avg. Это число округляется до ближайшего целого числа, и это оценка того, сколько колоний находится в большом двоичном объекте. Эта функция является одной из причин, по которой пороговое значение может влиять на результаты подсчета: относительная средняя площадь колонии по сравнению с объединенной областью большого двоичного объекта будет отличаться в зависимости от того, как пороговое значение повлияло на объединенные большие двоичные объекты.

Представленные методы имеют ряд ограничений. К ним относится необходимость в оборудовании для точного дозирования жидких сред из 96-луночных плит. Это оборудование, будь то 96-канальный пипетатор или щелевой штифт репликатора, может стоить тысячи долларов. Более дешевые альтернативы существуют, но менее точны. Автоматизированный подсчет с помощью Count-On-It также имеет некоторые ограничения. Например, если бы два типа колоний в смешанной популяции были разделены только на основе размера, подсчет больших двоичных объектов не смог бы отнести колонии к правильному типу. В этом случае пятна с каплями должны быть исключены из подсчетов. Дальнейшая дифференциация колоний на основе морфологии была бы ценным расширением метода, который в настоящее время не реализован. Использование селективных сред, включая специфические для штамма питательные вещества и антибиотики, упрощает необходимость комплексного анализа изображений.

Проведение экспериментов с плодовой мухой в 96-луночных пластинах умножает количество образцов и условий, которые могут быть проверены в одном эксперименте, и может способствовать высокопроизводительным скринингам в фенотипах ассоциации дрозофила-бактерии. Мы предполагаем, что этот метод может быть расширен за счет использования селективных сред для дифференциации многих бактериальных штаммов в сложных смесях. Метод не ограничивается изучением микробиома мухи. Количественная оценка КОЕ распространена во многих приложениях микробиологии, от количества кишечной палочки в питьевой воде до идентификации патогенов. Представленная здесь система покрытия КОЕ обеспечивает высокую пропускную способность экранов, а также автоматизированное получение, обработку, хранение и доставку результатов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bead beating and spot plating
Fly vials	Genesee	32-121	autoclavable
Fly vial stoppers	Genesee	59-201	autoclavable
Hand Applicator	3M	3M PA1
Heat Sealer	Eppendorf	5390
Mini-Beadbeater 96	BioSpec	1001
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm	BioSpec	11079105
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner	Labnet	LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor	Mettler Toledo	30296705	Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural	USA scientific	1402-9220	Must be polypropylene for heat sealer
Thermal Bond Heat Seal Foil	4titude	4ti-0591	Keep sterile
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile	SPL Life Sciences	31001	For making rectangular agar plates
Photobox construction
¼”-20 X ½” Bolts (X2)	Amazon	ASIN: B07BP1WR3H	To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.
¼”-20 x ½” Connector Nut	Amazon	UPC: 799862376780	AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.
¼”-20 x ¾” bolts (X3)	Amazon	ASIN: B003QZSZY4	For the plate holder. Brand not important.
1/8” x ½” washer	Amazon	UPC: 611982484599	Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft	Superbrightleds.com	WP18-2
22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4	Superbrightleds.com	WN-R2210
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3	Superbrightleds.com	SCFP-2218
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3	Superbrightleds.com	SBL-MA2P-8-2
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3	Superbrightleds.com	SBL-MA2P-8-1
6” drawer handle	Amazon	ASIN: B07Z331P99	Any drawer handle should work.
6” Drawer slides	Btibpse	UPC: 712243424979	Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.
8-32 x ½” Cap Nuts (x4)	Amazon	ASIN: B00HYLZB98	Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4)	Amazon	ASIN: B07KX9T7NF	To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
Acrylic Glue	SCIGRIP	Ean: 7844908489337	SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle
Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long	Superbrightleds.com	CT-B04-10
Camera L-Bracket	WLPREOE, Vikerer, Unbranded	ASIN: B09X46YKQZ	The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Canon T series camera for tethering option OR	Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc..	1894C002	The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters	Superbrightleds.com	STN-BBLU-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters	Superbrightleds.com	STN-BGRE-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters	Superbrightleds.com	STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Drill with ¼”, 1/8” drill bits	Black & Decker	‎BDCDD12PK	Brand not important.
Flat Black Spray Paint,  2X Ultra-Matte	Rustoleum	331182	Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.
Laser Cut Acrylic Walls	Big Blue Saw	www.bigbluesaw.com	Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera
Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt	Superbrightleds.com	LPV-20-24
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer	Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.	DMC-ZS100K	Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good.
Quick Release Plate	Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch	ASIN: B07417F21D	Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Rubber Bands, Assorted sizes	BAZIC Products	Alliance Rubber 26649	Rubber bands go on the plate holder. Brand not important.
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4	Superbrightleds.com	CTMB-20
SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3	Superbrightleds.com	RRS-SP
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm	Tiffen	72R29
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm	Tiffen	7258
Software
ImageJ64	https://imagej.net/downloads	N/A	Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSX	Apple	N/A	Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it.
Unix	BSD	N/A	64 bit
Windows	Microsoft	N/A	64 bit