ヒト細胞におけるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅

要約

免疫蛍光染色中のチラミドシグナル増幅により、HSV-1感染後のZBP1誘発ネクロトーシス中のリン酸化RIPK3およびMLKLの高感度検出が可能になります。

要約

キナーゼ受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)およびその基質混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、重要な抗ウイルス機能を備えた炎症性細胞死型であるネクロプトーシスの重要な調節因子です。RIPK3の自己リン酸化は、ネクロトーシスMLKLの細孔形成実行タンパク質のリン酸化および活性化を誘導する。細胞膜でのリン酸化MLKLのトラフィッキングとオリゴマー化は、ネクロトーシス細胞死の特徴である細胞溶解をもたらします。核酸センサーZBP1は、RNAおよびDNAウイルスに感染した後、左巻きZ型二本鎖RNA(Z-RNA)に結合することによって活性化されます。ZBP1活性化は、感染した宿主細胞のネクロプトーシスを含む調節された細胞死を誘導することにより、ウイルス感染を制限します。免疫蛍光顕微鏡法は、ZBP1を介したネクロトーシスの下流にあるさまざまなシグナル伝達ステップを細胞ごとに視覚化することができます。しかしながら、ヒトRIPK3およびMLKLに対する現在市販のホスホ特異的抗体を用いた標準的な蛍光顕微鏡の感度は、これらのマーカーの再現可能なイメージングを妨げる。ここでは、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)に感染したヒトHT-29細胞におけるセリン(S)リン酸化RIPK3(S227)およびMLKL(S358)の最適化された染色手順について説明します。免疫蛍光染色プロトコルにチラミドシグナル増幅(TSA)ステップを含めることで、S227リン酸化RIPK3の特異的検出が可能になります。さらに、TSAはS358リン酸化MLKLの検出感度を大幅に向上させます。一緒に、この方法は、ZBP1誘発ネクロプトーシスの誘導中のこれら2つの重要なシグナル伝達イベントの視覚化を可能にします。

概要

受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)および混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、ネクロトーシス細胞死の中心的な調節因子です^1,2。ネクロトーシスは、抗ウイルス免疫と自己炎症に関与する調節された細胞死の溶解性および炎症性形態です。ウイルス感染細胞のネクロトーシスは、ウイルス複製を直ちにシャットダウンします。ネクロトーシス誘導後の細胞溶解は、抗ウイルス免疫を刺激する損傷関連の分子パターンも放出します^3,4。ネクロトーシスは、RIPホモタイプ相互作用モチーフ(RHIM)を介した3つの上流活性化分子のうちの1つとのRIPK3の活性化によって開始されます:RIPK1(TNF受容体1[TNFR1]の関与時)、TIRドメイン含有アダプター誘導インターフェロンβ(TRIF;Toll様受容体3および4の関与時)、または抗ウイルス核酸センサーZ-DNA結合タンパク質1(ZBP1)^1,2。.ネクロトーシスシグナル伝達は、RIPK3の自己リン酸化から始まる一連のリン酸化イベントを通じて進行します。キナーゼドメイン内のセリン(S)227でのヒトRIPK3の自己リン酸化は、ML....

プロトコル

1.ビオチン化チラミドの調製

1. ビオチン-チラミドから始まるビオチン化チラミドを調製します。10 mMのストック溶液を作るには、3.6 mgのビオチン-チラミドを1 mLのDMSOに溶解します。溶解した製品を-20°Cでアリコートで保存し、品質を維持します。

2. HT-29細胞の培養液の維持

注:ZBP1発現HT-29は、ヒトZBP1をコードするレンチ^{ベクター27} による形質導入によって生成された。

1. ZBP1発現HT-29細胞を、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および10%ウシ胎児血清(以下、フル培地と呼びます)を添加したマッコイの5A培地に保存し、5%二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーター内で維持します。理想的には、通過数が少ない(10未満)セルを使用します。実験開始前の解凍サイクル後少なくとも5日間細胞を回復させてください。
2. 培養フラスコから細胞を剥離するには、培地を取り出し、5 mLのPBS(37°Cに予熱)で細胞を洗浄します。次に、適量のトリプシン/EDTA(それぞれ0.05%トリプシンと0.032%EDTA、37°Cに予熱)を細胞に加えます(T75フラスコの場合は2 mL、T175フラスコの場合は3 mL)。

結果

ヒト細胞におけるMLKLリン酸化、特にRIPK3リン酸化の免疫蛍光検出は技術的に困難です²⁶。ここでは、ZBP1の活性化時のヒトp-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の染色プロトコルの改善を紹介します。このプロトコルには、蛍光シグナルの検出限界と感度を改善するためのTSAステップが含まれています。この方法を検証するために、TSAを介した免疫蛍光とp-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の両方?.......

ディスカッション

この免疫蛍光染色プロトコルでは、RIPK3およびMLKL²⁶のリン酸化など、検出が困難なヒトネクロトーシスシグナル伝達経路のシグナル伝達イベントの感度を高めるためのチラミドシグナル増幅(TSA)の使用について説明しています。TSAステップを含めることで、p-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の検出閾値が大幅に向上し、p-MLKL(S358)ひずみの感度が向上します。TSAは、模擬処理されたサ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP	Agilent Technologies Belgium	K4002	Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633	Thermofisher	35513	Secundary antibody
HSV-1 ICP0	Santa Cruz	sc-53070	Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum	In house production	xx	Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL	Abcam	ab187091	Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3	Abcam	ab209384	Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI	Thermofisher	D21490	To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568	Thermofisher	S11226	To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2	Sigma	H1009	Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA	SANBIO	AR1068	To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide	R&D Systems	6241	To amplify signal, HRP substrate
BV-6	Selleckchem	S7597	BV6 IAP Inhibitor
			For cell culture: to detach the cells
			8.0 g/L NaCl
			0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04%	In house formulation		1.1 g/L Na2HPO4
			0.2 g/L NaH2PO4
			0.2 g/L KCl
			0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum	TICO	FBS EU XXX	For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840	Aobious	AOB0917	RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock	Active Motif	15252	Blocking solution
PBS	Gibco	10444402
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α	In house production	-	Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML	To permeabilise the cells
Trypan blue	Merck	11732	For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine	Sigma-Aldrich	T4424	For cell culture: to detach the cells
zVAD	Bachem	BACE4026865.0005	Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom	iBidi	80807	To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium	Electron Microscopy Sciences	71001-10	To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C	ZEISS	444970-9000-000	To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner	ZEISS	000000-0105-200	To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope			To visualise the sample
Software
Excel	Office	xx	To process the data
Prism 9	Graphpad	xx	To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3	Volocity	xx	To perform quantifications
Zen black	ZEISS	xx	To aquire and process images
Zen blue	ZEISS	xx	To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain	produced by  Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain	Produced by Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8	in house stock	in house replication	IAV as a trigger for necroptosis