Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung der ZBP1-abhängigen Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL nach HSV-1-Infektion in menschlichen Zellen

Zusammenfassung

Die Tyramid-Signalverstärkung während der Immunfluoreszenzfärbung ermöglicht den sensitiven Nachweis von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL während der ZBP1-induzierten Nekroptose nach HSV-1-Infektion.

Zusammenfassung

Die Kinase-Rezeptor-interagierende Serin/Threonin-Proteinkinase 3 (RIPK3) und ihre substratgemischte Linie Kinase Domain-like (MLKL) sind kritische Regulatoren der Nekroptose, einer entzündlichen Form des Zelltods mit wichtigen antiviralen Funktionen. Die Autophosphorylierung von RIPK3 induziert die Phosphorylierung und Aktivierung des porenbildenden Henkerproteins der Nekroptose MLKL. Der Transport und die Oligomerisierung von phosphoryliertem MLKL an der Zellmembran führt zur Zelllyse, die für den nekroptotischen Zelltod charakteristisch ist. Der Nukleinsäuresensor ZBP1 wird durch Bindung an linkshändige Z-Form doppelsträngige RNA (Z-RNA) nach Infektion mit RNA- und DNA-Viren aktiviert. Die ZBP1-Aktivierung schränkt die Virusinfektion ein, indem sie den regulierten Zelltod, einschließlich Nekroptose, infizierter Wirtszellen induziert. Die Immunfluoreszenzmikroskopie erlaubt die Visualisierung verschiedener Signalschritte nach ZBP1-vermittelter Nekroptose pro Zelle. Die Empfindlichkeit der Standard-Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung derzeit kommerziell verfügbarer Phospho-spezifischer Antikörper gegen humanes RIPK3 und MLKL schließt jedoch eine reproduzierbare Bildgebung dieser Marker aus. Hier beschreiben wir ein optimiertes Färbeverfahren für Serin (S) phosphoryliertes RIPK3 (S227) und MLKL (S358) in humanen HT-29-Zellen, die mit Herpes-simplex-Virus 1 (HSV-1) infiziert sind. Die Aufnahme eines Tyramid-Signalamplifikationsschritts (TSA) in das Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll ermöglicht den spezifischen Nachweis von S227 phosphoryliertem RIPK3. Darüber hinaus erhöht TSA die Empfindlichkeit der Detektion von S358 phosphoryliertem MLKL erheblich. Zusammen ermöglicht diese Methode die Visualisierung dieser beiden kritischen Signalereignisse während der Induktion der ZBP1-induzierten Nekroptose.

Einleitung

Rezeptor-interagierende Serin/Threonin-Proteinkinase 3 (RIPK3) und Mixed Lineage Kinase Domain-like (MLKL) sind zentrale Regulatoren des nekroptotischen Zelltods ^1,2. Nekroptose ist eine lytische und entzündliche Form des regulierten Zelltods, die an der antiviralen Immunität und Autoentzündung beteiligt ist. Die Nekroptose von virusinfizierten Zellen stoppt sofort die Virusreplikation. Die Zelllyse nach Nekroptose-Induktion setzt auch schadensassoziierte molekulare Muster frei, die die antivirale Immunität stimulieren ^3,4. Die Nekroptose wird durch die Aktivierung von RIPK3 nach RIP homotypic interaction motif (RHIM)-vermittelten Interaktionen mit einem von drei vorgeschalteten aktivierenden Molekülen eingeleitet: RIPK1 (bei TNF-Rezeptor 1 [TNFR1]-Engagement), TIR-Domänen-enthaltendes adapterinduzierendes Interferon-β (TRIF; bei Toll-like-Rezeptor-3- und 4-Engagement) oder dem antiviralen Nukleinsäuresensor Z-DNA-bindende Protein 1 (ZBP1)^1,2 . Die Nekroptose-Signalisierung verläuft durch eine Reihe von Phosphorylierungsereignissen, beginnend mit der Autophosphorylierung von RIPK3. Die Autophosphorylierung von humanem RIPK3 an Serin (S)227 innerhalb seiner Kinasedomäne ist eine Voraussetzung für die Nekroptose, indem sie die Interaktion mit MLKL ermöglicht und wird üblicherweise als biochemischer Marker für die Aktivierung von humanem RIPK3 und den nekroptischen Zelltod verwendet ^1,5. Nach der Aktivierung phosphoryliert RIPK3 die Aktivierungsschleife von MLKL an Threonin (T)357 und S358¹. Dies führt zu einer Änderung der MLKL-Konformation, was zu einer Exposition der N-terminalen Vier-Helix-Bündeldomäne führt. MLKL oligomerisiert dann und transportiert zur Zellmembran, wo es durch das Einführen der exponierten vier Helixbündel in die Lipiddoppelschicht eine Pore bildet, was schließlich zum Zelltod führt ^2,6.

ZBP1 ist ein antiviraler Nukleinsäuresensor, der linkshändige Z-Form-Nukleinsäuren einschließlich doppelsträngiger RNA in der Z-Konformation (Z-RNA) erkennt. Die Z-RNA-Bindung erfolgt über zwei Zα-Domänen, die am N-Terminus von ZBP1 positioniert sind. Es wird angenommen, dass Z-RNA, die sich während einer RNA- und DNA-Virusinfektion ansammelt, ZBP1 ^7,8 direkt angreift. Aktiviertes ZBP1 rekrutiert RIPK3 durch seine zentralen RHIMs und induziert einen regulierten Zelltod, einschließlich Nekroptose ^9,10. Viren haben zahlreiche Fluchtmechanismen angenommen, um der ZBP1-induzierten Wirtszellnekroptose^{entgegenzuwirken 11}. Zum Beispiel beherbergt die Herpes-simplex-Virus 1 (HSV-1) Ribonukleotid-Reduktase-Untereinheit 1, bekannt als ICP6 und kodiert durch UL39, RHIM an seinem N-Terminus, der die ZBP1-vermittelte RIPK3-Aktivierung in menschlichen Zellen^{stört 12,13,14,15}. ZBP1 schränkt nicht nur die Virusreplikation ein, sondern Mausstudien haben gezeigt, dass die ZBP1-Aktivierung entzündliche Erkrankungen verursacht und die Krebsimmunität stimuliert 16,17,18,19,20,21. Protokolle, die Signalereignisse erkennen, die während der ZBP1-induzierten Nekroptose in menschlichen Zellen auftreten, sind daher wertvoll, um die Rolle von ZBP1 in diesen Prozessen zu beurteilen.

Die Tyramid-Signalamplifikation (TSA), auch als katalysierte Reporterabscheidung (CARD) bezeichnet, wurde entwickelt, um die Nachweisgrenze und das Signal-Rausch-Verhältnis in Antikörper-basierten Immunoassays zu verbessern. Während der TSA kann jeder primäre Antikörper verwendet werden, um das interessierende Antigen nachzuweisen. Meerrettichperoxidase (HRP), gekoppelt an einen sekundären Antikörper, katalysiert den lokalen Aufbau von biotinylierten Tyramidradikalen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid. Diese aktivierten Biotin-Tyramid-Radikale reagieren dann mit proximalen Tyrosinresten zu kovalenten Bindungen. Mögliche Tyramid-Biotin-Substrate umfassen das Antigen selbst, die primären und sekundären Antikörper und benachbarte Proteine. Während TSA die Empfindlichkeit des Assays signifikant verbessert, geht ein Teil seiner räumlichen Auflösung verloren. In einem letzten Schritt werden Biotinmoleküle mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin nachgewiesen. Die HRP-Reaktion lagert viele Tyramid-Biotin-Moleküle auf oder in der Nähe des interessierenden Antigens ab. Dies erhöht die Anzahl der Streptavidin-Fluorochrom-Bindungsstellen erheblich, wodurch die Empfindlichkeit des Assays stark verstärkt wird (Abbildung 1). Alternativ kann Tyramid direkt an ein Fluorochrom gekoppelt werden, wodurch die Notwendigkeit von Streptavidin-gekoppelten Fluorophoren entfällt. Proteinimmunhistochemie und DNA/RNA in situ Hybridisierung gehörten zu den ersten Methoden, bei denen TSA zur Verbesserung der Signalintensitäten eingesetzt wurde^22,23. In jüngerer Zeit wurde TSA mit intrazellulärer Durchflusszytometrie²⁴ und Massenspektrometrie²⁵ kombiniert.

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Nachweis von Serin 227 phosphoryliertem humanem RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) und phosphoryliertem humanem MLKL (p-MLKL [S358]) nach Aktivierung von ZBP1 durch HSV-1-Infektion mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Wir verwenden eine nekroptosesensitive HT-29 humane kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie, die transduziert wurde, um menschliches ZBP1 stabil zu exprimieren. Diese Zellen wurden mit einem HSV-1-Stamm infiziert, der ein mutiertes ICP6-Protein (HSV-1 ICP6^mutRHIM) exprimierte, in dem vier Kernaminosäuren innerhalb des viralen RHIM (VQCG) durch Alanine (AAAA) ersetzt wurden, wodurch das ICP6 nicht in der Lage war, die ZBP1-vermittelte Nekroptose^{zu blockieren 13,14,15}. Um das Problem des niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses der derzeit kommerziell verfügbaren Antikörper gegen p-RIPK3 und p-MLKL bei der Immunfärbung²⁶ zu überwinden, führen wir einen Tyramid-Signalamplifikationsschritt (TSA) durch (Abbildung 1), der zum robusten Nachweis von humanem p-RIPK3 (S227) führt und die Detektionsempfindlichkeit von humanem p-MLKL (S358) um eine Größenordnung verbessert.

Protokoll

1. Herstellung von biotinyliertem Tyramid

1. Biotinyliertyramid ausgehend von Biotin-Tyramid herstellen. Um eine 10 mM Stammlösung herzustellen, lösen Sie 3,6 mg Biotin-Tyramid in 1 ml DMSO. Lagern Sie das gelöste Produkt aliquot bei −20 °C, um die Qualität zu erhalten.

2. Aufrechterhaltung von HT-29-Zellen in Kultur

HINWEIS: ZBP1-exprimierende HT-29 wurden durch Transduktion mit einem Lentivektor²⁷ erzeugt, der für humanes ZBP1 kodiert.

1. Halten Sie ZBP1-exprimierende HT-29-Zellen in McCoys 5A-Medium, ergänzt mit L-Glutamin, Natriumpyruvat und 10% fötalem Rinderserum (im Folgenden als Vollmedium bezeichnet) und halten Sie in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% Kohlendioxid. Verwenden Sie idealerweise Zellen mit einer niedrigen Durchgangszahl (kleiner als 10). Lassen Sie die Zellen mindestens 5 Tage nach dem Auftauzyklus vor Beginn des Experiments ruhen.
2. Um die Zellen aus dem Kulturkolben zu lösen, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 5 mL PBS (vorgewärmt auf 37 °C). Als nächstes wird die entsprechende Menge Trypsin/EDTA (0,05 % Trypsin bzw. 0,032 % EDTA, auf 37 °C vorgeheizt) in die Zellen gegeben (2 ml für einen T75-Kolben, 3 ml für einen T175-Kolben).
3. Die Zellen mit Trypsin/EDTA bis zu 10 min in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Klopfen Sie anschließend auf den Kolben und überprüfen Sie visuell, ob sich die Zellen mit einem Mikroskop mit 4-facher Objektivvergrößerung vom Kolben gelöst haben.
4. Wenn sich die Zellen nicht vollständig abgelöst haben, inkubieren Sie weitere 5 Minuten bei 37 °C. Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 6 ml volles Medium in den Kolben geben.
5. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem trypanblauen Färbstoff, um die Lebensfähigkeit zu beurteilen. Eine Verdünnung von 1:5 wird empfohlen. Fahren Sie nur mit dem Experiment fort, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen 90% übersteigt.

3. Beginn des Experiments, Aussaat und Stimulation der Zellen

1. Säen Sie 90.000 ZBP1-exprimierende HT-29-Zellen in vollem Medium in einer 1 cm² großen Oberflächenvertiefungsplatte, die eine High-End-Mikroskopie ermöglicht. Verwenden Sie ein Endvolumen von 200 μL pro Vertiefung.
2. Die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Beachten Sie, dass einige zusätzliche Vertiefungen für Färbekontrollen ausgesät werden müssen, was in Schritt 5.6 ausführlicher erläutert wird.
3. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70% -80% erreichen, fügen Sie den Zellen einen nekrodose-induzierenden Reiz hinzu. Hier wurden die Zellen mit HSV-1 ICP6^mutRHIM (Multiplicity of infection [MOI] of 5, defined as plaque forming units (pfu) dividiert durch die Anzahl der Zellen; die pfu wurde mit einem Plaque-Assay an Vero-Zellen quantifiziert) für 6 h, 8 h oder 10 h infiziert.
4. Als Positivkontrolle für die Nekroptose-Induktion stimulieren Sie die Zellen für 4 h mit einem Nekroptose-induzierenden Cocktail, der 30 ng/ml TNF, 20 μM des Pan-Caspase-Inhibitors zVAD-fmk und 5 μM des SMAC-Mimetikums BV6 enthält.
5. Als Negativkontrolle für die p-RIPK3 (S227)-Färbung ist GSK'840 (1 μM) enthalten, um die RIPK3-Kinaseaktivität zu hemmen und die Autophosphorylierung von S227 zu verhindern. Idealerweise fügen Sie den Inhibitor in einem unbehandelten Zustand und nach Nekroptose-Stimulation hinzu. Der Inhibitor kann gleichzeitig mit einer Virusinfektion hinzugefügt werden.
6. Die Stimulationen in vollem Medium, vorgeheizt auf 37 °C, vorbereiten. Verwenden Sie ein Endvolumen von 200 μL pro Vertiefung für alle Stimulationen.

4. Fixieren der Zellen

1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 200 μL 1x PBS. Dann 150 μL 4% PFA (bereits bei Raumtemperatur ausgeglichen) in die Zellen geben und bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
   HINWEIS: Wenn Sie Zellen verwenden, die sich leicht lösen lassen, kann die Fixierung der Zellen wie folgt optimiert werden. Entfernen Sie 100 μL Medium aus der Vertiefung, so dass ein Volumen von 100 μL auf der Platte verbleibt. Fügen Sie 100 μL 4% PFA zu den Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur. Anschließend entfernen Sie das Medium/Fixiermittel aus den Vertiefungen und ersetzen Sie es durch 150 μL 4% PFA. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur, um eine vollständige Fixierung der Zellen zu gewährleisten.
2. Nach der Fixierung die 4% PFA entfernen und die Zellen 3x mit 200 μL 1x PBS waschen. Die Proben können in einem Überschuss (>200 μL) von 1x PBS bei 4 °C über Nacht bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden.

5. Permeabilisierung und Primärfärbung

1. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 100 μL Permeabilisierungspuffer hinzu (0,5% Triton X-100 in PBS). Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
2. Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie anschließend die Vertiefungen mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Inkubieren Sie die Bildgebungskammer mit Waschpuffer für 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler (20-30 Schaukelbewegungen pro Minute).
3. Um eine unspezifische Bindung von primären Antikörpern zu verhindern, fügen Sie 100 μL Sperrmedium hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 2 h. Alternativ kann dieser Blockierungsschritt durch eine Blockierung mit 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur ersetzt werden.
4. Waschen Sie die Vertiefungen 3x mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.
5. Nach dem Entfernen des Waschpuffers die primären Antikörper in die Bildgebungskammer geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Verwenden Sie ein Endvolumen von 100 μL, um die Vertiefung abzudecken. Während der nächtlichen Inkubation bei 4 °C stellen Sie die Bildgebungskammer nicht auf einen kippbaren Laborshaker.
   HINWEIS: Anti-p-MLKL (S358; Verdünnung: 1:200) und Anti-p-RIPK3 (S227; Verdünnung: 1:200) teilen Kaninchen als Wirtsart und sollten daher nicht in einer Vertiefung kombiniert werden. Um die Virusinfektion zu überwachen, kombinieren Sie einen primären Antikörper gegen ein virales Protein Ihrer Wahl mit p-MLKL (S358) oder p-RIPK3 (S227). Hier wurden die Zellen mit einer HSV-1-Infektion infiziert, gefolgt von einer ICP0-Färbung (Verdünnung: 1:50, Wirtsspezies: Maus).
6. Berücksichtigen Sie an dieser Stelle die notwendigen Färbekontrollen. Geben Sie immer eine Bedingung ohne primäre Antikörper an, um den potenziellen Hintergrund des TSA-Amplifikationsschritts zum Festlegen der Maskierungsschwelle zu visualisieren (siehe Schritt 9).
   HINWEIS: Im Falle eines Co-Färbeprotokolls (z. B. Kombination von p-MLKL [S358] oder p-RIPK3 [S227] mit einem Antikörper gegen ein virales Protein) verwenden Sie auch einzelne Färbungen. Die Verwendung einzelner Färbungen ist wichtig, um ein potenzielles Durchblutungssignal in anderen Bildgebungskanälen zu korrigieren.

6. Tyramid-Signalverstärkung (TSA)

1. Entfernen Sie die primäre Antikörpermischung und waschen Sie die Vertiefungen 3x mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.
2. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie 100 μL HRP-markierten sekundären Antikörper hinzu, um die Art des primären Antikörpers zu erkennen, der amplifiziert werden muss. Um das p-RIPK3 (S227) oder p-MLKL (S358) Signal zu verstärken, fügen Sie 100 μL Anti-Kaninchen-HRP hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborshaker.
   HINWEIS: Nur p-MLKL (S358) oder p-RIPK3 (S227) wird verstärkt. Die Färbung eines viralen Proteins wird mit einer indirekten Standardfärbemethode visualisiert.
3. Anschließend waschen Sie die Vertiefungen 3x mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.
4. In den nächsten Schritten fügen Sie das biotinylierte Tyramid zur mikroskopischen Platte hinzu. Unter Verwendung der HRP-Gruppe, die an die sekundären Antikörper gekoppelt ist, löst die enzymatische Reaktion die Bildung von Tyramidradikalen in unmittelbarer Nähe des primären Ziels aus (hier p-MLKL [S358] oder p-RIPK3 [S227]).
5. Um die enzymatische Aktivität von HRP zu aktivieren, fügen Sie ein oxidierendes Substrat zusammen mit dem biotinylierten Tyramid hinzu. Um dies zu erreichen, ergänzen Sie den TSA-Puffer (0,1 M Borsäure [pH 8,5]) mit 0,03 M_H2O2; Insbesondere nehmen Sie 5 ml TSA-Puffer und fügen Sie 5 μL 30%_H2O2hinzu.
6. Verdünnen Sie nun das Biotin-Tyramid in H2O2-ergänztem TSA-Puffer im Bereich von 1:1.000 bis 1:20.000.
   HINWEIS: Der Verdünnungsfaktor des Biotin-Tyramids muss pro Charge optimiert werden.
7. Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Vertiefungen und geben Sie verdünntes Biotin-Tyramid zu den Vertiefungen auf ein Endvolumen von 100 μL. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 min auf einem kippbaren Laborschüttler.
8. Als nächstes waschen Sie die Vertiefungen 3x mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.

7. Fluorophore

HINWEIS: Da das Signal des primären Antikörpers in eine Biotin-Gruppe umgewandelt wird, werden p-MLKL (S358) und p-RIPK3 (S227) mit Streptavidin sichtbar gemacht, das an ein Fluorophor gekoppelt ist (Fluorophor 568, Verdünnung: 1:500). Zusätzlich werden die Kerne mit DAPI (5 μg/ml) angefärbt. Wenn ein virales Protein im Färbeprotokoll enthalten ist, fügen Sie einen geeigneten fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper gegen die Wirtsspezies Ihres primären Antikörpers hinzu. In den repräsentativen Ergebnissen wurde ein Maus-Anti-ICP0 verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde Ziegen-Maus-Anti-Maus gekoppelt an Fluorophor 633 (Verdünnung: 1:1.000) eingeschlossen.

1. Stellen Sie die Färbemischung in Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS) her, der die oben genannten Antikörper und Flecken enthält. Entfernen Sie den Waschpuffer, fügen Sie 100 μL Färbemischung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Stunde auf einem kippbaren Laborschüttler. Halten Sie die Bildkammer ab diesem Schritt lichtgeschützt.
2. Als nächstes waschen Sie die Vertiefungen 2x mit Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.
3. Zum Schluss spülen Sie die Vertiefungen 2x mit 1x PBS ab. Lagern Sie die Proben in einem Überschuss (> 200 μL) von 1x PBS bis zur Bildgebung. Alternativ können Sie die Proben in Montagemedium tauchen, um die Färbung zu erhalten. Die Bildgebungskammer kann nun auf einem konfokalen Mikroskop visualisiert werden.

8. Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop

1. Schalten Sie das konfokale Mikroskop und die Laser mindestens 10 Minuten vor der Bildgebung ein.
2. Verwenden Sie ein Immersionsobjektiv für die Empfindlichkeit. Verwenden Sie vorzugsweise eine 40- oder 63-fache Objektivvergrößerung. Reinigen Sie vor der Bildgebung die Tauchobjektive mit einem Linsenreiniger mit geeigneten Wattebällchen. Verschmutzte Objektive (z. B. durch Staub) können zu Bildern mit geringerer Qualität führen.
3. Legen Sie eine überschüssige Menge Öl auf den Boden der Bildkammer. Fügen Sie zusätzlich einen Tropfen Öl auf das Ziel Ihrer Wahl hinzu.
4. Stellen Sie die Bildgebungskammer auf das Mikroskop. Finden Sie das Fokusfeld mit DAPI-Färbung oder Hellfeld-Bildgebung. Bewegen Sie sich bei Bedarf in der Bildgebungskammer, um eine ordnungsgemäße Verteilung des Tauchöls sicherzustellen.
5. Richten Sie die erforderlichen Bildgebungsspuren am Mikroskop ein. Je nach Mikroskop können die folgenden Schritte variieren (Tabelle 1).
   HINWEIS: Wenn Sie die Bildgebungsspuren einrichten, programmieren Sie die Spuren so, dass die Kernfärbung zuletzt gemessen wird. Der 405-nm-Laser kann zum Photobleaching und damit zum Verlust eines spezifischen Signals in allen Kanälen beitragen.
6. Um eine vollständige Zelle auf das Vorhandensein von p-RIPK3 (S227) oder p-MLKL (S358) zu analysieren, messen Sie z-Stacks, die sich über die Höhe der Zelle erstrecken. Hier wurden die Z-Stacks aus 40 Slices alle 0,16 μm hergestellt, woraus sich ein Bereich von 6,22 μm ergibt.

Spur	Laser	Strahlteiler	Filter
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)	561	MBS -405 +	BP 570-620 + LP645
		MBS 488/561/633 + SBS SP615
Virales Gen: ICP0	633	MBS -405 +	BP 420-480 + LP605
		MBS 488/561/633 + SBS LP570
Kern: DAPI	405	MBS -405 +	BP 420-480 + BP 495-550
		MBS 488/561/633

Tabelle 1: Bildgebungsspuren für die Zellvisualisierung.

9. Datenanalyse und Quantifizierung

1. Laden Sie die mikroskopischen Bilder in die Software hoch. Verwenden Sie den erweiterten Fokus, um alle Informationen des Z-Stacks in einem 2D-Bild zu visualisieren.
2. Als nächstes programmieren Sie das Analyseprotokoll, um die folgenden Informationen zu extrahieren: die Anzahl der Zellen pro Bild, die Summe der Voxel, die p-RIPK3 (S227)+ oder p-MLKL (S358)⁺ Färbung zeigen. Ein Voxel stellt ein dreidimensionales Volumen dar, definiert als das dreidimensionale Äquivalent eines Pixels.
3. Um die Anzahl der Zellen pro Bild zu quantifizieren, segmentieren Sie den Kern. Um das Rauschen in den Segmentierungsergebnissen zu reduzieren, fügen Sie der Segmentierung eine Größenbeschränkung hinzu (>100 μm³). Die Anzahl der segmentierten Kerne stellt die Anzahl der Zellen im Bild dar.
4. Um die Menge an p-RIPK3 (S227)+ oder p-MLKL (S358)⁺ Voxeln zu quantifizieren, programmieren Sie eine schwellenwertbasierte Segmentierung. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass in den Bildern ohne primäre Antikörper (NP) kein Signal aufgenommen wird.
5. Passen Sie den Schwellenwert weiter an, indem Sie die Bilder aus dem unbehandelten Scheinzustand verwenden. Um eine empfindliche Detektion des Signalanstiegs aufgrund der Nekroptosestimulation zu gewährleisten, begrenzen Sie die Aufnahme von p-RIPK3 (S227)+ oder p-MLKL (S358)⁺ Voxeln unter simulierten Bedingungen, indem Sie einen höheren Schwellenwert festlegen. Überprüfen Sie immer das programmierte Analyseprotokoll in mehreren Bildern von der simulierten Bedingung und Nekroptose-induzierenden Virusinfektion.
6. Führen Sie die Analyse für alle Image-Sets aus. Exportieren Sie die Voxelquantifizierung und Kernsegmentierung in eine .txt Datei zur weiteren Verarbeitung in Tabellenkalkulationssoftware.
7. Erstellen Sie eine Pivot-Tabelle der Daten, die den Bildnamen, die Kernquantifizierung und die Summe der erkannten Voxel anzeigt.
8. Als nächstes teilen Sie die Summe der positiven Voxel durch die Anzahl der Zellen im Bild. Daraus ergibt sich ein relativer Wert positiver Voxel pro Zelle. Um die Faltenzunahme zu visualisieren, dividieren Sie den relativen Wert von p-RIPK3 (S227)+ oder p-MLKL (S358)⁺ Voxel pro Zelle durch den Median des unbehandelten Zustands (mock).

Ergebnisse

Der Immunfluoreszenznachweis der MLKL-Phosphorylierung und insbesondere der RIPK3-Phosphorylierung in menschlichen Zellen ist technisch anspruchsvoll²⁶. Wir präsentieren hier ein verbessertes Färbeprotokoll für humanes p-RIPK3 (S227) und p-MLKL (S358) nach der Aktivierung von ZBP1. Das Protokoll beinhaltet einen TSA-Schritt zur Verbesserung der Nachweisgrenze und Empfindlichkeit der Fluoreszenzsignale. Um die Methode zu validieren, wurde ein Side-by-Side-Vergleich der TSA-vermittelten Immunfluo...

Diskussion

Dieses Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll beschreibt die Verwendung von Tyramid-Signalamplifikation (TSA), um die Empfindlichkeit für Signalereignisse des menschlichen nekrtotischen Signalwegs zu erhöhen, die schwer zu erkennen sind, einschließlich der Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL²⁶. Die Einbeziehung eines TSA-Schritts verbessert signifikant die Nachweisschwelle von p-RIPK3 (S227) und p-MLKL (S358) und erhöht die Empfindlichkeit der p-MLKL (S358) Dehnung. TSA enthüllte ein p-RIPK3 (S227)...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP	Agilent Technologies Belgium	K4002	Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633	Thermofisher	35513	Secundary antibody
HSV-1 ICP0	Santa Cruz	sc-53070	Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum	In house production	xx	Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL	Abcam	ab187091	Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3	Abcam	ab209384	Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI	Thermofisher	D21490	To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568	Thermofisher	S11226	To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2	Sigma	H1009	Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA	SANBIO	AR1068	To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide	R&D Systems	6241	To amplify signal, HRP substrate
BV-6	Selleckchem	S7597	BV6 IAP Inhibitor
			For cell culture: to detach the cells
			8.0 g/L NaCl
			0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04%	In house formulation		1.1 g/L Na2HPO4
			0.2 g/L NaH2PO4
			0.2 g/L KCl
			0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum	TICO	FBS EU XXX	For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840	Aobious	AOB0917	RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock	Active Motif	15252	Blocking solution
PBS	Gibco	10444402
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α	In house production	-	Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML	To permeabilise the cells
Trypan blue	Merck	11732	For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine	Sigma-Aldrich	T4424	For cell culture: to detach the cells
zVAD	Bachem	BACE4026865.0005	Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom	iBidi	80807	To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium	Electron Microscopy Sciences	71001-10	To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C	ZEISS	444970-9000-000	To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner	ZEISS	000000-0105-200	To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope			To visualise the sample
Software
Excel	Office	xx	To process the data
Prism 9	Graphpad	xx	To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3	Volocity	xx	To perform quantifications
Zen black	ZEISS	xx	To aquire and process images
Zen blue	ZEISS	xx	To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain	produced by  Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain	Produced by Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8	in house stock	in house replication	IAV as a trigger for necroptosis