Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines

Résumé

L’amplification du signal tyramide lors de la coloration par immunofluorescence permet la détection sensible de RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après une infection à HSV-1.

Résumé

La kinase RIPK3 (RIPK3) qui interagit avec le récepteur de la kinase et son substrat mixte de type domaine kinase (MLKL) sont des régulateurs essentiels de la nécroptose, une forme inflammatoire de mort cellulaire ayant d’importantes fonctions antivirales. L’autophosphorylation de RIPK3 induit la phosphorylation et l’activation de la protéine bourreau formant les pores de la nécroptose MLKL. Le trafic et l’oligomérisation du MLKL phosphorylé au niveau de la membrane cellulaire entraînent une lyse cellulaire, caractéristique de la mort cellulaire nécroptotique. Le capteur d’acide nucléique ZBP1 est activé en se liant à l’ARN double brin (ARN-Z) gaucher de forme Z après infection par des virus à ARN et à ADN. L’activation de ZBP1 limite l’infection virale en induisant la mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose, des cellules hôtes infectées. La microscopie par immunofluorescence permet de visualiser différentes étapes de signalisation en aval de la nécroptose médiée par ZBP1 sur une base cellulaire. Cependant, la sensibilité de la microscopie à fluorescence standard, utilisant actuellement des anticorps phospho-spécifiques disponibles dans le commerce contre RIPK3 et MLKL humains, empêche l’imagerie reproductible de ces marqueurs. Ici, nous décrivons une procédure de coloration optimisée pour la sérine (S) phosphorylée RIPK3 (S227) et MLKL (S358) dans les cellules humaines HT-29 infectées par le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1). L’inclusion d’une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) dans le protocole de coloration immunofluorescente permet la détection spécifique de S227 phosphorylé RIPK3. De plus, la TSA augmente considérablement la sensibilité de la détection de MLKL phosphorylé S358. Ensemble, cette méthode permet de visualiser ces deux événements de signalisation critiques lors de l’induction de la nécroptose induite par ZBP1.

Introduction

La protéine kinase 3 sérine/thréonine interagissant avec les récepteurs (RIPK3) et le domaine mixte de la kinase de lignée (MLKL) sont des régulateurs centraux de la mort cellulaire nécroptotique ^1,2. La nécroptose est une forme lytique et inflammatoire de mort cellulaire régulée impliquée dans l’immunité antivirale et l’autoinflammation. La nécroptose des cellules infectées par le virus arrête immédiatement la réplication du virus. La lyse cellulaire après induction de la nécroptose libère également des schémas moléculaires associés aux dommages, qui stimulent l’immunité antivirale ^3,4. La nécroptose est initiée par l’activation de RIPK3 à la suite d’interactions médiées par le motif d’interaction homotypique (RHIM) RIP avec l’une des trois molécules activatrices en amont : RIPK1 (lors de l’engagement du récepteur TNF 1 [TNFR1]), l’interféron-β induisant un adaptateur contenant le domaine TIR (TRIF; lors de l’engagement des récepteurs de type Toll 3 et 4), ou le capteur d’acide nucléique antiviral Protéine de liaison à l’ADN-Z 1 (ZBP1)^1,2 . La signalisation de la nécroptose se déroule par une série d’événements de phosphorylation commençant par l’autophosphorylation de RIPK3. L’autophosphorylation de RIPK3 humain à la sérine (S)227 à l’intérieur de son domaine kinase est une condition préalable à la nécroptose en permettant l’interaction avec MLKL et est couramment utilisée comme marqueur biochimique de l’activation humaine de RIPK3 et de la mort cellulaire nécroptotique ^1,5. Une fois activé, RIPK3 phosphoryle la boucle d’activation de MLKL à la thréonine (T)357 et S358¹. Cela provoque une modification de la conformation MLKL, entraînant une exposition du domaine du faisceau à quatre hélices N-terminal. MLKL s’oligomérise ensuite et se dirige vers la membrane cellulaire où il forme un pore par l’insertion des quatre faisceaux hélicoïdaux exposés dans la bicouche lipidique, conduisant finalement à la mort cellulaire ^2,6.

ZBP1 est un capteur d’acide nucléique antiviral qui reconnaît les acides nucléiques gauchers de forme Z, y compris l’ARN double brin dans la conformation Z (ARN-Z). La liaison de l’ARN-Z se produit via deux domaines Zα positionnés à l’extrémité N de ZBP1. On pense que l’ARN-Z s’accumulant lors de l’infection par l’ARN et le virus de l’ADN engage directement ZBP1 ^7,8. ZBP1 activé recrute RIPK3 par le biais de ses RHIM centraux et induit une mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose ^9,10. Les virus ont adopté de nombreux mécanismes d’échappement pour contrer la nécroptose de la cellule hôte induite par ZBP11. Par exemple, la sous-unité 1 de la ribonucléotide réductase du virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1), connue sous le nom de ICP6 et codée par UL39, héberge RHIM à son extrémité N qui interfère avec l’activation de RIPK3 médiée par ZBP1 dans les cellules humaines^12,13,14,15. ZBP1 non seulement restreint la réplication virale, mais des études sur la souris ont montré que l’activation de ZBP1 provoque des maladies inflammatoires et stimule l’immunité contre le cancer 16,17,18,19,20,21. Les protocoles qui détectent les événements de signalisation se produisant pendant la nécroptose induite par ZBP1 dans les cellules humaines sont donc utiles pour évaluer le rôle de ZBP1 dans ces processus.

L’amplification du signal tyramide (TSA), également appelée dépôt de rapporteur catalysé (CARD), a été développée pour améliorer la limite de détection et le rapport signal sur bruit dans les immunoessais à base d’anticorps. Au cours de la TSA, n’importe quel anticorps primaire peut être utilisé pour détecter l’antigène d’intérêt. La peroxydase de raifort (HRP), couplée à un anticorps secondaire, catalyse l’accumulation locale de radicaux tyramide biotinylés en présence de peroxyde d’hydrogène. Ces radicaux biotine-tyramide activés réagissent ensuite avec les résidus de tyrosine proximale pour former des liaisons covalentes. Les substrats potentiels tyramide-biotine comprennent l’antigène lui-même, les anticorps primaires et secondaires et les protéines voisines. Ainsi, alors que la TSA améliore considérablement la sensibilité du test, une partie de sa résolution spatiale est perdue. Dans une dernière étape, les molécules de biotine sont détectées à l’aide de streptavidine marquée par fluorescence. La réaction HRP dépose de nombreuses molécules de tyramide-biotine sur ou à proximité de l’antigène d’intérêt. Cela augmente considérablement le nombre de sites de liaison streptavidine-fluorochrome, amplifiant ainsi considérablement la sensibilité du test (Figure 1). Alternativement, le tyramide peut être directement couplé à un fluorochrome, éliminant ainsi le besoin de fluorophores couplés à la streptavidine. L’immunohistochimie des protéines et l’hybridation in situ ADN/ARN ont été parmi les premières méthodes par lesquelles la TSA a été utilisée pour améliorer l’intensité du signal^22,23. Plus récemment, la TSA a été combinée avec la cytométrie de flux intracellulaire²⁴ et la spectrométrie^{de masse 25}.

Ici, nous présentons un protocole pour détecter la sérine 227 humaine phosphorylée RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) et la MLKL humaine phosphorylée (p-MLKL [S358]) lors de l’activation de ZBP1 par infection à HSV-1 par microscopie d’immunofluorescence. Nous utilisons une lignée cellulaire d’adénocarcinome colorectal humain HT-29 sensible à la nécroptose qui a été transduite pour exprimer de manière stable ZBP1 humain. Ces cellules ont été infectées par une souche HSV-1 exprimant une protéine mutante ICP6 (HSV-1^{ICP6 mutRHIM)} dans laquelle quatre acides aminés centraux du RHIM viral (VQCG) ont été remplacés par des alanines (AAAA), rendant ainsi l’ICP6 incapable de bloquer la nécroptose médiée par ZBP1^13,14,15. Pour surmonter le problème du faible rapport signal/bruit des anticorps actuellement disponibles dans le commerce dirigés contre p-RIPK3 et p-MLKL dans l’immunomarquage²⁶, nous effectuons une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) (Figure 1), qui se traduit par une détection robuste de p-RIPK3 humain (S227) et améliore la sensibilité de détection du p-MLKL humain (S358) d’un ordre de grandeur.

Protocole

1. Préparation du tyramide biotinylé

1. Préparer du tyramide biotinylé à partir de biotine-tyramide. Pour faire une solution mère de 10 mM, dissoudre 3,6 mg de biotine-tyramide dans 1 mL de DMSO. Conserver le produit dissous dans des aliquotes à −20 °C pour en préserver la qualité.

2. Maintenir les cellules HT-29 en culture

NOTE: Les HT-29 exprimant ZBP1 ont été générés par transduction avec un lentivecteur²⁷ codant pour ZBP1 humain.

1. Conservez les cellules HT-29 exprimant ZBP1 dans le milieu 5A de McCoy supplémenté en L-glutamine, en pyruvate de sodium et en sérum bovin fœtal à 10 % (désormais appelé milieu complet) et maintenez-les dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone. Idéalement, utilisez des cellules d’un faible nombre de passages (moins de 10). Laissez les cellules récupérer pendant au moins 5 jours après le cycle de dégel avant le début de l’expérience.
2. Pour détacher les cellules du ballon de culture, retirer le milieu et laver les cellules avec 5 mL de PBS (préchauffé à 37 °C). Ensuite, ajouter la quantité appropriée de trypsine/EDTA (0,05 % de trypsine et 0,032 % d’EDTA, respectivement, préchauffées à 37 °C) aux cellules (2 mL pour une fiole T75, 3 mL pour une fiole T175).
3. Incuber les cellules avec de la trypsine/EDTA jusqu’à 10 min dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, tapotez la fiole et vérifiez visuellement si les cellules se sont détachées du ballon à l’aide d’un microscope avec un grossissement d’objectif 4x-20x.
4. Si les cellules ne sont pas complètement détachées, incuber encore 5 minutes à 37 °C. Lorsque les cellules sont détachées, arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 6 mL de milieu complet dans le flacon.
5. Rassemblez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Compter les cellules à l’aide d’une coloration bleu trypan pour évaluer la viabilité; Une dilution de 1:5 est recommandée. Ne poursuivez l’expérience que si la viabilité des cellules dépasse 90%.

3. Début de l’expérience, ensemencement et stimulation des cellules

1. Ensemencer 90 000 cellules HT-29 exprimant ZBP1 en milieu complet dans une plaque de puits de 1 cm² de surface qui permet une microscopie haut de gamme. Utiliser un volume final de 200 μL par puits.
2. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 °C avec du dioxyde de carbone à 5%. Tenez compte du fait que certains puits supplémentaires doivent être ensemencés pour les contrôles de coloration, ce qui est expliqué plus en détail à l’étape 5.6.
3. Lorsque les cellules atteignent 70% à 80% de confluence, ajoutez un stimulus induisant la nécroptose aux cellules. Ici, les cellules ont été infectées par HSV-1 ICP6^mutRHIM (multiplicité de l’infection [MOI] de 5, définie comme des unités formant des plaques (pfu) divisée par le nombre de cellules; le pfu a été quantifié à l’aide d’un test de plaque sur des cellules Vero) pendant 6 h, 8 h ou 10 h.
4. Comme témoin positif de l’induction de la nécroptose, stimuler les cellules pendant 4 h avec un cocktail induisant la nécroptose contenant 30 ng / mL de TNF, 20 μM de l’inhibiteur de pan-caspase zVAD-fmk et 5 μM du mimétique SMAC BV6.
5. Comme témoin négatif pour la coloration p-RIPK3 (S227), inclure GSK'840 (1 μM) pour inhiber l’activité de la kinase RIPK3 et empêcher l’autophosphorylation de S227. Idéalement, ajoutez l’inhibiteur dans une condition non traitée et après la stimulation de la nécroptose. L’inhibiteur peut être ajouté simultanément avec une infection virale.
6. Préparer les stimulations à feu moyen, préchauffé à 37 °C. Utilisez un volume final de 200 μL par puits pour toutes les stimulations.

4. Fixation des cellules

1. Retirez le milieu et lavez les cellules avec 200 μL de 1x PBS. Ensuite, ajoutez 150 μL de PFA à 4% (déjà équilibré à température ambiante) aux cellules et incuber à température ambiante pendant 30 min.
   REMARQUE: Si vous utilisez des cellules qui se détachent facilement, la fixation des cellules peut être optimisée comme suit. Retirer 100 μL de milieu du puits, de sorte qu’un volume de 100 μL reste sur la plaque. Ajouter 100 μL de PFA à 4% aux cellules. Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, retirer le milieu/fixateur des puits et le remplacer par 150 μL de PFA à 4 %. Incuber les cellules pendant encore 20 minutes à température ambiante pour assurer une fixation complète des cellules.
2. Après la fixation, retirez le PFA à 4% et lavez les cellules 3x avec 200 μL de 1x PBS. Les échantillons peuvent être conservés dans un excès (>200 μL) de 1x PBS à 4 °C pendant une nuit jusqu’à un traitement ultérieur.

5. Perméabilisation et coloration primaire

1. Retirez le PBS et ajoutez 100 μL de tampon de perméabilisation (0,5% Triton X-100 dans PBS). Incuber à température ambiante pendant 30 min.
2. Retirer le tampon de perméabilisation et, par la suite, laver les puits avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber la chambre d’imagerie avec tampon de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire inclinable (20-30 mouvements de bascule par min).
3. Pour éviter la liaison non spécifique des anticorps primaires, ajouter 100 μL de milieu bloquant et incuber à température ambiante pendant 2 h. Alternativement, cette étape de blocage peut être remplacée par un blocage avec 3% de BSA, 0,1% de Triton-X-100 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
4. Laver les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
5. Après avoir retiré le tampon de lavage, ajouter les anticorps primaires dans la chambre d’imagerie et incuber pendant une nuit à 4 °C. Utilisez un volume final de 100 μL pour couvrir le puits. Pendant la nuit d’incubation à 4 °C, ne placez pas la chambre d’imagerie sur un agitateur de laboratoire basculant.
   NOTE: L’anti-p-MLKL (S358; dilution: 1:200) et l’anti-p-RIPK3 (S227; dilution: 1:200) partagent le lapin comme espèce hôte et ne doivent donc pas être combinés dans un seul puits. Pour surveiller l’infection virale, combinez un anticorps primaire contre une protéine virale de votre choix avec p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227). Ici, les cellules ont été infectées par une infection à HSV-1 suivie d’une coloration ICP0 (dilution: 1:50, espèce hôte: souris).
6. Prenez en considération les contrôles de coloration nécessaires à ce stade. Toujours inclure une condition d’absence d’anticorps primaire pour visualiser le contexte potentiel de l’étape d’amplification TSA pour définir le seuil de masquage (voir étape 9).
   REMARQUE: Dans le cas d’un protocole de co-coloration (par exemple, combinant p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227] avec un anticorps contre une protéine virale), utilisez également des colorations simples. L’utilisation de colorations simples est importante pour corriger le signal de purge potentiel dans d’autres canaux d’imagerie.

6. Amplification du signal tyramide (TSA)

1. Retirer le mélange d’anticorps primaires et laver les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
2. Retirez le tampon de lavage et ajoutez 100 μL d’anticorps secondaire marqué HRP reconnaissant l’espèce d’anticorps primaire qui doit être amplifiée. Pour amplifier le signal p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), ajouter 100 μL d’anti-lapin-HRP et incuber pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
   REMARQUE: Seuls p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227) seront amplifiés. La coloration d’une protéine virale sera visualisée à l’aide d’une méthode de coloration indirecte standard.
3. Ensuite, lavez les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
4. Dans les étapes suivantes, ajoutez le tyramide biotinylé à la plaque microscopique. En utilisant le groupe HRP couplé aux anticorps secondaires, la réaction enzymatique déclenchera la formation de radicaux tyramide à proximité immédiate de la cible primaire (ici, p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227]).
5. Pour activer l’activité enzymatique de HRP, ajoutez un substrat oxydant avec le tyramide biotinylé. Pour ce faire, compléter le tampon TSA (acide borique 0,1 M [pH 8,5]) avec 0,03 M_H2O2; plus précisément, prendre 5 mL de tampon TSA et ajouter 5 μL de H 2 O_{2 à 30} %.
6. Maintenant, diluez la biotine-tyramide dans un tampon TSA supplémenté en_H2O2 allant de 1:1 000 à 1:20 000.
   NOTE: Le facteur de dilution de la biotine-tyramide doit être optimisé par lot.
7. Retirer le tampon de lavage des puits et ajouter de la biotine-tyramide diluée dans les puits jusqu’à un volume final de 100 μL. Incuber à température ambiante pendant 10 min sur un agitateur de laboratoire basculant.
8. Ensuite, lavez les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.

7. Fluorophores

REMARQUE: Puisque le signal de l’anticorps primaire est converti en un groupe biotine, p-MLKL (S358) et p-RIPK3 (S227) sont visualisés à l’aide de streptavidine couplée à un fluorophore (fluorophore 568, dilution: 1:500). De plus, les noyaux sont colorés avec du DAPI (5 μg/mL). Si une protéine virale est incluse dans le protocole de coloration, incluez un anticorps secondaire marqué par fluorescence approprié contre l’espèce hôte de votre anticorps primaire. Dans les résultats représentatifs, un anti-ICP0 de souris a été utilisé. En tant qu’anticorps secondaire de chèvre, l’anti-souris couplé au fluorophore 633 (dilution: 1:1 000) a été inclus.

1. Faire le mélange de coloration dans un tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS) contenant les anticorps et les taches mentionnés ci-dessus. Retirer le tampon de lavage, ajouter 100 μL de mélange de coloration et incuber à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur de laboratoire basculant. Gardez la chambre d’imagerie à l’abri de la lumière à partir de cette étape.
2. Ensuite, lavez les puits 2x avec un tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
3. Enfin, rincez les puits 2x avec 1x PBS. Conservez les échantillons dans un excès (> 200 μL) de 1x PBS jusqu’à l’imagerie. Vous pouvez également immerger les échantillons dans un support de montage pour préserver la coloration. La chambre d’imagerie est maintenant prête à être visualisée au microscope confocal.

8. Imagerie au microscope confocal

1. Allumez le microscope confocal et les lasers au moins 10 minutes avant l’imagerie.
2. Utilisez un objectif d’immersion pour la sensibilité. De préférence, utilisez un grossissement d’objectif de 40x ou 63x. Avant l’imagerie, nettoyez les objectifs d’immersion avec un nettoyant pour lentilles à l’aide de boules de coton appropriées. Les objectifs sales (par exemple, à cause de la poussière) peuvent entraîner des images de qualité inférieure.
3. Placez une quantité excessive d’huile au fond de la chambre d’imagerie. De plus, ajoutez une goutte d’huile sur l’objectif de choix.
4. Placez la chambre d’imagerie sur le microscope. Recherchez le champ de mise au point à l’aide de la coloration DAPI ou de l’imagerie en fond clair. Si nécessaire, déplacez-vous autour de la chambre d’imagerie pour assurer une bonne propagation de l’huile d’immersion.
5. Configurez les pistes d’imagerie nécessaires au microscope. Selon le microscope, les étapes suivantes peuvent varier (tableau 1).
   REMARQUE: Lors de la configuration des pistes d’imagerie, programmez les pistes de sorte que la coloration nucléaire soit mesurée en dernier. Le laser 405 nm peut contribuer au photoblanchiment et, par conséquent, à la perte de signal spécifique dans tous les canaux.
6. Pour analyser une cellule complète pour détecter la présence de p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), mesurez les piles z qui couvrent la hauteur de la cellule. Ici, les piles z étaient constituées de 40 tranches tous les 0,16 μm, ce qui donnait une plage de 6,22 μm.

Piste	Laser	Séparateur de faisceau	Filtre
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)	561	MBS -405 +	BP 570-620 + LP645
		MBS 488/561/633 + SBS SP615
Gène viral : ICP0	633	MBS -405 +	BP 420-480 + LP605
		MBS 488/561/633 + SBS LP570
Noyau: DAPI	405	MBS -405 +	BP 420-480 + BP 495-550
		MBS 488/561/633

Tableau 1 : Pistes d’imagerie pour la visualisation cellulaire.

9. Analyse et quantification des données

1. Téléchargez les images microscopiques dans le logiciel. Utilisez la mise au point étendue pour visualiser toutes les informations de la pile z dans une image 2D.
2. Ensuite, programmez le protocole d’analyse afin d’extraire les informations suivantes : le nombre de cellules par image, la somme des voxels montrant la coloration p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)⁺. Un voxel représente un volume tridimensionnel, défini comme l’équivalent tridimensionnel d’un pixel.
3. Pour quantifier le nombre de cellules par image, segmentez le noyau. Pour réduire le bruit dans les résultats de segmentation, ajoutez une limite de taille à la segmentation (>100 μm³). Le nombre de noyaux segmentés représente le nombre de cellules dans l’image.
4. Pour quantifier la quantité de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)⁺, programmez une segmentation par seuil. Réglez le seuil de sorte qu’aucun signal ne soit capté dans les images sans anticorps primaire (NP).
5. Adaptez davantage le seuil en utilisant les images de la condition simulée non traitée. Pour assurer une détection sensible de l’augmentation du signal due à la stimulation de la nécroptose, limitez la captation des voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)⁺ dans des conditions simulées en définissant un seuil plus élevé. Vérifiez toujours le protocole d’analyse programmée dans plusieurs images de la condition simulée et de l’infection virale induisant la nécroptose.
6. Exécutez l’analyse sur tous les jeux d’images. Exportez la quantification voxel et la segmentation du noyau dans un fichier .txt pour un traitement ultérieur dans un tableur.
7. Créez un tableau croisé dynamique des données indiquant le nom de l’image, la quantification du noyau et la somme des voxels détectés.
8. Ensuite, divisez la somme des voxels positifs par le nombre de cellules dans l’image. Il en résulte une valeur relative de voxels positifs par cellule. Pour visualiser l’augmentation du pli, divisez la valeur relative de p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)⁺ voxels par cellule par la médiane de la condition non traitée (simulée).

Résultats

La détection par immunofluorescence de la phosphorylation MLKL et en particulier de la phosphorylation RIPK3 dans les cellules humaines est techniquement difficile²⁶. Nous présentons ici un protocole de coloration amélioré pour p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) humains lors de l’activation de ZBP1. Le protocole comprend une étape TSA pour améliorer la limite de détection et la sensibilité des signaux fluorescents. Pour valider la méthode, une comparaison côte à côte de l’immunofluore...

Discussion

Ce protocole de coloration immunofluorescente décrit l’utilisation de l’amplification du signal tyramide (TSA) pour augmenter la sensibilité aux événements de signalisation de la voie de signalisation nécroptotique humaine qui sont difficiles à détecter, y compris la phosphorylation de RIPK3 et MLKL²⁶. L’inclusion d’une étape TSA améliore considérablement le seuil de détection de p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) et augmente la sensibilité de la contrainte p-MLKL (S358). La TSA a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP	Agilent Technologies Belgium	K4002	Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633	Thermofisher	35513	Secundary antibody
HSV-1 ICP0	Santa Cruz	sc-53070	Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum	In house production	xx	Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL	Abcam	ab187091	Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3	Abcam	ab209384	Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI	Thermofisher	D21490	To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568	Thermofisher	S11226	To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2	Sigma	H1009	Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA	SANBIO	AR1068	To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide	R&D Systems	6241	To amplify signal, HRP substrate
BV-6	Selleckchem	S7597	BV6 IAP Inhibitor
			For cell culture: to detach the cells
			8.0 g/L NaCl
			0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04%	In house formulation		1.1 g/L Na2HPO4
			0.2 g/L NaH2PO4
			0.2 g/L KCl
			0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum	TICO	FBS EU XXX	For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840	Aobious	AOB0917	RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock	Active Motif	15252	Blocking solution
PBS	Gibco	10444402
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α	In house production	-	Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML	To permeabilise the cells
Trypan blue	Merck	11732	For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine	Sigma-Aldrich	T4424	For cell culture: to detach the cells
zVAD	Bachem	BACE4026865.0005	Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom	iBidi	80807	To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium	Electron Microscopy Sciences	71001-10	To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C	ZEISS	444970-9000-000	To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner	ZEISS	000000-0105-200	To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope			To visualise the sample
Software
Excel	Office	xx	To process the data
Prism 9	Graphpad	xx	To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3	Volocity	xx	To perform quantifications
Zen black	ZEISS	xx	To aquire and process images
Zen blue	ZEISS	xx	To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain	produced by  Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain	Produced by Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8	in house stock	in house replication	IAV as a trigger for necroptosis