Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas

Resumo

A amplificação do sinal de tiramida durante a coloração imunofluorescente permite a detecção sensível de RIPK3 fosforilado e MLKL durante necroptose induzida por ZBP1 após infecção por HSV-1.

Resumo

A proteína quinase 3 (RIPK3) e sua linhagem mista quinase quinase (MLKL) são reguladores críticos da necroptose, uma forma inflamatória de morte celular com importantes funções antivirais. A autofosforilação do RIPK3 induz a fosforilação e a ativação da proteína executora formadora de poros da necroptose MLKL. O tráfico e a oligomerização da MLKL fosforilada na membrana celular resultam em lise celular, característica da morte celular necroptótica. O sensor de ácido nucleico ZBP1 é ativado ligando-se ao RNA DE FITA DUPLA (Z-RNA) da forma Z canhoto após a infecção por vírus de RNA e DNA. A ativação do ZBP1 restringe a infecção pelo vírus, induzindo a morte celular regulada, incluindo necroptose, de células hospedeiras infectadas. A microscopia de imunofluorescência permite a visualização de diferentes etapas de sinalização a jusante da necroptose mediada por ZBP1 por célula. No entanto, a sensibilidade da microscopia de fluorescência padrão, usando anticorpos fosfo-específicos atualmente disponíveis comercialmente contra RIPK3 e MLKL humanos, impede a imagem reprodutível desses marcadores. Aqui, descrevemos um procedimento de coloração otimizado para serina (S) fosforilada RIPK3 (S227) e MLKL (S358) em células HT-29 humanas infectadas com o vírus herpes simplex 1 (HSV-1). A inclusão de uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) no protocolo de coloração imunofluorescente permite a detecção específica de RIPK3 fosforilado S227. Além disso, a TSA aumenta muito a sensibilidade da detecção de MLKL fosforilado S358. Juntos, esse método permite a visualização desses dois eventos críticos de sinalização durante a indução da necroptose induzida por ZBP1.

Introdução

A serina/treonina proteína quinase 3 (RIPK3) e a quinase de linhagem mista (MLKL) são reguladores centrais da morte celular necroptótica ^1,2. A necroptose é uma forma lítica e inflamatória de morte celular regulada envolvida na imunidade antiviral e na autoinflamação. A necroptose de células infectadas por vírus interrompe imediatamente a replicação do vírus. A lise celular após a indução da necroptose também libera padrões moleculares associados a danos, que estimulam a imunidade antiviral ^3,4. A necroptose é iniciada pela ativação da RIPK3 após interações mediadas por motivo de interação homotípica RIP (RHIM) com uma das três moléculas ativadoras a montante: RIPK1 (no engajamento do receptor de TNF 1 [TNFR1]), β de interferon indutor de adaptador contendo domínio TIR (TRIF; no engajamento do receptor Toll-like 3 e 4), ou o sensor de ácido nucleico antiviral Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)^1,2 . A sinalização da necroptose prossegue através de uma série de eventos de fosforilação começando com a autofosforilação do RIPK3. A autofosforilação da RIPK3 humana na serina (S)227 dentro de seu domínio da quinase é um pré-requisito para a necroptose, permitindo a interação com a MLKL e é comumente usada como marcador bioquímico para ativação da RIPK3 humana e morte celular necroptótica ^1,5. Uma vez ativado, o RIPK3 fosforila o loop de ativação do MLKL na treonina (T)357 e S358¹. Isso causa uma mudança na conformação do MLKL, resultando na exposição do domínio do feixe de quatro hélices N-terminal. O MLKL então oligomeriza e trafega para a membrana celular, onde forma um poro através da inserção dos quatro feixes de hélices expostos na bicamada lipídica, levando eventualmente à morte celular ^2,6.

ZBP1 é um sensor de ácido nucleico antiviral que reconhece ácidos nucleicos canhotos da forma Z, incluindo RNA de fita dupla na conformação Z (Z-RNA). A ligação do Z-RNA ocorre através de dois domínios Zα posicionados no terminal N do ZBP1. Acredita-se que o Z-RNA que se acumula durante a infecção por vírus de RNA e DNA envolva diretamente o ZBP1 ^7,8. O ZBP1 ativado recruta RIPK3 através de seus RHIMs centrais e induz a morte celular regulada, incluindo necroptose ^9,10. Os vírus adotaram inúmeros mecanismos de escape para neutralizar a necroptose de células hospedeiras induzida por^{ZBP11 11}. Por exemplo, a subunidade 1 da ribonucleotídeo redutase do vírus herpes simplex 1 (HSV-1), conhecida como ICP6 e codificada pelo UL39, abriga o RHIM em seu N-terminal que interfere na ativação do RIPK3 mediado por ZBP1 em células humanas^12,13,14,15. O ZBP1 não apenas restringe a replicação viral, mas estudos em camundongos mostraram que a ativação do ZBP1 causa doenças inflamatórias e estimula a imunidade ao câncer 16,17,18,19,20,21. Protocolos que detectam eventos de sinalização que ocorrem durante a necroptose induzida por ZBP1 em células humanas são, portanto, valiosos para avaliar o papel do ZBP1 nesses processos.

A amplificação de sinal de tiramida (TSA), também conhecida como deposição catalisada de repórter (CARD), foi desenvolvida para melhorar o limite de detecção e a relação sinal-ruído em imunoensaios baseados em anticorpos. Durante a TSA, qualquer anticorpo primário pode ser usado para detectar o antígeno de interesse. A peroxidase de rábano (HRP), acoplada a um anticorpo secundário, catalisa o acúmulo local de radicais de tiramida biotinilados na presença de peróxido de hidrogênio. Esses radicais de biotina-tiramida ativados então reagem com resíduos proximais de tirosina para formar ligações covalentes. Potenciais substratos de tiramida-biotina incluem o próprio antígeno, os anticorpos primários e secundários e proteínas vizinhas. Assim, enquanto a TSA melhora significativamente a sensibilidade do ensaio, parte de sua resolução espacial é perdida. Em uma etapa final, as moléculas de biotina são detectadas usando treptavidina marcada fluorescentemente. A reação HRP deposita muitas moléculas de tiramida-biotina sobre ou perto do antígeno de interesse. Isso aumenta muito o número de sítios de ligação treptavidina-fluorocromo, ampliando consideravelmente a sensibilidade do ensaio (Figura 1). Alternativamente, a tiraamida pode ser diretamente acoplada a um fluorocromo, eliminando a necessidade de fluoróforos acoplados à estreptavidina. A imuno-histoquímica proteica e a hibridização in situ DNA/RNA estavam entre os primeiros métodos pelos quais a ATS foi empregada para melhorar as intensidades de sinal^22,23. Mais recentemente, a AST tem sido combinada com citometria de fluxo intracelular²⁴ e espectrometria de massas²⁵.

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar serina 227 RIPK3 humana fosforilada (p-RIPK3 [S227]) e MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) após a ativação de ZBP1 por infecção por HSV-1 usando microscopia de imunofluorescência. Usamos uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano HT-29 sensível à necroptose que foi transduzida para expressar de forma estável a ZBP1 humana. Essas células foram infectadas com uma cepa de HSV-1 expressando uma proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6^mutRHIM) na qual quatro aminoácidos centrais dentro da IHMI viral (VQCG) foram substituídos por alaninas (AAAA), tornando a ICP6 incapaz de bloquear a necroptose mediada por^{ZBP1 13,14,15}. Para superar o problema da baixa relação sinal-ruído dos anticorpos atualmente disponíveis comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 e p-MLKL na imunocoloração²⁶, realizamos uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta na detecção robusta de p-RIPK3 humano (S227) e melhora a sensibilidade de detecção de p-MLKL humano (S358) em uma ordem de magnitude.

Protocolo

1. Preparação de tiramida biotinilada

1. Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para fazer uma solução-mãe de 10 mM, dissolver 3,6 mg de biotina-tiramida em 1 mL de DMSO. Conservar o produto dissolvido em alíquotas a -20 °C para preservar a qualidade.

2. Manutenção das células HT-29 em cultura

NOTA: Os HT-29 que expressam ZBP1 foram gerados por transdução com um lentivetor²⁷ que codifica ZBP1 humano.

1. Manter as células HT-29 que expressam ZBP1 no meio 5A de McCoy suplementadas com L-glutamina, sódio-piruvato e 10% de soro fetal bovino (a partir de agora referido como meio completo) e manter em uma incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Idealmente, use células de um número de passagem baixo (menos de 10). Deixe as células se recuperarem por pelo menos 5 dias após o ciclo de descongelamento antes do início do experimento.
2. Para separar as células do balão de cultura, retirar o meio e lavar as células com 5 ml de PBS (pré-aquecido a 37 °C). Em seguida, adicionar a quantidade adequada de tripsina/EDTA (tripsina a 0,05% e EDTA a 0,032%, respetivamente, pré-aquecida a 37 °C) às células (2 ml para um balão T75, 3 ml para um balão T175).
3. Incubar as células com tripsina/EDTA até 10 min numa incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Seguidamente, toque no balão e verifique visualmente se as células se desprenderam do balão utilizando um microscópio com uma ampliação objetiva de 4x-20x.
4. Se as células não estiverem totalmente separadas, incubar durante mais 5 minutos a 37 °C. Quando as células estiverem descoladas, interromper a reacção enzimática adicionando 6 ml de meio completo ao balão.
5. Reúna a suspensão celular em um tubo de 15 mL. Conte as células usando uma mancha azul de tripano para avaliar a viabilidade; recomenda-se uma diluição de 1:5. Só prossiga com o experimento se a viabilidade das células exceder 90%.

3. Iniciando o experimento, semeadura e estimulação das células

1. Semear 90.000 células HT-29 que expressam ZBP1 em meio completo em uma placa de poço de área de superfície de 1 cm² que permite microscopia de alta qualidade. Use um volume final de 200 μL por poço.
2. Incubar as células durante a noite a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Leve em consideração que alguns poços extras precisam ser semeados para controles de coloração, o que é explicado com mais detalhes na etapa 5.6.
3. Quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, adicione um estímulo indutor de necroptose às células. Aqui, as células foram infectadas com HSV-1 ICP6^mutRHIM (multiplicidade de infecção [MOI] de 5, definida como unidades formadoras de placas (pfu) divididas pelo número de células; o pfu foi quantificado usando um ensaio de placa em células Vero) por 6 h, 8 h ou 10 h.
4. Como controle positivo para indução de necroptose, estimular as células por 4 h com um coquetel indutor de necroptose contendo 30 ng/mL de TNF, 20 μM do inibidor da pan-caspase zVAD-fmk e 5 μM do mimético SMAC BV6.
5. Como controle negativo para a coloração p-RIPK3 (S227), inclua GSK'840 (1 μM) para inibir a atividade da quinase RIPK3 e prevenir a autofosforilação da S227. Idealmente, adicione o inibidor em uma condição não tratada e após a estimulação da necroptose. O inibidor pode ser adicionado simultaneamente com a infecção viral.
6. Preparar as injeções em meio completo, pré-aquecidas a 37 °C. Use um volume final de 200 μL por poço para todas as estimulações.

4. Fixação das células

1. Retire o meio e lave as células com 200 μL de 1x PBS. Em seguida, adicione 150 μL de PFA a 4% (já equilibrado à temperatura ambiente) às células e incube à temperatura ambiente por 30 min.
   Observação : se você estiver usando células que se desprendem facilmente, a fixação das células pode ser otimizada da seguinte maneira. Remova 100 μL de meio do poço, de modo que um volume de 100 μL permaneça na placa. Adicione 100 μL de 4% de PFA às células. Incubar as células durante 5 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, retire o meio/fixador dos poços e substitua por 150 μL de PFA a 4%. Incubar as células por mais 20 minutos à temperatura ambiente para garantir a fixação completa das células.
2. Após a fixação, retire o PFA a 4% e lave as células 3x com 200 μL de PBS 1x. As amostras podem ser armazenadas em excesso (>200 μL) de 1x PBS a 4 °C durante a noite até processamento posterior.

5. Permeabilização e coloração primária

1. Remova o PBS e adicione 100 μL de tampão de permeabilização (0,5% Triton X-100 em PBS). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
2. Retirar o tampão de permeabilização e, posteriormente, lavar os poços com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar a câmara de imagem com tampão de lavagem por 5 min à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado (20-30 movimentos de balanço por minuto).
3. Para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos primários, adicionar 100 μL de meio bloqueador e incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Alternativamente, esta etapa de bloqueio pode ser substituída por bloqueio com 3% de BSA, 0,1% de Triton-X-100 em PBS por 1 h à temperatura ambiente.
4. Lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
5. Depois de remover o tampão de lavagem, adicionar os anticorpos primários à câmara de imagem e incubar durante a noite a 4 °C. Use um volume final de 100 μL para cobrir o poço. Durante a incubação durante a noite a 4 °C, não coloque a câmara de imagem num agitador de laboratório inclinado.
   NOTA: Anti p-MLKL (S358; diluição: 1:200) e anti-p-RIPK3 (S227; diluição: 1:200) compartilham coelho como espécie hospedeira e, portanto, não devem ser combinados em um poço. Para monitorar a infecção viral, combine um anticorpo primário contra uma proteína viral de escolha com p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227). Aqui, as células foram infectadas com infecção por HSV-1 seguida de coloração ICP0 (diluição: 1:50, espécie hospedeira: camundongo).
6. Leve em consideração os controles de coloração necessários neste momento. Sempre inclua uma condição sem anticorpos primários para visualizar o contexto potencial da etapa de amplificação da TSA para definir o limiar de mascaramento (consulte a etapa 9).
   NOTA: No caso de um protocolo de cocoloração (por exemplo, combinando p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227] com um anticorpo contra uma proteína viral), use também coloração única. O uso de manchas únicas é importante para corrigir possíveis sinais de sangramento em outros canais de imagem.

6. Amplificação de sinal de tiramida (TSA)

1. Remova a mistura de anticorpos primários e lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
2. Remova o tampão de lavagem e adicione 100 μL de anticorpo secundário marcado com HRP, reconhecendo as espécies de anticorpos primários que precisam ser amplificadas. Para amplificar o sinal p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), adicione 100 μL de anti-coelho-HRP e incube por 30 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
   NOTA: Somente p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227) serão amplificados. A coloração de uma proteína viral será visualizada usando um método padrão de coloração indireta.
3. Posteriormente, lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
4. Nas próximas etapas, adicione a tiramida biotinilada à placa microscópica. Usando o grupo HRP acoplado aos anticorpos secundários, a reação enzimática desencadeará a formação de radicais tiramida nas proximidades do alvo primário (aqui, p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227]).
5. Para ativar a atividade enzimática da HRP, adicione um substrato oxidante juntamente com a tiramida biotinilada. Para conseguir isso, complemente o tampão TSA (0,1 M de ácido bórico [pH 8,5]) com 0,03 M H 2 O₂; especificamente, tome 5 mL de tampão TSA e adicione 5 μL de 30% H 2 O₂.
6. Agora, dilua a biotina-tiramida em tampão TSA suplementado_{com H 2}O₂, variando de 1:1.000 a 1:20.000.
   NOTA: O fator de diluição da biotina-tiramida precisa ser otimizado por lote.
7. Remova o tampão de lavagem dos poços e adicione biotina-tiramida diluída aos poços a um volume final de 100 μL. Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos em um agitador de laboratório inclinado.
8. Em seguida, lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.

7. Fluoróforos

NOTA: Como o sinal do anticorpo primário é convertido em um grupo biotina, p-MLKL (S358) e p-RIPK3 (S227) são visualizados usando estreptavidina acoplada a um fluoróforo (fluoróforo 568, diluição: 1:500). Além disso, os núcleos são corados com DAPI (5 μg/mL). Se uma proteína viral estiver incluída no protocolo de coloração, inclua um anticorpo secundário adequado marcado fluorescentemente contra a espécie hospedeira do seu anticorpo primário. Nos resultados representativos, foi utilizado um rato anti-ICP0. Como anticorpo secundário foi incluído um anticorpo caprino acoplado ao fluoróforo 633 (diluição: 1:1.000).

1. Faça a mistura de coloração em tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS) contendo os anticorpos e manchas mencionados acima. Retire o tampão de lavagem, adicione 100 μL de mistura de coloração e incube à temperatura ambiente por 1 h em um agitador de laboratório inclinado. Mantenha a câmara de imagem protegida da luz a partir deste passo.
2. Em seguida, lave os poços 2x com tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
3. Finalmente, lave os poços 2x com 1x PBS. Armazenar as amostras em excesso (> 200 μL) de 1x PBS até a obtenção de imagem. Alternativamente, submerja as amostras no meio de montagem para preservar a coloração. A câmara de imagem está agora pronta para ser visualizada em um microscópio confocal.

8. Imagem usando um microscópio confocal

1. Ligue o microscópio confocal e os lasers pelo menos 10 minutos antes da imagem.
2. Use um objetivo de imersão para sensibilidade. De preferência, use a ampliação objetiva de 40x ou 63x. Antes da imagem, limpe as objetivas de imersão com o limpador de lentes usando bolas de algodão apropriadas. Objetivos sujos (por exemplo, devido à poeira) podem resultar em imagens de menor qualidade.
3. Coloque uma quantidade excessiva de óleo no fundo da câmara de imagem. Além disso, adicione uma gota de óleo no objetivo de escolha.
4. Coloque a câmara de imagem no microscópio. Encontre o campo de foco usando a coloração DAPI ou usando imagens de campo brilhante. Se necessário, mova-se ao redor da câmara de imagem para garantir a disseminação adequada do óleo de imersão.
5. Configure as trilhas de imagem necessárias no microscópio. Dependendo do microscópio, os passos a seguir podem variar (Tabela 1).
   NOTA: Ao configurar as trilhas de imagem, programe as trilhas para que a coloração nuclear seja medida por último. O laser de 405 nm pode contribuir para o fotobranqueamento e, assim, a perda de sinal específico em todos os canais.
6. Para analisar uma célula completa quanto à presença de p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), meça pilhas z que abrangem a altura da célula. Aqui, as pilhas z foram feitas de 40 fatias a cada 0,16 μm, resultando em um intervalo de 6,22 μm.

Pista	Laser	Divisor de feixe	Filtro
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)	561	MBS -405 +	BP 570-620 + LP645
		MBS 488/561/633 + SBS SP615
Gene Viral: ICP0	633	MBS -405 +	BP 420-480 + LP605
		MBS 488/561/633 + SBS LP570
Núcleo: DAPI	405	MBS -405 +	BP 420-480 + BP 495-550
		MBS 488/561/633

Tabela 1: Faixas de imagem para visualização celular.

9. Análise e quantificação dos dados

1. Carregue as imagens microscópicas para o software. Use o foco estendido para visualizar todas as informações da pilha z em uma imagem 2D.
2. Em seguida, programe o protocolo de análise para extrair as seguintes informações: o número de células por imagem, a soma dos voxels mostrando a coloração p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358⁾⁺. Um voxel representa um volume tridimensional, definido como o equivalente tridimensional de um pixel.
3. Para quantificar o número de células por imagem, segmente o núcleo. Para reduzir o ruído nos resultados da segmentação, adicione uma limitação de tamanho à segmentação (>100 μm³). O número de núcleos segmentados representa o número de células na imagem.
4. Para quantificar a quantidade ^de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)⁺, programe uma segmentação baseada em limiar. Defina o limite para que nenhum sinal seja captado nas imagens sem anticorpos primários (NP).
5. Adapte ainda mais o limiar usando as imagens da condição simulada não tratada. Para garantir a detecção sensível do aumento do sinal devido à estimulação da necroptose, limite a captação de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)⁺ em condições simuladas, definindo um limiar mais alto. Sempre verifique o protocolo de análise programada em várias imagens da condição simulada e da infecção viral indutora de necroptose.
6. Execute a análise em todos os conjuntos de imagens. Exporte a quantificação de voxel e a segmentação de núcleo em um arquivo de .txt para processamento adicional em software de planilha.
7. Faça uma tabela dinâmica dos dados mostrando o nome da imagem, a quantificação do núcleo e a soma dos voxels detectados.
8. Em seguida, divida a soma dos voxels positivos pela contagem de células na imagem. Isso resulta em um valor relativo de voxels positivos por célula. Para visualizar o aumento da dobra, divida o valor relativo de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)⁺ por célula pela mediana da condição não tratada (mock).

Resultados

A detecção imunofluorescente da fosforilação MLKL e, especialmente, da fosforilação RIPK3 em células humanas é tecnicamente desafiadora²⁶. Apresentamos aqui um protocolo de coloração melhorado para p-RIPK3 humano (S227) e p-MLKL (S358) após a ativação do ZBP1. O protocolo inclui uma etapa da TSA para melhorar o limite de detecção e a sensibilidade dos sinais fluorescentes. Para validar o método, foi realizada uma comparação lado a lado da imunofluorescência mediada pela TSA com ...

Discussão

Este protocolo de coloração imunofluorescente descreve o uso de amplificação de sinal de tiramida (TSA) para aumentar a sensibilidade para eventos de sinalização da via de sinalização necroptótica humana que são difíceis de detectar, incluindo a fosforilação de RIPK3 e MLKL²⁶. A inclusão de uma etapa TSA melhora significativamente o limiar de detecção de p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta a sensibilidade do esforço p-MLKL (S358). A TSA revelou um sinal p-RIPK3 (S227) já pre...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP	Agilent Technologies Belgium	K4002	Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633	Thermofisher	35513	Secundary antibody
HSV-1 ICP0	Santa Cruz	sc-53070	Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum	In house production	xx	Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL	Abcam	ab187091	Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3	Abcam	ab209384	Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI	Thermofisher	D21490	To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568	Thermofisher	S11226	To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2	Sigma	H1009	Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA	SANBIO	AR1068	To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide	R&D Systems	6241	To amplify signal, HRP substrate
BV-6	Selleckchem	S7597	BV6 IAP Inhibitor
			For cell culture: to detach the cells
			8.0 g/L NaCl
			0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04%	In house formulation		1.1 g/L Na2HPO4
			0.2 g/L NaH2PO4
			0.2 g/L KCl
			0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum	TICO	FBS EU XXX	For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840	Aobious	AOB0917	RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock	Active Motif	15252	Blocking solution
PBS	Gibco	10444402
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α	In house production	-	Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML	To permeabilise the cells
Trypan blue	Merck	11732	For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine	Sigma-Aldrich	T4424	For cell culture: to detach the cells
zVAD	Bachem	BACE4026865.0005	Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom	iBidi	80807	To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium	Electron Microscopy Sciences	71001-10	To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C	ZEISS	444970-9000-000	To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner	ZEISS	000000-0105-200	To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope			To visualise the sample
Software
Excel	Office	xx	To process the data
Prism 9	Graphpad	xx	To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3	Volocity	xx	To perform quantifications
Zen black	ZEISS	xx	To aquire and process images
Zen blue	ZEISS	xx	To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain	produced by  Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain	Produced by Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8	in house stock	in house replication	IAV as a trigger for necroptosis