İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu

Özet

İmmünofloresan boyama sırasında tiramid sinyal amplifikasyonu, HSV-1 enfeksiyonundan sonra ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında fosforile RIPK3 ve MLKL'nin hassas tespitini sağlar.

Özet

Kinaz Reseptörü ile etkileşime giren serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve substrat karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), önemli antiviral fonksiyonlara sahip hücre ölümünün enflamatuar bir formu olan nekroptozun kritik düzenleyicileridir. RIPK3'ün otofosforilasyonu, fosforilasyonu ve nekroptoz MLKL'nin gözenek oluşturan cellat proteininin aktivasyonunu indükler. Fosforile MLKL'nin hücre zarında ticareti ve oligomerizasyonu, nekrototik hücre ölümünün karakteristiği olan hücre lizisi ile sonuçlanır. Nükleik asit sensörü ZBP1, RNA ve DNA virüsleri ile enfeksiyondan sonra solak Z formundaki çift sarmallı RNA'YA (Z-RNA) BAĞLANARAK AKTIVE EDILIR. ZBP1 aktivasyonu, enfekte konakçı hücrelerin nekroptozu da dahil olmak üzere düzenlenmiş hücre ölümünü indükleyerek virüs enfeksiyonunu kısıtlar. İmmünofloresan mikroskopi, ZBP1 aracılı nekroptozun aşağı yönünde farklı sinyal basamaklarının hücre bazında görselleştirilmesine izin verir. Bununla birlikte, standart floresan mikroskobunun, insan RIPK3 ve MLKL'ye karşı mevcut ticari olarak temin edilebilen fosfo-spesifik antikorları kullanan duyarlılığı, bu belirteçlerin tekrarlanabilir görüntülenmesini engellemektedir. Burada, herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) ile enfekte olmuş insan HT-29 hücrelerinde serin (S) fosforile edilmiş RIPK3 (S227) ve MLKL (S358) için optimize edilmiş bir boyama prosedürünü açıklıyoruz. İmmünofloresan boyama protokolüne bir tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) adımının dahil edilmesi, S227 fosforile RIPK3'ün spesifik olarak tespit edilmesini sağlar. Dahası, TSA, S358 fosforile MLKL'nin tespitinin hassasiyetini büyük ölçüde arttırır. Birlikte, bu yöntem ZBP1 kaynaklı nekroptozun indüksiyonu sırasında bu iki kritik sinyal olayının görselleştirilmesini sağlar.

Giriş

Reseptör etkileşen serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), nekrototik hücre ölümünün merkezi düzenleyicileridir ^1,2. Nekrotoz, antiviral bağışıklık ve otoinflamasyonda rol oynayan düzenlenmiş hücre ölümünün litik ve enflamatuar bir şeklidir. Virüs bulaşmış hücrelerin nekroptozu derhal virüs replikasyonunu durdurur. Nekrotoz indüksiyonunu takiben hücre lizisi, antiviral bağışıklığı uyaran hasarla ilişkili moleküler paternleri de serbest bırakır ^3,4. Nekrotoz, üç yukarı akış aktive edici molekülden biriyle RIP homotipik etkileşim motifi (RHIM) aracılı etkileşimleri takiben RIPK3'ün aktivasyonu ile başlatılır: RIPK1 (TNF reseptörü 1 [TNFR1] katılımı üzerine), TIR etki alanı içeren adaptörü indükleyen interferon-β (TRIF; Toll benzeri reseptör 3 ve 4 etkileşimi üzerine) veya antiviral nükleik asit sensörü Z-DNA bağlayıcı protein 1 (ZBP1)^1,2 . Nekrotoz sinyalizasyonu, RIPK3'ün otofosforilasyonu ile başlayan bir dizi fosforilasyon olayından geçer. İnsan RIPK3'ün kinaz alanı içindeki serin (S) 227'de otofosforilasyonu, MLKL ile etkileşimi sağlayarak nekroptoz için bir ön koşuldur ve yaygın olarak insan RIPK3 aktivasyonu ve nekroptotik hücre ölümü için biyokimyasal bir belirteç olarak kullanılır ^1,5. Aktive edildikten sonra, RIPK3, MLKL'nin aktivasyon döngüsünü treonin (T) 357 ve S358^1'de fosforile eder. Bu, MLKL konformasyonunda bir değişikliğe neden olur ve N-terminal dört sarmal demet alanının maruz kalmasına neden olur. MLKL daha sonra oligomerize olur ve hücre zarına gider, burada lipit çift katmanına maruz kalan dört sarmal demetinin yerleştirilmesiyle bir gözenek oluşturur ve sonunda hücre ölümüne yol açar ^2,6.

ZBP1, Z-konformasyonunda (Z-RNA) çift sarmallı RNA da dahil olmak üzere solak Z-formu nükleik asitleri tanıyan bir antiviral nükleik asit sensörüdür. Z-RNA bağlanması, ZBP1'in N-terminusunda konumlandırılmış iki Zα-alanı aracılığıyla gerçekleşir. RNA ve DNA virüs enfeksiyonu sırasında biriken Z-RNA'nın ZBP1 ^7,8'i doğrudan etkilediği düşünülmektedir. Aktif ZBP1, merkezi RHIM'leri aracılığıyla RIPK3'ü işe alır ve nekroptoz ^9,10 dahil olmak üzere düzenlenmiş hücre ölümünü indükler. Virüsler, ZBP1 ile indüklenen konakçı hücre nekroptozuna karşı koymak için çok sayıda kaçış mekanizması benimsemiştir¹¹. Örneğin, ICP6 olarak bilinen ve UL39 tarafından kodlanan herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) ribonükleotid redüktaz alt birimi 1, RHIM'i insan hücrelerinde ZBP1 aracılı RIPK3 aktivasyonuna müdahale eden N-terminusunda barındırır^12,13,14,15. ZBP1 sadece viral replikasyonu kısıtlamakla kalmaz, aynı zamanda fare çalışmaları ZBP1 aktivasyonunun enflamatuar hastalıklara neden olduğunu ve kanser bağışıklığını uyardığını göstermiştir 16,17,18,19,20,21. Bu nedenle, insan hücrelerinde ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında meydana gelen sinyal olaylarını tespit eden protokoller, ZBP1'in bu süreçlerdeki rolünü değerlendirmek için değerlidir.

Katalizörlü muhabir birikimi (CARD) olarak da adlandırılan tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA), antikor bazlı immünotahlillerde algılama sınırını ve sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için geliştirilmiştir. TSA sırasında, ilgilenilen antijeni tespit etmek için herhangi bir primer antikor kullanılabilir. Yaban turpu peroksidaz (HRP), ikincil bir antikorla birleştiğinde, hidrojen peroksit varlığında biyotinile tiramid radikallerinin lokal birikimini katalize eder. Bu aktive biyotin-tiramid radikalleri daha sonra kovalent bağlar oluşturmak için proksimal tirozin kalıntıları ile reaksiyona girer. Potansiyel tiramid-biyotin substratları antijenin kendisini, birincil ve ikincil antikorları ve komşu proteinleri içerir. Böylece, TSA tahlilin hassasiyetini önemli ölçüde artırırken, mekansal çözünürlüğünün bir kısmı kaybolur. Son bir adımda, biyotin molekülleri floresan olarak etiketlenmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. HRP reaksiyonu, ilgilenilen antijenin üzerinde veya yakınında birçok tiramid-biyotin molekülü biriktirir. Bu, streptavidin-florokrom bağlanma bölgelerinin sayısını büyük ölçüde arttırır, böylece tahlilin hassasiyetini büyük ölçüde arttırır (Şekil 1). Alternatif olarak, tiramid doğrudan bir florokroma bağlanabilir ve streptavidin-kuplajlı floroforlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Protein immünohistokimyası ve DNA / RNA in situ hibridizasyonu, TSA'nın sinyal yoğunluklarını iyileştirmek için kullanıldığı ilk yöntemler arasındaydı^22,23. Daha yakın zamanlarda, TSA hücre içi akış sitometrisi²⁴ ve kütle spektrometrisi²⁵ ile birleştirilmiştir.

Burada, immünofloresan mikroskobu kullanılarak HSV-1 enfeksiyonu ile ZBP1'in aktivasyonu üzerine serin 227 fosforile insan RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) ve fosforile insan MLKL'sini (p-MLKL [S358]) tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan ZBP1'i kararlı bir şekilde eksprese etmek için dönüştürülen nekropotoza duyarlı HT-29 insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı kullanıyoruz. Bu hücreler, viral RHIM (VQCG) içindeki dört çekirdek amino asidin alaninler (AAAA) ile değiştirildiği mutant bir ICP6 proteinini (HSV-1 ICP6^mutRHIM) eksprese eden bir HSV-1 suşu ile enfekte oldu, böylece ICP6, ZBP1 aracılı nekroptoz ^13,14,15'i bloke edemez hale getirdi. İmmün boyama^26'da p-RIPK3 ve p-MLKL'ye karşı halihazırda piyasada bulunan antikorların düşük sinyal-gürültü oranı sorununun üstesinden gelmek için, insan p-RIPK3'ün (S227) sağlam bir şekilde algılanmasıyla sonuçlanan ve insan p-MLKL'nin (S358) algılama hassasiyetini bir büyüklük sırasına göre artıran bir tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) adımı (Şekil 1) gerçekleştiriyoruz.

Protokol

1. Biyotinillenmiş tiramid hazırlanması

1. Biotin-tiramidden başlayarak biyotinile tiramid hazırlayın. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için, 1 mL DMSO içinde 3.6 mg biyotin-tiramid çözün. Kaliteyi korumak için çözünmüş ürünü -20 ° C'de alikotlarda saklayın.

2. HT-29 hücrelerinin kültürde tutulması

NOT: ZBP1-eksprese HT-29, insan ZBP1'i kodlayan bir lentivektör²⁷ ile transdüksiyonla üretilmiştir.

1. ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerini McCoy'un 5A ortamında L-glutamin, sodyum-piruvat ve% 10 fetal sığır serumu (bundan böyle tam ortam olarak anılacaktır) ile desteklenmiş olarak tutun ve% 5 karbondioksit ile 37 ° C'de bir inkübatörde tutun. İdeal olarak, düşük bir geçiş sayısına sahip hücreler kullanın (10'dan az). Deney başlamadan önce çözülme döngüsünden sonra hücreleri en az 5 gün iyileşmeye bırakın.
2. Hücreleri kültür şişesinden ayırmak için, ortamı çıkarın ve hücreleri 5 mL PBS (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ile yıkayın. Daha sonra, hücrelere uygun miktarda tripsin / EDTA (sırasıyla% 0.05 tripsin ve% 0.032 EDTA, 37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ekleyin (T75 şişesi için 2 mL, T175 şişe için 3 mL).
3. Tripsin/EDTA içeren hücreleri 37 °C'de %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 10 dakikaya kadar inkübe edin. Daha sonra, şişeye dokunun ve hücrelerin 4x-20x objektif büyütmeli bir mikroskop kullanarak şişeden ayrılıp ayrılmadığını görsel olarak kontrol edin.
4. Hücreler tamamen ayrılmamışsa, 37 ° C'de 5 dakika daha inkübe edin. Hücreler ayrıldığında, şişeye 6 mL tam ortam ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.
5. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Canlılığı değerlendirmek için tripan mavisi bir leke kullanarak hücreleri sayın; 1:5 seyreltme önerilir. Sadece hücrelerin yaşayabilirliği% 90'ı aşarsa deneye devam edin.

3. Deneye başlamak, tohumlama ve hücrelerin uyarılması

1. Tohum 90.000 ZBP1-eksprese HT-29 hücreleri tam ortamda, 1 cm² yüzey alanı kuyu plakasında üst düzey mikroskopiye izin verir. Kuyu başına 200 μL'lik bir uç hacim kullanın.
2. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Boyama kontrolleri için bazı ekstra kuyucukların tohumlanması gerektiğini göz önünde bulundurun, bu da adım 5.6'da daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
3. Hücreler% 70 -% 80 akıcılığa ulaştığında, hücrelere nekroptoza neden olan bir uyaran ekleyin. Burada, hücreler HSV-1 ICP6^mutRHIM (plak oluşturan birimler (pfu) olarak tanımlanan 5'in enfeksiyon çokluğu [MOI], hücre sayısına bölünür; pfu, Vero hücreleri üzerinde bir plak testi kullanılarak ölçüldü) 6 saat, 8 saat veya 10 saat boyunca enfekte edildi.
4. Nekrotoz indüksiyonu için pozitif bir kontrol olarak, hücreleri 30 ng / mL TNF, 20 μM pan-kaspaz inhibitörü zVAD-fmk ve SMAC mimetik BV6'nın 5 μM'sini içeren nekroptozise neden olan bir kokteyl ile 4 saat boyunca uyarın.
5. P-RIPK3 (S227) boyaması için negatif bir kontrol olarak, RIPK3 kinaz aktivitesini inhibe etmek ve S227'nin otofosforilasyonunu önlemek için GSK'840 (1 μM) ekleyin. İdeal olarak, inhibitörü tedavi edilmemiş bir durumda ve nekrotoz stimülasyonundan sonra ekleyin. İnhibitör, viral enfeksiyonla aynı anda eklenebilir.
6. Stimülasyonları tam ortamda, önceden 37 ° C'ye ısıtılmış olarak hazırlayın. Tüm stimülasyonlar için kuyu başına 200 μL'lik bir uç hacim kullanın.

4. Hücrelerin sabitlenmesi

1. Ortamı çıkarın ve hücreleri 200 μL 1x PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücrelere 150 μL% 4 PFA (oda sıcaklığında zaten dengelenmiş) ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   NOT: Kolayca ayrılan hücreler kullanıyorsanız, hücrelerin sabitlenmesi aşağıdaki gibi optimize edilebilir. Kuyudan 100 μL ortam çıkarın, böylece plakada 100 μL'lik bir hacim kalır. Hücrelere 100 μL% 4 PFA ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, ortamı / fiksatifi kuyucuklardan çıkarın ve% 4 PFA'nın 150 μL'si ile değiştirin. Hücrelerin tamamen sabitlenmesini sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin.
2. Fiksasyondan sonra,% 4 PFA'yı çıkarın ve hücreleri 200 μL 1x PBS ile 3x yıkayın. Numuneler, bir sonraki işleme kadar gece boyunca 4 °C'de 1x PBS'nin üzerinde (>200 μL) saklanabilir.

5. Permeabilizasyon ve primer boyama

1. PBS'yi çıkarın ve 100 μL geçirgenlik tamponu ekleyin (PBS'de %0,5 Triton X-100). Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
2. Geçirgenlik tamponunu çıkarın ve daha sonra kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Görüntüleme odasını yıkama tamponu ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında (dakikada 20-30 sallanma hareketi) inkübe edin.
3. Birincil antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, 100 μL bloke edici ortam ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. Alternatif olarak, bu engelleme adımı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 3 BSA,% 0.1 Triton-X-100 ile bloke edilerek değiştirilebilir.
4. Kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3x yıkayın (PBS'de %0,1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
5. Yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, birincil antikorları görüntüleme odasına ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Kuyuyu örtmek için 100 μL'lik bir uç hacim kullanın. 4°C'de gece boyunca inkübasyon sırasında, görüntüleme odasını eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısına yerleştirmeyin.
   NOT: Anti p-MLKL (S358; seyreltme: 1:200) ve anti-p-RIPK3 (S227; seyreltme: 1:200) tavşanı konakçı bir tür olarak paylaşır ve bu nedenle tek bir kuyuda birleştirilmemelidir. Viral enfeksiyonu izlemek için, birincil bir antikoru tercih edilen bir viral proteine karşı p-MLKL (S358) veya p-RIPK3 (S227) ile birleştirin. Burada, hücrelere HSV-1 enfeksiyonu ve ardından ICP0 boyama (seyreltme: 1:50, konakçı tür: fare) bulaştı.
6. Bu noktada gerekli boyama kontrollerini göz önünde bulundurun. Maskeleme eşiğini ayarlamak üzere TSA amplifikasyon adımının potansiyel arka planını görselleştirmek için her zaman birincil antikor yok durumu ekleyin (bkz. adım 9).
   NOT: Bir ko-boyama protokolü durumunda (örneğin, p-MLKL [S358] veya p-RIPK3 [S227] 'yi viral bir proteine karşı bir antikor ile birleştirmek) tek lekeler de kullanın. Tek lekelerin kullanılması, diğer görüntüleme kanallarındaki potansiyel kanama sinyalini düzeltmek için önemlidir.

6. Tiramit sinyal amplifikasyonu (TSA)

1. Birincil antikor karışımını çıkarın ve kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3 kat yıkayın (PBS'de %0,1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
2. Yıkama tamponunu çıkarın ve çoğaltılması gereken birincil antikor türlerini tanıyan 100 μL HRP etiketli ikincil antikor ekleyin. p-RIPK3 (S227) veya p-MLKL (S358) sinyalini yükseltmek için, 100 μL anti-tavşan-HRP ekleyin ve yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
   NOT: Yalnızca p-MLKL (S358) veya p-RIPK3 (S227) güçlendirilecektir. Bir viral proteinin boyanması, standart bir dolaylı boyama yöntemi kullanılarak görselleştirilecektir.
3. Daha sonra, kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3 kat yıkayın (PBS'de% 0,1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
4. Sonraki adımlarda, biyotinile tiramidi mikroskobik plakaya ekleyin. İkincil antikorlara bağlı HRP grubunu kullanarak, enzimatik reaksiyon birincil hedefe yakın bir yerde tiramid radikallerinin oluşumunu tetikleyecektir (burada, p-MLKL [S358] veya p-RIPK3 [S227]).
5. HRP'nin enzimatik aktivitesini aktive etmek için, biyotinile tiramid ile birlikte oksitleyici bir substrat ekleyin. Bunu başarmak için, TSA tamponunu (0,1 M borik asit [pH 8,5]) 0,03 M H_{2 O 2}ile_destekleyin; spesifik olarak, 5 mL TSA tamponu alın ve% 30 H_{2 O2'den}5 μL ekleyin.
6. Şimdi, biyotin-tiramidin_H2O₂ takviyeli TSA tamponunda 1:1.000 ila 1:20.000 arasında seyreltin.
   NOT: Biotin-tiramidin seyreltme faktörünün parti başına optimize edilmesi gerekir.
7. Yıkama tamponunu kuyucuklardan çıkarın ve seyreltilmiş biyotin-tiramid kuyucuklara 100 μL'lik bir son hacme kadar ekleyin.
8. Daha sonra, kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3x yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.

7. Floroforlar

NOT: Birincil antikorun sinyali bir biyotin grubuna dönüştürüldüğünden, p-MLKL (S358) ve p-RIPK3 (S227), bir florofora bağlanmış streptavidin kullanılarak görselleştirilir (florofor 568, seyreltme: 1:500). Ek olarak, çekirdekler DAPI (5 μg / mL) ile boyanır. Boyama protokolüne bir viral protein dahil edilmişse, birincil antikorunuzun konakçı türlerine karşı uygun bir floresan etiketli ikincil antikor ekleyin. Temsili sonuçlarda, bir fare anti-ICP0 kullanıldı. Sekonder bir antikor olarak keçi anti-faresi florofor 633 (seyreltme: 1:1.000) ile birleşmiştir.

1. Boyama karışımını yukarıda belirtilen antikorları ve lekeleri içeren yıkama tamponunda (PBS'de% 0.1 Triton X-100) yapın. Yıkama tamponunu çıkarın, 100 μL boyama karışımı ekleyin ve yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Bu adımdan itibaren görüntüleme odasını ışıktan koruyun.
2. Daha sonra, kuyucukları 2x yıkama tamponu ile yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
3. Son olarak, kuyucukları 1x PBS ile 2x durulayın. Numuneleri görüntülemeye kadar 1x PBS'den fazla (> 200 μL) saklayın. Alternatif olarak, lekelenmeyi korumak için numuneleri montaj ortamına batırın. Görüntüleme odası artık konfokal mikroskopta görselleştirilmeye hazırdır.

8. Konfokal mikroskop kullanarak görüntüleme

1. Görüntülemeden en az 10 dakika önce konfokal mikroskop ve lazerleri açın.
2. Hassasiyet için bir daldırma hedefi kullanın. Tercihen, 40x veya 63x objektif büyütme kullanın. Görüntülemeden önce, daldırma hedeflerini uygun pamuk topları kullanarak lens temizleyici ile temizleyin. Kirli hedefler (örneğin, toz nedeniyle) daha düşük kaliteli görüntülere neden olabilir.
3. Görüntüleme odasının altına fazla miktarda yağ koyun. Ek olarak, seçim hedefine bir damla yağ ekleyin.
4. Görüntüleme odasını mikroskop üzerine koyun. DAPI boyama veya parlak alan görüntüleme kullanarak odak alanını bulun. Gerekirse, daldırma yağının düzgün yayılmasını sağlamak için görüntüleme odasının etrafında hareket edin.
5. Mikroskopta gerekli görüntüleme izlerini ayarlayın. Mikroskopa bağlı olarak, aşağıdaki adımlar değişebilir (Tablo 1).
   NOT: Görüntüleme izlerini kurarken, izleri nükleer lekelenmenin en son ölçüleceği şekilde programlayın. 405 nm lazer, fotobeyazlatmaya ve dolayısıyla tüm kanallarda spesifik sinyal kaybına katkıda bulunabilir.
6. Tam bir hücreyi p-RIPK3 (S227) veya p-MLKL (S358) varlığına göre analiz etmek için, hücrenin yüksekliğini kapsayan z-yığınlarını ölçün. Burada, z-yığınları her 0.16 μm'de bir 40 dilimden yapıldı ve bu da 6.22 μm'lik bir aralıkla sonuçlandı.

İz	Lazer	Kiriş ayırıcı	Filtre
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)	561	MBS -405 +	BP 570-620 + LP645
		MBS 488/561/633 + SBS SP615
Viral Gen: ICP0	633	MBS -405 +	BP 420-480 + LP605
		MBS 488/561/633 + SBS LP570
Çekirdek: DAPI	405	MBS -405 +	BP 420-480 + BP 495-550
		MBS 488/561/633

Tablo 1: Hücre görselleştirme için görüntüleme izleri.

9. Veri analizi ve nicelleştirme

1. Mikroskobik görüntüleri yazılıma yükleyin. Z-yığınının tüm bilgilerini 2B görüntüde görselleştirmek için genişletilmiş odağı kullanın.
2. Ardından, aşağıdaki bilgileri çıkarmak için analiz protokolünü programlayın: görüntü başına hücre sayısı, p-RIPK3 (S227) ⁺ veya p-MLKL (S358) ⁺ boyamasını gösteren voksellerin toplamı. Voksel, bir pikselin üç boyutlu eşdeğeri olarak tanımlanan üç boyutlu bir hacmi temsil eder.
3. Görüntü başına hücre sayısını ölçmek için çekirdeği bölümlere ayırın. Segmentasyon sonuçlarındaki gürültüyü azaltmak için, segmentasyona bir boyut sınırlaması ekleyin (>100 μm³). Bölümlenmiş çekirdek sayısı, görüntüdeki hücre sayısını temsil eder.
4. p-RIPK3 (S227)+ veya p-MLKL (S358)⁺ voksel miktarını ölçmek için eşik tabanlı bir segmentasyon programlayın. Eşiği, birincil antikor yok (NP) görüntülerinde sinyal alınmayacak şekilde ayarlayın.
5. Tedavi edilmemiş sahte durumdan görüntüleri kullanarak eşiği daha da uyarlayın. Nekrotoz stimülasyonu nedeniyle sinyal artışının hassas bir şekilde algılanmasını sağlamak için, daha yüksek bir eşik ayarlayarak sahte koşullarda p-RIPK3 (S227)+ veya p-MLKL (S358)⁺ voksellerin alınmasını sınırlayın. Programlanmış analiz protokolünü her zaman sahte durumdan ve nekroptoza neden olan viral enfeksiyondan birkaç görüntüde kontrol edin.
6. Analizi tüm görüntü kümelerinde çalıştırın. Voksel nicelemesini ve çekirdek segmentasyonunu elektronik tablo yazılımında daha fazla işlem için .txt bir dosyada dışa aktarın.
7. Görüntü adını, çekirdek miktarını ve algılanan voksellerin toplamını gösteren verilerin bir pivot tablosunu yapın.
8. Ardından, pozitif voksellerin toplamını görüntüdeki hücrelerin sayısına bölün. Bu, hücre başına pozitif voksellerin göreceli bir değeri ile sonuçlanır. Katlama artışını görselleştirmek için, hücre başına p-RIPK3 (S227)+ veya p-MLKL (S358)⁺ voksellerin göreli değerini, işlenmemiş durumun medyanına (alay) bölün.

Sonuçlar

İnsan hücrelerinde MLKL fosforilasyonunun ve özellikle RIPK3 fosforilasyonunun immünofloresan tespiti teknik olarak zordur²⁶. Burada ZBP1'in aktivasyonu üzerine insan p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) için geliştirilmiş bir boyama protokolü sunuyoruz. Protokol, floresan sinyallerinin algılama sınırını ve hassasiyetini artırmak için bir TSA adımı içerir. Yöntemi doğrulamak için, TSA aracılı immünofloresansın hem p-RIPK3 (S227) hem de p-MLKL'nin (S358) standart dolaylı flore...

Tartışmalar

Bu immünofloresan boyama protokolü, RIPK3 ve MLKL^26'nın fosforilasyonu da dahil olmak üzere tespit edilmesi zor olan insan nekroptotik sinyal yolunun sinyal olaylarına duyarlılığı artırmak için tiramid sinyal amplifikasyonunun (TSA) kullanımını açıklar. Bir TSA adımının dahil edilmesi, p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) algılama eşiğini önemli ölçüde iyileştirir ve p-MLKL (S358) gerilmesinin hassasiyetini artırır. TSA, alaycı muamele görmüş numunelerde zaten mevcut ol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP	Agilent Technologies Belgium	K4002	Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633	Thermofisher	35513	Secundary antibody
HSV-1 ICP0	Santa Cruz	sc-53070	Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum	In house production	xx	Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL	Abcam	ab187091	Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3	Abcam	ab209384	Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI	Thermofisher	D21490	To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568	Thermofisher	S11226	To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2	Sigma	H1009	Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA	SANBIO	AR1068	To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide	R&D Systems	6241	To amplify signal, HRP substrate
BV-6	Selleckchem	S7597	BV6 IAP Inhibitor
			For cell culture: to detach the cells
			8.0 g/L NaCl
			0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04%	In house formulation		1.1 g/L Na2HPO4
			0.2 g/L NaH2PO4
			0.2 g/L KCl
			0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum	TICO	FBS EU XXX	For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840	Aobious	AOB0917	RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock	Active Motif	15252	Blocking solution
PBS	Gibco	10444402
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α	In house production	-	Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML	To permeabilise the cells
Trypan blue	Merck	11732	For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine	Sigma-Aldrich	T4424	For cell culture: to detach the cells
zVAD	Bachem	BACE4026865.0005	Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom	iBidi	80807	To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium	Electron Microscopy Sciences	71001-10	To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C	ZEISS	444970-9000-000	To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner	ZEISS	000000-0105-200	To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope			To visualise the sample
Software
Excel	Office	xx	To process the data
Prism 9	Graphpad	xx	To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3	Volocity	xx	To perform quantifications
Zen black	ZEISS	xx	To aquire and process images
Zen blue	ZEISS	xx	To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain	produced by  Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain	Produced by Dr. Jiahuai Han	in house replication	HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8	in house stock	in house replication	IAV as a trigger for necroptosis