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要約

本稿では、マウス第3中足骨の組織レベルの機械的負荷に応答して、 in vivo で埋め込まれた骨細胞の機械的に誘導されるカルシウムシグナル伝達をリアルタイムで観察するための生体内イメージングアプローチの実施について説明しています。

要約

骨組織は、機械的負荷の大きさの違いに非常に敏感です。骨細胞は、骨全体に合胞体を形成する樹状細胞であり、骨組織の機械感覚機能に関与しています。組織学、数理モデリング、細胞培養、およびex vivo骨器官培養を用いた研究は、骨細胞メカノバイオロジーの理解を大きく前進させました。しかし、骨細胞が生体内で分子レベルで力学的情報にどのように応答し、コード化するかという根本的な問題は十分に理解されていません。骨細胞における細胞内カルシウム濃度の変動は、急性骨メカノトランスダクションメカニズムについてさらに学ぶための有用な標的を提供します。本稿では、骨細胞に発現する蛍光遺伝学的カルシウム指示薬をマウス系統に組み合わせ、インビボローディングおよびイメージングシステムを用いて、ローディング中の骨細胞カルシウムレベルを直接検出するin vivoでの骨細胞メカノバイオロジーの検討方法について報告します。これは、生きたマウスの第3中足骨に明確な機械的負荷を伝達すると同時に、2光子顕微鏡を使用して骨細胞の蛍光表示カルシウム応答を監視できる3点曲げ装置によって達成されます。この技術は、骨全体の負荷に応答した骨細胞カルシウムシグナル伝達イベントの直接in vivo観察を可能にし、骨細胞のメカニズムを明らかにする試みに役立ちます。

概要

骨マトリックスは、機械的な要求1,2に従って編成され、変化する機械的要件3,4,5を考慮して動的に変化することができる。骨の機械感覚メカニズムに関する独創的な研究は、約30年前にモデリング論文として発表されました6,7,8、骨に埋め込まれた骨細胞は、局所環境での流体の動きを介して組織レベルの機械的変形を感知することが提案されました。このモデルは、in vitroおよびex vivo実験で実験的に検証され、骨細胞が非常に機械感受性1,2,3,4,5,6であり、骨形成骨芽細胞7および破骨細胞8,9,10の挙動を指示するサイトカインも発現することが明確に示されました。11、12。

カルシウムシグナル伝達は、骨細胞メカノバイオロジー13,14,15,16において中心人物および信頼できる実験標的として確立されているユビキタスなセカンドメッセンジャーである。カルシウムシグナル伝達は、細胞生物学17で広く研究されているという利点があり、これは、その下流への影響と、実験的観察に利用できる対応する蛍光ツールについて多くのことが知られていることを意味します。インビトロ解析では、骨細胞の機械的活性化を特定し、動的シグナル伝達挙動を特徴付ける手段としてカルシウムシグナル伝達が使用されています5,18,19。注目すべきは、骨細胞細胞株におけるカルシウムシグナル伝達の観察が、細胞プロセスに沿ったインテグリン付着部での体液活性化が体液流活性化の主な形態である可能性が高いという決定的な証拠を提供した20。この研究は、カルシウムシグナル伝達の有用性を示す多くの研究の1つです。これは、骨細胞の機械的活性化によって確実に誘導されるため、骨細胞のメカニズム生物学を調査するための強力な標的として機能します。

in vivoでの骨細胞のメカノトランスダクションは、その身近な微小環境に大きく依存します。マトリックス結合タンパク質(例えば、プロテオグリカン、インテグリン)は、細胞の体液活性化に重要な配置で、骨細胞膜間の機能的付着を提供する21,22。2次元(2D)in vitro分析は有用ですが、これらの重要な3次元(3D)特徴が組み込まれていないという制限があります。共焦点顕微鏡を用いた骨細胞カルシウムシグナル伝達のex vivo調製は、骨細胞が周囲のマトリックスを無傷に保ちながらどのように応答するかについていくつかの光を当てています13,16。しかし、骨から血液供給を取り除くと、ラクノカナル系の栄養素と流体力学が変化すると考えられています。骨細胞のメカニズムバイオロジーの調査には、負荷誘発性骨細胞シグナル伝達のin vivo研究が必要です。

骨に埋め込まれた細胞のin vivo研究は、明視野顕微鏡や共焦点顕微鏡などの従来のイメージング技術の限界によって大きく妨げられてきました。骨細胞は、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンタイプ1、およびその他の非コラーゲン性タンパク質からなる石灰化マトリックス23に位置しており、光学的アクセシビリティ24を制限し、インビボ調査を技術的に困難にする。しかし、近年の非線形蛍光イメージングと遺伝子コードされたカルシウムレポーターの進歩は、これらの課題を克服する機会を提供しています。

ここでは、細胞レベルの分解能25でカルシウムシグナル伝達を測定するために、in vivoで骨細胞を画像化する能力を備えた新しいアプローチを報告します。これは、マウスの骨細胞で初めて遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを使用した動的蛍光マーカーを使用することによって達成されます。DMP1-Cre駆動の骨細胞標的GCaMP6f発現を有するマウスは、マウス中足骨の骨幹皮質全体の骨細胞に可視蛍光を示す17,26。我々は、250-2,000με27の間のひずみの大きさの生理学的レベルを適用するために、3点曲げシステムを使用する。この技術は、骨全体の機械的負荷中の骨細胞カルシウムシグナル伝達ダイナミクスのin vivo可視化を可能にし、骨細胞のメカニズム生物学を理解しようとする人に役立つ可能性があります。この方法は、特に広範な表現型解析ではなく、機能ベースの分子解析(すなわち、カルシウムシグナル伝達による細胞活性の調査)を維持しながら、in vitro解析からin vivoアプリケーションへと研究を拡大しようとしている研究者に適しています。

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プロトコル

すべての方法は、コーネル大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 資機材の準備

  1. オーバーヘッド多光子顕微鏡で使用するための中足骨ローディングデバイスを設計および構築します。
    注:コンポーネントの仕様とデバイスの動作の詳細については、以前の研究25の補足資料に記載されています。簡単に言えば、主要なコンポーネントは、ロードセルとローディングブラケット、ウォーターバス、および支点ピンと直列に接続されたアクチュエータで構成されています。アクチュエータとロードセルは市販されており、最大300gの荷重を収容できる必要があります。ウォーターバス、支点ピン、およびロードブラケットは、チタンまたはステンレス鋼で構成する必要があります。これらは、社内で製造することも、3D金属印刷 によって 商業的に製造することもできます。
  2. 個々のマウスグループ(性別、治療、遺伝子型など)について、事前にアクチュエータの変位に対するひずみの大きさの値を較正します。これは、以前の研究25で概説した手順で表面ひずみマッピングを使用して行われます。
  3. 骨細胞に蛍光カルシウム指示薬コンストラクトを発現する16-18週齢のC57BL/6バックグラウンドのマウスを使用してください。骨細胞の標的発現は、flox活性化GCaMP6fマウスとDmp1-Creマウスを交配することで達成されます。創始マウスの育種戦略とベンダーの詳細は、以前に発表された研究25で説明されている。
  4. オートクレーブ(57.2°C、15psi、3〜4分)を使用して、すべての手術器具、ロードブラケット、ウォーターバス、支点ピンを滅菌します。顕微鏡対物レンズを100%エタノールで消毒します。
  5. レーザー光源、顕微鏡、ロードセル、アクチュエーターなどの電子部品の電源を入れます。各コンポーネントがウォームアップするまで 15 分から 20 分待ってから、生体内イメージングを行います。
    1. アクチュエータとロードセルのコンポーネントが制御装置で接続され、作動していることを確認します。ユーザーの好みに応じて、Matlab、LabView、Pythonなどのさまざまなプラットフォームで制御ソフトウェアを生成します。このスタディで使用されるメインの Matlab コードは Actuator_Control_Software_withLoadCell.m と呼ばれます ( MT3 Loading Device Control Software.zip フォルダ Supplementary File 1 内)。
      注:市販のほとんどの2光子顕微鏡システムには、堅牢なイメージングソフトウェアが付属しています。この方法に必要な主な特徴は、GCaMP6f(920 nm)の適切な励起にレーザーをチューニングする能力、レーザー出力強度を調整する能力、および少なくとも 6 Hz の周波数での時系列収集です。実験に先立ち、イメージングソフトウェアへのレーザー接続と 2 光子イメージングの適切な光路配置を確認する必要があります。これは、イメージングのセットアップに応じてさまざまな方法で確認されます。通常、ライトインジケーターがあります。

2. 手術

  1. 手術段階を準備し、70%エタノールで表面を滅菌します。外科的処置全体で無菌技術が採用されていることを確認してください。このプロトコルは最終手順であるため、必要な清浄度レベルを維持してください。
  2. 気化したイソフルランと医療グレードの空気または酸素を混合したマウスを1 L / minの流量で麻酔します。げっ歯類の誘導チャンバーで3%〜5%のイソフルランを使用して初期麻酔を行います。外科的および生体内イメージング手順のために、ノーズコーン内の1%〜2.5%イソフルランで麻酔を維持します。
  3. マウスの下または横に加熱装置を配置して、恒常性のあるコア体温の維持を支援します。手術中は、マウスの体温、心拍数、酸素飽和度をモニターします。呼吸数を毎分60〜80回に保ち、イソフルランの投与量を調整して維持します。.
  4. マウスを仰臥位に置きます。切開前につま先をつまんで麻酔の深さを確認します。第2中足骨と第3中足骨の間の位置を特定します。第 2 中足骨と第 3 中足骨の間の真皮から、遠位端から始まり、骨の長さ (~5 mm) に沿って近位に進行するメス切開を行います。
    注:中足骨は足の足首の骨の遠位にあり、遠位指骨の近位に直接続きます。それらは、(内側から外側の)中足骨I、II、III、IV、およびVで構成されています。3番目の中足骨は、後足の掌側の中央にあります。
  5. 鉗子を使用して、皮膚を内側/外側の端に向かって引っ張って手術部位を開きます。まっすぐなVannasハサミを使用して伸筋腱を切除し、第3中足骨を露出させます。
  6. 中足骨ローディングデバイスの中央支点ピンを第3中足骨の下に挿入します。
    1. 最初に、第3中足骨が近位指骨と出会う遠位端の小さなスペースにピンを挿入し、次にピンを近位に移動して、第3中足骨の中央軸に留まるようにします。
    2. 骨とピンの間の直接的なインターフェースを保証するために特別な注意を払ってください(筋肉と顔面を除く)。これは、ローディングプロトコル中の安定したイメージングに不可欠です。
  7. 鉗子で足首を保持し、足をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)充填水浴(8-10 mL)に入れます。足をローディングブラケットで所定の位置に固定し、ブラケットをアクチュエータ/ロードセルの配置に接続します。デバイス内で完了した外科的準備と配置を 図1に示します。

3. イメージング

注:このプロトコルで使用される完全な2光子顕微鏡セットアップには、レーザー用のChameleon Discovery GUI V2.0.6(図2)と顕微鏡用のThorImageLS4.0(図3)の2つのソフトウェアパッケージがあります。2光子でイメージングするには、 Live を押します(図3、青い再生ボタン)。実験を行ってデータを画像化し、保存する場合は、 キャプチャ を押します(図3、上部のタブ、 キャプチャ設定の横のタブ)。これらは、この実験で使用した機器とベンダーに固有のものですが、このプロトコルに必要な仕様(励起波長、表示可能ウィンドウサイズ、画像キャプチャレートなど)を備えた多くの代替手段も機能します。

  1. ローディングデバイスのセットアップをマウスで慎重に持ち上げ、顕微鏡プラットフォームに置きます。
  2. 落射蛍光モードで低倍率対物レンズ(図3、上部のドロップダウンメニューで MultiphotonまたはFluorescence Setupを選択)から始めて、骨の骨幹中央部の位置を特定し、中央に配置します。
  3. 関心領域が特定されたら、より高い水浸対物レンズ倍率(20倍から40倍)に切り替え、光学系を2光子に切り替えます(図3、上部のドロップダウンメニューで [Multiphoton]または[Fluorescence Setup]を選択)。
    注:推奨される視野サイズは、細胞活動に対して少なくとも250μm x 250μmであり、イメージングシステムに応じて光学ズームまたはデジタルズームのいずれかで達成できます。
    1. 適切な最小ピクセル密度は 512 ピクセル x 512 ピクセルです。ピクセル密度を設定するには、 ガルボ/レゾナンスエリアコントロール 設定を使用します(図3)。
    2. ROIを求めるときは、 Power Control オプション(図3)を使用して電力を減らし、 Galvo/Resonance Scanner Control 設定(図3)でPMT増幅を増やすことで、光退色を回避します。
    3. 525 nmを中心とするバンドパスフィルターを使用して、グリーンチャネルの線維性骨膜自家蛍光を探すことにより、2光子モードで骨の表面を特定します。
      注:自家蛍光は、1,000 nmの励起波長で最も顕著ですが、920 nmの励起でも使用できます(図3、 多光子レーザー制御)。このランドマークは、骨細胞を観察するときに中足骨皮質へのROIの相対的な深さを決定するために重要です。時系列実験中、画像化された平面の正確な深さは記録されませんが、15〜30μmの範囲になる傾向があることに注意してください。正確な深度測定が必要な場合は、zスタックを取得する必要があります。
  4. テストローディングバウトを実行して、ローディングデバイス内の外科的準備とポジショニングが安定したROIフィールド(つまり、z平面変位なし)を達成するのに効果的であることを確認します。簡単に言うと、ローディングサイクルを実行して、手術用製剤の安定性を評価します。Matlabコードの Switch on ServoとMove のセクションを実行して、読み込みを実行します。
    1. 小さな風袋荷重を適用します。適切なハバーサイン波ローディングプロトコルが事前に準備されていることを確認してください。セクション1.2のキャリブレーション中に取得した適切な負荷パラメータを入力します。Matlabコードの Switch on ServoとMove のセクションを実行して、読み込みを実行します。
    2. 負荷や呼吸に反応した骨の微小な動きから、画面上に細胞が目に見える動きをしている場合は、y方向またはz方向に沿って異なるROIを選択し、中央の支点ピンの真上になるようにします。動きが続く場合は、第3中足骨の下のピンの外科的位置を手動で調整します。
      注:良好な関心領域(ROI)とは、セルが平面/フォーカスに出入りしない領域です。X方向とY方向の動きは、ImageJのテンプレートマッチングプラグインを使用して後処理用に調整できます。
  5. 実験デザインに従って負荷をかけたz-stackまたはt-Seriesイメージングを行い、それぞれ形態学的または動的負荷によるシグナル伝達イベントを記録します。
    1. 蛍光インジケーターの励起波長を設定します(例:GCaMP6fの場合は920 nm)。z-stackの場合、0.25-1 μmステップなど、骨細胞の特徴をキャプチャするのに十分な低解像度を使用します。tシリーズの場合は、ロードレートの6倍以上をサンプリングする設定を使用します。1 Hzのロードレートの場合、6フレーム/秒(FPS)でのイメージングは、最小の適切なキャプチャレートを表します(図3、ガルボ/レゾナンススキャナー制御)。
    2. ローディングとライブイメージングのために、各試合でロードされていないベースラインデータを収集します。この研究では、60 秒の無負荷イメージングと、それに続く 60 秒のローディングおよびイメージングが好ましい。それに応じてローディングプロトコルとイメージングプロトコルを設計します。データを収集するには、 キャプチャ を押します(図3の上部のタブ、 キャプチャ設定の横)。
      1. 骨細胞における完全なカルシウムシグナル伝達応答の不応期は、約15分28と推定される。動的シグナリングデータを収集するときは、シーケンシャルロードの試合の間に少なくとも同じ時間待ちます。
      2. 実験全体を通して、動物が予期せず麻酔から目覚めたり、介入の機会なしに苦痛を感じたりしないように、動物を放置しないでください。
        注:手順の終了時の安楽死は、子宮頸部脱臼またはその他の適切な手段を介して、IACUCが承認した方法に従って実行する必要があります。これは非生存プロトコルであり、すべての動物がイメージング後に安楽死させることを意味します。

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結果

ここでは、急性期手術用調製物と多光子蛍光イメージングを用いて、 in vivo に埋め込まれた骨細胞におけるカルシウムシグナル伝達を研究する方法論について報告します。緑色蛍光シグナルは、DMP1-Creの発現 を介して 骨細胞の遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターから観察できます。 図4 は、埋め込まれた骨細胞の単?...

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ディスカッション

骨細胞は硬組織マトリックスに埋め込まれた位置にあり、このニッチを取り除くと急速に劣化または脱分化するため、実験的に骨細胞を研究することは困難です。骨細胞の研究は、骨細胞様系統29,30,31の作成、初代骨細胞32,33を分離するためのプロトコ?...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

何一つ。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
#3 Handle scalpelElectron Microscopy Sciences72040-03Surgical supplies
20x Water immersion objectiveOlympusXLUMPLFLN20XWThis is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80120A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit AM Bickford80000An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJThe Jackson Laboratory28865GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJThe Jackson Laboratory23047Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cellFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesiumVWR International21-030-CVIonically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick toolElectron Microscopy SciencesSurgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%Sigma AldrichSIAL-459844-500MLSterilization purposes
Fulcrum pinFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kitFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.717435Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)NIHN/AInstall here https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal Critical Care66794-013-25100% inhalation vapour liquid
Loading bracketFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019aMathWorksFor running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isofluraneButler Schein Animal Health14309Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet2500A Vet
Piezo servo controllerPI-USAE-625Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuatorPI-USAP-602.5SLActuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100Electron Microscopy Sciences72044-10Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mmElectron Microscopy Sciences78326-42Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscopeThorLabsN/AThis is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)CoherentN/AThis system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed. 
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edgeFine Science Tools15018-10Surgical supplies
Water bathFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document

参考文献

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