JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, fare üçüncü metatarsalının doku düzeyinde mekanik yüklenmesine yanıt olarak gömülü osteositlerin mekanik olarak indüklenen kalsiyum sinyalini in vivo gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için intravital bir görüntüleme yaklaşımının gerçekleştirilmesini açıklamaktadır.

Özet

Kemik dokusu, mekanik yük büyüklüğündeki farklılıklara karşı son derece hassastır. Kemik boyunca bir sinsityum oluşturan dendritik hücreler olan osteositler, kemik dokusunun mekanosensoriyel işlevinden sorumludur. Histoloji, matematiksel modelleme, hücre kültürü ve ex vivo kemik organ kültürlerini kullanan çalışmalar, osteosit mekanobiyolojisinin anlaşılmasını büyük ölçüde ilerletmiştir. Bununla birlikte, osteositlerin in vivo moleküler düzeyde mekanik bilgiye nasıl tepki verdiği ve kodladığı konusundaki temel soru iyi anlaşılmamıştır. Osteositlerdeki hücre içi kalsiyum konsantrasyonu dalgalanmaları, akut kemik mekanotransdüksiyon mekanizmaları hakkında daha fazla bilgi edinmek için yararlı bir hedef sunar. Burada, yükleme sırasında osteosit kalsiyum seviyelerini doğrudan tespit etmek için bir in vivo yükleme ve görüntüleme sistemi ile osteositlerde eksprese edilen floresan genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum indikatörü ile bir fare suşunu birleştirerek, in vivo osteosit mekanobiyolojisini incelemek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, iki foton mikroskobu kullanarak osteositlerin floresan olarak belirtilen kalsiyum tepkilerini izlerken, aynı anda canlı farelerin üçüncü metatarsaline iyi tanımlanmış mekanik yükler iletebilen üç noktalı bir bükme cihazı ile elde edilir. Bu teknik, tüm kemik yüklenmesine yanıt olarak osteosit kalsiyum sinyal olaylarının doğrudan in vivo olarak gözlemlenmesine izin verir ve osteosit mekanobiyolojisindeki mekanizmaları ortaya çıkarma çabasında yararlıdır.

Giriş

Kemik matrisi, mekanik talep 1,2'ye göre düzenlenmiştir ve değişen mekanik gereksinimleri(3,4,5) hesaba katmak için dinamik olarak değişebilir. Kemikteki mekanosensoriyel mekanizma ile ilgili ufuk açıcı çalışma, yaklaşık 30 yıl önce bir modelleme makalesi olarak yayınlandı 6,7,8, burada kemik içine gömülü osteositlerin, yerel ortamlarında sıvı hareketi yoluyla doku düzeyinde mekanik deformasyonu algıladıkları öne sürüldü. Bu model, in vitro ve ex vivo deneylerle deneysel olarak doğrulanmıştır, burada osteositlerin oldukça mekanosensitifolduğu 1,2,3,4,5,6 ve ayrıca kemik yapımı osteoblastlarının 7 ve osteoklastların 8,9,10 davranışını yönlendiren sitokinleri eksprese ettiği açıkça gösterilmiştir. 11,12.

Kalsiyum sinyali, osteosit mekanobiyolojisindemerkezi bir figür ve güvenilir bir deneysel hedef olarak kurulmuş, her yerde bulunan ikinci bir habercidir 13,14,15,16. Kalsiyum sinyalizasyonu, hücre biyolojisi17'de geniş çapta incelenme avantajına sahiptir, bu da aşağı akış etkileri ve deneysel gözlem için mevcut olan ilgili floresan araçları hakkında çok şey bilindiği anlamına gelir. İn vitro analizler, osteosit mekanik aktivasyonunu tanımlamak ve dinamik sinyalleme davranışını karakterize etmek için bir araç olarak kalsiyum sinyalizasyonunu kullanmıştır 5,18,19. Dikkat çekici bir şekilde, bir osteosit hücre hattında kalsiyum sinyalinin gözlemlenmesi, hücre süreci boyunca integrin eklerindeki sıvı aktivasyonunun muhtemelen sıvı akışı aktivasyonununana şekli olduğuna dair kesin kanıt sağlamıştır 20. Bu çalışma, kalsiyum sinyalizasyonunun faydasını gösteren birçok çalışmadan biridir. Osteositlerin mekanik aktivasyonu ile güvenilir bir şekilde indüklenir ve bu nedenle osteosit mekanobiyolojisini sorgulamak için güçlü bir hedef olarak hizmet eder.

Osteosit mekanotransdüksiyonu in vivo olarak yakın mikro çevrelerine büyük ölçüde bağımlıdır. Matris bağlayıcı proteinler (örneğin, proteoglikanlar, integrinler), hücrenin sıvı aktivasyonu için kritik olan bir düzenlemede osteosit hücre zarları arasında fonksiyonel bağlar sağlar21,22. İki boyutlu (2D) in vitro analizler yararlı olsa da, bu kritik üç boyutlu (3D) özellikleri içermedikleri için sınırlıdırlar. Konfokal mikroskopi kullanılarak osteosit kalsiyum sinyalinin ex vivo preparatları, çevredeki matrisi sağlam tutarken osteositlerin nasıl tepki verdiğine biraz ışık tutmuştur13,16. Bununla birlikte, kemikten kan akışının çıkarılmasının, lakunokanaliküler sistemin besinlerini ve sıvı dinamiklerini değiştirdiği düşünülmektedir. Osteosit mekanobiyolojisinin sorgulanması, yüke bağlı osteosit sinyalinin in vivo olarak araştırılmasını gerektirir.

Kemikteki gömülü hücrelerin in vivo araştırması, parlak alan ve konfokal mikroskopi gibi geleneksel görüntüleme tekniklerinin sınırlamaları nedeniyle büyük ölçüde engellenmiştir. Osteositler, hidroksiapatit, kollajen tip 1 ve optik erişilebilirliği24 sınırlayan ve in vivo araştırmayı teknik olarak zorlaştıran diğer kollajen olmayan proteinlerden oluşan mineralize bir matris23 içinde konumlandırılır. Bununla birlikte, doğrusal olmayan floresan görüntüleme ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum raportörlerindeki son gelişmeler, bu zorlukların üstesinden gelme fırsatı sunmaktadır.

Burada, hücresel düzeyde çözünürlük25 ile kalsiyum sinyalini ölçmek için osteositleri in vivo görüntüleme yeteneğine sahip yeni bir yaklaşım bildiriyoruz. Bu, fare osteositlerinde ilk kez genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum indikatörü kullanılarak dinamik bir floresan işaretleyici kullanılarak elde edilir. GCaMP6f'nin DMP1-Cre güdümlü osteosit hedefli ekspresyonu olan fareler, farelerin metatarsallarının diyafiz korteksi boyunca osteositlerde görünür floresan sergiler17,26. 250-2.000 με27 arasında fizyolojik gerinim büyüklüğü seviyeleri uygulamak için üç noktalı bir bükme sistemi kullanıyoruz. Bu teknik, tüm kemiğin mekanik yüklenmesi sırasında osteosit kalsiyum sinyal dinamiklerinin in vivo olarak görüntülenmesine izin verir ve osteosit mekanobiyolojisini anlamak isteyen herkes için yararlı olabilir. Bu yöntem, çalışmalarını in vitro analizlerden in vivo uygulamalara genişletmek isteyen araştırmacılar için, özellikle geniş tabanlı fenotipleme çalışmalarının aksine, işlevsel tabanlı moleküler analizleri (yani, kalsiyum sinyali yoluyla hücresel aktiviteyi araştırırken) korumak isteyenler için uygun olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm yöntemler Cornell Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Malzeme ve ekipmanın hazırlanması

  1. Tepegöz çoklu foton mikroskobu ile kullanılmak üzere metatarsal yükleme cihazını tasarlayın ve inşa edin.
    NOT: Bileşen özellikleri ve cihazın çalışması ile ilgili ayrıntılar, önceki bir çalışmanın25 ek belgelerinde açıklanmıştır. Kısaca ana bileşenler, bir yük hücresi ve yükleme braketi, bir su banyosu ve bir dayanak pimi ile seri olarak bir aktüatörden oluşur. Aktüatör ve yük hücresi ticari olarak temin edilebilir ve 300 g'a kadar yükleri barındırabilmelidir. Su banyosu, dayanak pimi ve yük braketi titanyum veya paslanmaz çelikten yapılmalıdır. Şirket içinde veya 3D metal baskı yoluyla ticari olarak üretilebilirler.
  2. Gerinim büyüklüğü değerlerini, bireysel fare grupları (yani cinsiyet, tedavi, genotip) için aktüatör yer değiştirmesine göre önceden kalibre edin. Bu, önceki bir çalışmada özetlenen bir prosedürde yüzey gerinim haritalaması kullanılarak yapılır25.
  3. Osteositlerde floresan kalsiyum indikatör yapılarını eksprese eden 16-18 haftalık C57BL / 6 arka plana sahip fareler kullanın. Osteosit hedefli ekspresyon, flox ile aktive edilen GCaMP6f ve Dmp1-Cre farelerinin çaprazlanmasıyla elde edilir. Kurucu fareler için üreme stratejilerinin ve satıcılarının ayrıntıları daha önce yayınlanmış bir çalışmadaaçıklanmıştır 25.
  4. Tüm cerrahi aletleri, yük braketini, su banyosunu ve dayanak pimini bir otoklav (57,2 °C, 15 psi, 3-4 dakika) kullanarak sterilize edin. Mikroskop objektiflerini %100 etanol ile dezenfekte edin.
  5. Lazer kaynağı, mikroskop, yük hücresi ve aktüatör dahil olmak üzere elektronik bileşenleri açın. İntravital görüntülemeden önce her bileşenin ısınması için 15-20 dakika bekleyin.
    1. Aktüatör ve yük hücresi bileşenlerinin kontrol cihazına bağlı ve etkinleştirildiğinden emin olun. Kullanıcının tercihlerine göre Matlab, LabView ve Python dahil olmak üzere çeşitli platformlarla kontrol yazılımını oluşturun. Bu çalışmada kullanılan ana Matlab kodu Actuator_Control_Software_withLoadCell.m olarak adlandırılır ( MT3 Yükleme Cihazı Kontrolü Software.zip klasörü Ek Dosya 1 içinde).
      NOT: Piyasada bulunan iki fotonlu mikroskop sistemlerinin çoğu sağlam görüntüleme yazılımıyla birlikte gelir. Bu yöntem için gerekli olan temel özellikler, bir lazeri GCaMP6f (920 nm) için uygun uyarmaya ayarlama yeteneği, lazer güç yoğunluğunu ayarlama yeteneği ve en az 6 Hz frekanslı bir zaman serisi koleksiyonudur. Deneyden önce, görüntüleme yazılımına lazer bağlantısı ve iki fotonlu görüntüleme için uygun ışık yolu düzenlemesi doğrulanmalıdır. Bu, görüntüleme kurulumuna bağlı olarak farklı şekillerde onaylanır. Genellikle bir ışıklı gösterge vardır.

2. Ameliyat

  1. Cerrahi bir aşama hazırlayın ve yüzeyi% 70 etanol ile sterilize edin. Cerrahi prosedürler boyunca aseptik tekniklerin kullanıldığından emin olun. Bir terminal prosedürü olduğu için bu protokol için gereken temizlik seviyesini koruyun.
  2. Fareyi, 1 L / dak'lık bir akış hızında tıbbi sınıf hava veya oksijen ile karıştırılmış buharlaştırılmış izofluran ile uyuşturun. % 3 -% 5 izofluran içeren bir kemirgen indüksiyon odasında ilk anesteziyi gerçekleştirin. Cerrahi ve intravital görüntüleme prosedürleri için anestezi bir burun konisinde% 1 -% 2.5 izofluran'da tutun.
  3. Homeostatik çekirdek vücut sıcaklığının korunmasına yardımcı olmak için farenin altına veya yanına bir ısıtma cihazı yerleştirin. Ameliyat boyunca farenin vücut sıcaklığını, kalp atış hızını ve oksijen doygunluğunu izleyin. Nefes hızını dakikada 60-80 nefes arasında tutun ve izofluran dozajını ayarlayarak koruyun.
  4. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Kesiden önce anestezi derinliğini bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın. İkinci ve üçüncü metatarsallar arasındaki yeri belirleyin. İkinci ve üçüncü metatarsallar arasındaki dermis boyunca, distal uçtan başlayarak ve kemiklerin uzunluğu boyunca proksimal olarak ilerleyen (~ 5 mm) bir neşter kesisi yapın.
    NOT: Metatarsallar, pençedeki ayak bileği kemiklerinin distalidir ve distal falanksların doğrudan proksimalini takip eder. Bunlar (medialden laterale) metatarsallar I, II, III, IV ve V'den oluşur. Üçüncü metatarsal, arka pençenin volar yönünün ortasında ortalanmıştır.
  5. Forseps kullanarak cildi medial/lateral kenarlara doğru çekerek ameliyat bölgesini açın. Üçüncü metatarsalı ortaya çıkarmak için düz Vannas makası kullanarak ekstansör tendonları rezeke edin.
  6. Metatarsal yükleme cihazının merkez dayanak pimini üçüncü metatarsın altına yerleştirin.
    1. İlk olarak, pimi üçüncü metatarsalın proksimal falanks ile buluştuğu distal uçtaki küçük boşluğa yerleştirin ve ardından pimi üçüncü metatarsın orta milinde durana kadar proksimal olarak hareket ettirin.
    2. Herhangi bir kas ve yüz bakımı hariç, kemik ve pim arasında doğrudan bir arayüz sağlamak için özel dikkat gösterin. Bu, yükleme protokolleri sırasında kararlı görüntüleme için kritik öneme sahiptir.
  7. Ayak bileğini forseps ile tutun ve ayağınızı Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) dolu su banyosuna (8-10 mL) yerleştirin. Pençeyi yükleme braketi ile yerine sabitleyin ve braketi aktüatör/yük hücresi düzenlemesine bağlayın. Cihaz içinde tamamlanmış bir cerrahi hazırlık ve düzenleme Şekil 1'de gösterilmiştir.

3. Görüntüleme

NOT: Bu protokolde kullanılan tam iki foton mikroskobu kurulumunun iki yazılım paketi vardır: lazer için Chameleon Discovery GUI V2.0.6 (Şekil 2) ve mikroskop için ThorImageLS4.0 (Şekil 3). İki foton üzerinde görüntü almak için Canlı'ya basın (Şekil 3, mavi oynatma düğmesi). Verileri görüntülemek ve kaydetmek için bir deney yaparken, Yakala'ya basın (Şekil 3, en üstteki sekme, Yakalama Ayarı'nın yanında). Bunlar, bu deneyde kullanılan ekipmana ve satıcılara özgüdür, ancak bu protokolde bulunan gerekli özelliklere (uyarma dalga boyları, görüntülenebilir pencere boyutu, görüntü yakalama hızı vb.) sahip birçok alternatif de işe yarayacaktır.

  1. Yükleme cihazı kurulumunu fare ile çok dikkatli bir şekilde alın ve mikroskop platformuna yerleştirin.
  2. Kemiğin orta diyafizini bulmak ve ortalamak için epifloresan modunda düşük büyütme hedefiyle başlayın (Şekil 3, Çoklu Foton veya Floresan Kurulumu seçimlerinin bulunduğu üstteki açılır menü).
  3. İlgilenilen bir bölge bulunduktan sonra, daha yüksek bir suya daldırma objektif büyütmesine (20x-40x) geçin ve optiği iki fotona geçirin (Şekil 3, Çoklu Foton veya Floresan Kurulumu seçimleriyle üstteki açılır menü).
    NOT: Hücresel aktivite için önerilen görüş alanı boyutu en az 250 μm x 250 μm'dir ve görüntüleme sistemine bağlı olarak optik veya dijital yakınlaştırma ile elde edilebilir.
    1. Uygun minimum piksel yoğunluğu 512 piksel x 512 pikseldir. Piksel yoğunluğunu ayarlamak için Galvo/Rezonans Alan Kontrolü ayarlarını kullanın (Şekil 3).
    2. ROI'yi bulurken, Güç Kontrolü seçeneğini (Şekil 3) kullanarak gücü azaltarak ve Galvo/Rezonans Tarayıcı Kontrolü ayarlarında (Şekil 3) PMT amplifikasyonunu artırarak fotoağartmayı önleyin.
    3. 525 nm'de ortalanmış bir bant geçiren filtre kullanan yeşil kanalda fibröz periosteum otofloresansını arayarak iki foton modunda kemiğin yüzeyini tanımlayın.
      NOT: Otofloresan en çok 1.000 nm'deki uyarma dalga boyunda görülebilir, ancak 920 nm uyarmada da mevcuttur (Şekil 3, Çoklu Foton Lazer Kontrolü). Bu dönüm noktası, osteositleri gözlemlerken ROI'nin metatarsal kortekse nispi derinliğini belirlemek için önemlidir. Zaman serisi deneyleri sırasında, görüntülenen düzlemin tam derinliğinin, 15-30 μm arasında değişme eğiliminde olmasına rağmen, kaydedilmediğine dikkat edilmelidir. Kesin derinlik ölçümleri isteniyorsa, bir z-yığını alınması gerekecektir.
  4. Cerrahi hazırlığın ve yükleme cihazı içindeki konumlandırmanın istikrarlı bir ROI alanı elde etmede etkili olduğundan emin olmak için bir test yükleme işlemi yapın (yani, z-düzlemi yer değiştirmesi yok). Kısaca, cerrahi preparatın stabilitesini değerlendirmek için bir yükleme döngüsü çalıştırın. Matlab kodunda Servo Aç ve Hareket Et bölümünü çalıştırarak yüklemeyi gerçekleştirin.
    1. Küçük bir dara yükü uygulayın. Uygun haversine dalga yükleme protokollerinin önceden hazırlandığından emin olun. Bölüm 1.2'de kalibrasyon sırasında elde edilen uygun yükleme parametrelerini girin. Matlab kodunda Servo Aç ve Hareket Et bölümünü çalıştırarak yüklemeyi gerçekleştirin.
    2. Ekrandaki hücrelerin, yüklemeye veya nefes almaya yanıt olarak kemiğin mikro hareketinden kaynaklanan görünür bir hareketi varsa, doğrudan merkez dayanak piminin üzerinde olduğundan emin olmak için y veya z yönleri boyunca farklı bir ROI seçin. Hareket devam ederse, pimin cerrahi pozisyonunu üçüncü metatarsın altında manuel olarak ayarlayın.
      NOT: İyi bir ilgi alanı (ROI), hücrelerin düzleme/odağa girip çıkmadığı bir bölgedir. X ve y yönlerindeki hareket, ImageJ'deki şablon eşleştirme eklentisi kullanılarak son işlem için ayarlanabilir.
  5. Sırasıyla morfometrik veya dinamik yük kaynaklı sinyalleşme olaylarını kaydetmek için deneysel tasarıma göre yükleme ile z-yığını veya t-serisi görüntüleme gerçekleştirin.
    1. Floresan göstergesi için uyarma dalga boyunu ayarlayın (örneğin, GCaMP6f için 920 nm). Z-yığını için, osteositlerin 0,25-1 μm'lik adımlar gibi özelliklerini yakalamak için yeterince düşük bir çözünürlük kullanın. T serisi için, yükleme hızının en az 6 katını örneklemek için ayarları kullanın. 1 Hz yükleme hızı için saniyede 6 kare (FPS) hızında görüntüleme, minimum düzeyde uygun yakalama hızını temsil eder (Şekil 3, Galvo/Rezonans Tarayıcı Kontrolü).
    2. Yükleme ve canlı görüntüleme için, her maçta yüklenmemiş temel verileri toplayın. Bu çalışmada 60 sn yüksüz görüntülemeyi takiben 60 sn yükleme ve görüntüleme tercih edilmiştir. Yükleme ve görüntüleme protokollerini buna göre tasarlayın. Veri toplamak için Yakala'ya basın (Şekil 3, üstte, Yakalama Ayarları'nın yanındaki sekme).
      1. Kemik hücrelerinde tam bir kalsiyum sinyal yanıtı için refrakter sürenin yaklaşık 15 dakika28 olduğu tahmin edilmektedir. Dinamik sinyal verilerini toplarken sıralı yükleme nöbetleri arasında en az bu kadar bekleyin.
      2. Tüm deney boyunca, beklenmedik bir şekilde anesteziden uyanmamasını veya müdahale fırsatı olmadan sıkıntı yaşamamasını sağlamak için hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
        NOT: İşlem sonunda ötenazi, IACUC onaylı yöntemlere uygun olarak servikal çıkık veya diğer uygun önlemlerle yapılmalıdır. Bu, hayatta kalmayan bir protokoldür, yani tüm hayvanlar görüntülemeden sonra ötenazi yapılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada, akut cerrahi hazırlık ve multifoton floresan görüntüleme kullanarak in vivo gömülü osteositlerde kalsiyum sinyalini incelemek için bir metodoloji sunuyoruz. Yeşil floresan sinyali, osteositlerdeki genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinden DMP1-Cre ekspresyonu yoluyla gözlemlenebilir. Şekil 4 , gömülü osteositlerin tek düzlemli bir görüntüsüdür. Tüm hücrelerin etiketlendiğini ve temel yeşil flores...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Osteositleri deneysel olarak incelemek zordur, çünkü bu nişin çıkarılmasından sonra hızla bozuldukları veya farklılaştıkları sert doku matrisindeki gömülü konumlarıdır. Osteositleri araştırmak, son 3 on yılda, osteosit benzeri çizgilerin oluşturulması 29,30,31, primer osteositleri 32,33 izole etmek için protokol...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
#3 Handle scalpelElectron Microscopy Sciences72040-03Surgical supplies
20x Water immersion objectiveOlympusXLUMPLFLN20XWThis is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80120A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit AM Bickford80000An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJThe Jackson Laboratory28865GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJThe Jackson Laboratory23047Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cellFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesiumVWR International21-030-CVIonically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick toolElectron Microscopy SciencesSurgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%Sigma AldrichSIAL-459844-500MLSterilization purposes
Fulcrum pinFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kitFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.717435Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)NIHN/AInstall here https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal Critical Care66794-013-25100% inhalation vapour liquid
Loading bracketFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019aMathWorksFor running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isofluraneButler Schein Animal Health14309Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet2500A Vet
Piezo servo controllerPI-USAE-625Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuatorPI-USAP-602.5SLActuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100Electron Microscopy Sciences72044-10Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mmElectron Microscopy Sciences78326-42Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscopeThorLabsN/AThis is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)CoherentN/AThis system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed. 
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edgeFine Science Tools15018-10Surgical supplies
Water bathFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document

Referanslar

  1. Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid. Bone. 51 (3), 466-473 (2012).
  2. Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).
  3. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).
  4. Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes. Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).
  5. Lu, X. L., Huo, B., Chiang, V., Guo, X. E. Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (3), 563-574 (2012).
  6. Schaffler, M. B., Kennedy, O. D. Osteocyte signaling in bone. Current Osteoporosis Reports. 10 (2), 118-125 (2012).
  7. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/ -Catenin signaling is required for normal bone homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  8. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  9. Kennedy, O. D., et al. Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations. Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).
  10. Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2. Bone. 27 (2), 241-247 (2000).
  11. David, V., et al. Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain. Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).
  12. Davies, C. M., et al. Mechanically loaded ex vivo bone culture system "Zetos": systems and culture preparation. European Cell & Materials. 11, 57-75 (2006).
  13. Adachi, T., et al. Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation. Journal of Biomechanics. 42 (15), 2507-2512 (2009).
  14. Huo, B., Lu, X. L., Guo, X. E. Intercellular calcium wave propagation in linear and circuit-like bone cell networks. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 368 (1912), 617-633 (2010).
  15. Morrell, A. E., et al. Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation. Bone Research. 6, 6(2018).
  16. Jing, D., et al. In situ intracellular calcium oscillations in osteocytes in intact mouse long bones under dynamic mechanical loading. FASEB Journal. 28 (4), 1582-1592 (2014).
  17. Chen, T. -W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  18. Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).
  19. Jing, D., et al. Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid. Bone. 53 (2), 531-540 (2013).
  20. Thi, M. M., Suadicani, S. O., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Mechanosensory responses of osteocytes to physiological forces occur along processes and not cell body and require αVβ3 integrin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21012-21017 (2013).
  21. Wang, Y., McNamara, L. M., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for the role of integrins in flow induced mechanotransduction in osteyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15941-15946 (2007).
  22. McNamara, L. M., Majeska, R. J., Weinbaum, S., Friedrich, V., Schaffler, M. B. Attachment of osteocyte cell processes to the bone matrix. The Anatomical Record. 292 (3), 355-363 (2009).
  23. Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K., Witten, P. E. Buried alive: How osteoblasts become osteocytes. Developmental Dynamics. 235 (1), 176-190 (2005).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  25. Lewis, K. J., et al. Osteocyte calcium signals encode strain magnitude and loading frequency in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11775-11780 (2017).
  26. Lu, Y., et al. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. Journal of Dental Research. 86 (4), 320-325 (2007).
  27. Rubin, C. T., Lanyon, L. E. Dynamic strain similarity in vertebrates; an alternative to allometric limb bone scaling. Journal of Theoretical Biology. 107 (2), 321-327 (1984).
  28. Jacobs, C. R., et al. Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells. Journal of Biomechanics. 31 (11), 969-976 (1998).
  29. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  30. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  31. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  32. vander Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  33. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  34. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 192OsteositlerMekanosensoriyel FonksiyonMekanik Y k B y kl kleriMekanobiyolojiAkut Kemik Mekanotransd ksiyonuGenetik Olarak Kodlanm Kalsiyum ndikat rki Foton Mikroskobun Vivo Y kleme SistemiKemik Doku Mekani iNokta B kme Cihaz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır