Флуоресцентный прижизненный подход к визуализации для изучения индуцированной нагрузкой сигнальной динамики кальция в остеоцитах мышей

Резюме

В настоящей статье описывается применение прижизненной визуализации для наблюдения за механически индуцированной кальциевой сигнализацией встроенных остеоцитов in vivo в режиме реального времени в ответ на механическую нагрузку третьей плюсневой кости мыши на тканевом уровне.

Аннотация

Костная ткань чрезвычайно чувствительна к перепадам величины механической нагрузки. Остеоциты, дендритные клетки, образующие синцитий по всей кости, отвечают за механосенсорную функцию костной ткани. Исследования с использованием гистологии, математического моделирования, клеточных культур и культур костных органов ex vivo значительно продвинули понимание механобиологии остеоцитов. Тем не менее, фундаментальный вопрос о том, как остеоциты реагируют на механическую информацию и кодируют ее на молекулярном уровне in vivo , не совсем понятен. Внутриклеточные колебания концентрации кальция в остеоцитах представляют собой полезную мишень для изучения механизмов острой механотрансдукции костей. В данной работе мы представляем метод изучения механобиологии остеоцитов in vivo, сочетающий линию мышей с флуоресцентно генетически кодируемым индикатором кальция, экспрессируемым в остеоцитах, с системой загрузки и визуализации in vivo для прямого определения уровня кальция в остеоцитах во время нагрузки. Это достигается с помощью устройства с трехточечным изгибом, которое может доставлять четко определенные механические нагрузки на третью плюсневую кость живых мышей при одновременном мониторинге флуоресцентно показанных кальциевых реакций остеоцитов с помощью двухфотонной микроскопии. Этот метод позволяет напрямую in vivo наблюдать за сигнальными событиями кальция в остеоцитах в ответ на нагрузку всей кости и полезен в стремлении выявить механизмы механобиологии остеоцитов.

Введение

Костный матрикс организован в соответствии с механическими требованиями ^1,2 и может динамически изменяться с учетом изменяющихся механических требований ^3,4,5. Основополагающая работа по механосенсорному механизму в кости была опубликована в виде моделирующей статьи около 30 лет назад ^6,7,8, где было высказано предположение, что остеоциты, встроенные в костную ткань, вызывают механическую деформацию через движение жидкости в их локальной среде. Эта модель была проверена экспериментально в экспериментах in vitro и ex vivo, где было ясно показано, что остеоциты довольно механочувствительны ^1,2,3,4,5,6 и также экспрессируют цитокины, которые управляют поведением костеобразующих остеобластов⁷ и остеокластов ^{8,9,10. 11,12}.

Кальциевая сигнализация является вездесущим вторым посредником, который был установлен в качестве центральной фигуры и надежной экспериментальной мишени в механобиологии остеоцитов 13,14,15,16. Кальциевая сигнализация имеет преимущество в том, что она широко изучается в клеточной биологии¹⁷, а это означает, что многое известно о ее побочных эффектах и соответствующих флуоресцентных инструментах, доступных для экспериментального наблюдения. В анализах in vitro передача сигналов кальция использовалась в качестве средства идентификации механической активации остеоцитов и характеристики динамического сигнального поведения ^5,18,19. Следует отметить, что наблюдение за передачей сигналов кальция в клеточной линии остеоцитов предоставило убедительные доказательства того, что активация жидкости в интегриновых соединениях вдоль клеточного процесса, вероятно, является основной^{формой активации} потока жидкости. Это исследование является одним из многих, которые демонстрируют полезность кальциевой сигнализации. Он надежно индуцируется механической активацией остеоцитов и, таким образом, служит мощной мишенью для исследования механобиологии остеоцитов.

Механотрансдукция остеоцитов in vivo сильно зависит от их непосредственного микроокружения. Матрикс-связывающие белки (например, протеогликаны, интегрины) обеспечивают функциональные прикрепления между мембранами остеоцитарных клеток в структуре, которая имеет решающее значение для активации жидкости в клетке^21,22. Несмотря на то, что двумерный (2D) анализ in vitro полезен, он ограничен тем, что не включает в себя эти критически важные трехмерные (3D) особенности. Препараты ex vivo для передачи сигналов кальция остеоцитов с использованием конфокальной микроскопии пролили свет на то, как остеоциты реагируют, сохраняя окружающий матрикс нетронутым^13,16. Тем не менее, считается, что удаление кровоснабжения из костей изменяет питательные вещества и динамику жидкости в лакуноканаликулярной системе. Исследование механобиологии остеоцитов требует исследования in vivo индуцированной нагрузкой передачи сигналов остеоцитов.

Исследование in vivo встроенных клеток в кости в значительной степени затруднено ограничениями традиционных методов визуализации, таких как светлое поле и конфокальная микроскопия. Остеоциты расположены в минерализованном матриксе²³ , состоящем из гидроксиапатита, коллагена типа 1 и других неколлагеновых белков, которые ограничивают оптическую доступность²⁴ и делают исследование in vivo технически сложным. Тем не менее, последние достижения в области нелинейной флуоресцентной визуализации и генетически кодируемых кальциевых репортеров дают возможность преодолеть эти проблемы.

В данной работе мы сообщаем о новом подходе, позволяющем визуализировать остеоциты in vivo для измерения передачи сигналов кальция с разрешением на клеточном уровне²⁵. Это достигается за счет использования динамического флуоресцентного маркера с использованием генетически кодируемого индикатора кальция впервые в остеоцитах мыши. Мыши с DMP1-Cre-управляемой остеоцитами экспрессией GCaMP6f демонстрируют видимую флуоресценцию в остеоцитах по всей диафизарной коре плюсневых костей мышей ^17,26. Мы используем трехточечную систему изгиба для приложения физиологических уровней величины деформации в диапазоне от 250 до 2 000 με²⁷. Этот метод позволяет in vivo визуализировать динамику кальциевой сигнализации остеоцитов во время механической нагрузки на всю кость и может быть полезен всем, кто хочет понять механобиологию остеоцитов. Этот метод будет подходящим для исследователей, стремящихся расширить свою работу от анализа in vitro до приложений in vivo, особенно при сохранении функционального молекулярного анализа (т.е. изучения клеточной активности через передачу сигналов кальция) в отличие от широкомасштабных исследований фенотипирования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все методы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Корнельском университете.

1. Подготовка материалов и оборудования

1. Спроектируйте и изготовьте устройство для загрузки плюсневых костей для использования с накладным многофотонным микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о технических характеристиках компонентов и работе устройства описана в дополнительной документации к предыдущему^{исследованию25}. Вкратце, основные компоненты состоят из последовательного привода с тензодатчиком и нагрузочным кронштейном, водяной бани и штифта точки опоры. Привод и тензодатчик могут быть приобретены в продаже и должны выдерживать нагрузку до 300 g. Водяная баня, штифт опоры и нагрузочный кронштейн должны быть изготовлены из титана или нержавеющей стали. Они могут быть изготовлены на месте или коммерчески с помощью 3D-печати металлом.
2. Заранее откалибруйте значения величины деформации в соответствии со смещением привода для отдельных групп мышей (т.е. пол, лечение, генотип). Это делается с использованием картирования поверхностной деформации в процедуре, описанной в предыдущем исследовании²⁵.
3. Используйте мышей с фоном C57BL/6 в возрасте 16-18 недель, которые экспрессируют флуоресцентные конструкции индикатора кальция в остеоцитах. Целевая экспрессия остеоцитов достигается путем скрещивания активированных флоксом мышей GCaMP6f и Dmp1-Cre. Детали стратегий разведения и поставщиков мышей-основателей описаны в ранее опубликованном исследовании²⁵.
4. Стерилизуйте все хирургические инструменты, загрузочный кронштейн, водяную баню и штифт с помощью автоклава (57,2 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, 3-4 минуты). Продезинфицируйте объективы микроскопа 100% этанолом.
5. Включите электронные компоненты, включая лазерный источник, микроскоп, тензодатчик и привод. Дайте 15-20 минут, чтобы каждый компонент прогрелся перед прижизненной визуализацией.
   1. Убедитесь, что привод и компоненты тензодатчика подключены и активированы в устройстве управления. Создавайте управляющее программное обеспечение с помощью различных платформ, включая Matlab, LabView и Python, в соответствии с предпочтениями пользователя. Основной код Matlab, используемый в этом исследовании, называется Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (в папке Supplementary File 1 Software.zip MT3 Loading Device Control).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство коммерчески доступных двухфотонных микроскопов поставляются с надежным программным обеспечением для визуализации. Ключевыми особенностями, необходимыми для этого метода, являются возможность настройки лазера на соответствующее возбуждение для GCaMP6f (920 нм), возможность регулировки интенсивности мощности лазера и сбор временных рядов с частотой не менее 6 Гц. Перед началом эксперимента необходимо подтвердить подключение лазера к программному обеспечению для визуализации и соответствующее расположение светового тракта для двухфотонной визуализации. Это подтверждается по-разному в зависимости от настройки изображения. Как правило, есть световой индикатор.

2. Хирургия

1. Подготовьте операционный этап и простерилизуйте поверхность с помощью 70% этанола. Убедитесь, что асептические методы используются на протяжении всех хирургических процедур. Поддерживайте уровень чистоты, необходимый для этого протокола, так как это терминальная процедура.
2. Обезболивайте мышь испаренным изофлураном, смешанным с воздухом или кислородом медицинского назначения со скоростью потока 1 л/мин. Первичную анестезию проводят в индукционной камере грызунов с 3%-5% изофлураном. Поддерживайте анестезию на уровне 1%-2,5% изофлурана в носовом конусе для хирургических и прижизненных процедур визуализации.
3. Поместите нагревательное устройство под мышью или рядом с ней, чтобы поддерживать гомеостатическую температуру тела. Следите за температурой тела мыши, частотой сердечных сокращений и насыщением кислородом на протяжении всей операции. Поддерживайте частоту дыхания в пределах 60-80 вдохов в минуту и поддерживайте ее, регулируя дозировку изофлурана.
4. Поместите мышь в положение лежа на спине. Подтвердите глубину анестезии перед разрезом, зажав палец ноги. Определите расположение между второй и третьей плюсневыми костями. Сделайте скальпельный разрез через дерму между второй и третьей плюсневыми костями, начиная с дистального конца и продвигаясь проксимально по длине костей (~5 мм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плюсневые кости находятся дистальнее костей лодыжки на лапе и следуют прямо проксимальнее дистальных фаланг. Они состоят из (медиальной и латеральной) плюсневых костей I, II, III, IV и V. Третья плюсневая кость расположена в центре ладонной стороны задней лапы.
5. С помощью щипцов откройте операционное место, подтягивая кожу к медиальному/латеральному краям. Резецируйте сухожилия разгибателей с помощью прямых ножниц Ваннаса, чтобы обнажить третью плюсневую кость.
6. Вставьте центральный штифт точки опоры устройства для загрузки плюсневых костей под третью плюсневую кость.
   1. Первоначально вставьте штифт в небольшое пространство на дистальном конце, где третья плюсневая кость встречается с проксимальной фалангой, а затем переместите штифт проксимально, пока он не упрется в середину ствола третьей плюсневой кости.
   2. Обратите особое внимание на то, чтобы гарантировать прямое соприкосновение между костью и штифтом, исключая любые мышцы и лицевую поверхность. Это имеет решающее значение для стабильной визуализации во время протоколов загрузки.
7. Удерживайте лодыжку щипцами и поместите стопу в водяную баню, наполненную фосфатно-солевым буфером (DPBS) Дульбекко (8-10 мл). Закрепите лапу на месте с помощью загрузочного кронштейна и подсоедините кронштейн к приводу/тензодатчику. Завершенная хирургическая подготовка и расположение внутри устройства показаны на рисунке 1.

3. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Полная двухфотонная микроскопическая установка, используемая в этом протоколе, включает два пакета программного обеспечения: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 для лазера (рисунок 2) и ThorImageLS4.0 для микроскопа (рисунок 3). Чтобы получить изображение на двухфотонном экране, нажмите кнопку Live (рис. 3, синяя кнопка воспроизведения). При проведении эксперимента по созданию изображений и сохранению данных нажмите кнопку Capture (рисунок 3, вкладка вверху, рядом с Capture Setup). Они специфичны для оборудования и поставщиков, используемых в этом эксперименте, но многие альтернативы с необходимыми спецификациями, найденными в этом протоколе (длины волн возбуждения, размер видимого окна, скорость захвата изображения и т. д.), также могут подойти.

1. Очень аккуратно поднимите настройку загрузочного устройства с помощью мыши и поместите ее на платформу микроскопа.
2. Начните с объектива с малым увеличением в режиме эпифлуоресценции (рис. 3, выпадающее меню вверху с выборами «Мультифотон» или «Настройка флуоресценции»), чтобы найти и центрировать среднюю часть диафиза кости.
3. После того, как интересующая область будет найдена, переключитесь на большее увеличение объектива с погружением в воду (20x-40x) и переключите оптику на двухфотонную (рис. 3, выпадающее меню вверху с выборами Multiphoton или Fluorescence Setup).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый размер поля зрения составляет не менее 250 мкм x 250 мкм для клеточной активности и может быть достигнут с помощью оптического или цифрового зума в зависимости от системы визуализации.
   1. Подходящая минимальная плотность пикселей составляет 512 x 512 пикселей. Чтобы задать плотность пикселей, используйте настройки Galvo/Resonance Area Control (Рисунок 3).
   2. При определении ROI избегайте фотообесцвечивания, уменьшив мощность с помощью опции Power Control (Рисунок 3) и увеличив усиление PMT в настройках Galvo/Resonance Scanner Control (Рисунок 3).
   3. Определите поверхность кости в двухфотонном режиме, найдя автофлуоресценцию фиброзной надкостницы в зеленом канале, в котором используется полосовой фильтр с центром 525 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автофлуоресценция наиболее заметна при длине волны возбуждения на длине волны 1000 нм, но также доступна при возбуждении 920 нм (рис. 3, Управление многофотонным лазером). Этот ориентир важен для определения относительной глубины ROI в кору плюсневых костей при наблюдении за остеоцитами. Следует отметить, что во время экспериментов с временными рядами точная глубина изображенной плоскости не регистрируется, хотя она имеет тенденцию колебаться в пределах 15-30 мкм. Если требуется точное измерение глубины, то необходимо сделать z-стек.
4. Проведите тестовый нагрузочный бой, чтобы убедиться, что хирургическая подготовка и позиционирование внутри нагрузочного устройства эффективны для достижения стабильного поля ROI (т. е. без смещения z-плоскости). Вкратце, запустите цикл нагрузки, чтобы оценить стабильность хирургического препарата. Выполните загрузку, запустив раздел Switch on Servo и Move в коде Matlab.
   1. Приложите небольшую тарную нагрузку. Убедитесь, что соответствующие протоколы нагрузки на волны гаверсинуса подготовлены заранее. Введите соответствующие параметры нагрузки, полученные при калибровке, в разделе 1.2. Выполните загрузку, запустив раздел Switch on Servo и Move в коде Matlab.
   2. Если на экране есть видимое движение клеток, которое происходит в результате микродвижения кости в ответ на нагрузку или дыхание, выберите другой ROI вдоль направления y или z, чтобы убедиться, что он находится прямо над центральным штифтом точки опоры. Если движение не прекращается, отрегулируйте хирургическое положение штифта вручную под третьей плюсневой костью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая область интереса (ROI) — это та, в которой ячейки не перемещаются внутрь и из плоскости/фокуса. Движение по осям X и Y можно настроить для постобработки с помощью плагина сопоставления шаблонов в ImageJ.
5. Проведение визуализации z-stack или t-серии с нагрузкой в соответствии с экспериментальным дизайном для регистрации морфометрических или динамических сигнальных событий, вызванных нагрузкой, соответственно.
   1. Установите длину волны возбуждения для флуоресцентного индикатора (например, 920 нм для GCaMP6f). Для z-стека используйте достаточно низкое разрешение, чтобы захватить особенности остеоцитов, такие как шаг 0,25-1 мкм. Для серии t используйте настройки для выборки как минимум в 6 раз больше скорости загрузки. При скорости загрузки 1 Гц изображение с частотой 6 кадров в секунду (FPS) представляет собой минимально подходящую скорость захвата (рис. 3, Управление гальво/резонансным сканером).
   2. Для загрузки и визуализации в реальном времени собирайте незагруженные исходные данные после каждого боя. В данном исследовании предпочтение отдается 60 с визуализации без нагрузки с последующей нагрузкой и визуализацией в течение 60 с. Разработайте соответствующие протоколы загрузки и визуализации. Чтобы собрать данные, нажмите кнопку Capture (рисунок 3, вкладка вверху, рядом с Capture Setup).
      1. Рефрактерный период для полного сигнального ответа кальция в костных клетках оценивается примерно в 15 минут²⁸ минут. Подождите как минимум столько времени между последовательными загрузками при сборе данных динамической сигнализации.
      2. На протяжении всего эксперимента не оставляйте животное без присмотра, чтобы оно неожиданно не проснулось от наркоза или не испытало дистресс без возможности вмешательства.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия в конце процедуры должна быть выполнена путем вывиха шейки матки или других соответствующих мер в соответствии с методами, одобренными IACUC. Это протокол, не связанный с выживанием, что означает, что все животные усыпляются после визуализации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В данной статье мы представляем методологию изучения кальциевой сигнализации во встроенных остеоцитах in vivo с использованием острой хирургической подготовки и многофотонной флуоресцентной визуализации. Зеленый флуоресцентный сигнал можно наблюдать по генети?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Экспериментальное изучение остеоцитов затруднено из-за их встроенного положения в матриксе твердых тканей, до которого они быстро разрушаются или дедифференцируются при удалении этой ниши. Исследование остеоцитов потребовало огромной изобретательности в течение ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Handle scalpel	Electron Microscopy Sciences	72040-03	Surgical supplies
20x Water immersion objective	Olympus	XLUMPLFLN20XW	This is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIR	AM Bickford	80120	A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit	AM Bickford	80000	An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJ	The Jackson Laboratory	28865	GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJ	The Jackson Laboratory	23047	Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cell	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	905898	LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesium	VWR International	21-030-CV	Ionically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick tool	Electron Microscopy Sciences		Surgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%	Sigma Aldrich	SIAL-459844-500ML	Sterilization purposes
Fulcrum pin	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kit	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	717435	Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)	NIH	N/A	Install here https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-013-25	100% inhalation vapour liquid
Loading bracket	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019a	MathWorks		For running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isoflurane	Butler Schein Animal Health	14309	Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet		2500A Vet
Piezo servo controller	PI-USA	E-625	Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuator	PI-USA	P-602.5SL	Actuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100	Electron Microscopy Sciences	72044-10	Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mm	Electron Microscopy Sciences	78326-42	Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscope	ThorLabs	N/A	This is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)	Coherent	N/A	This system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed.
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edge	Fine Science Tools	15018-10	Surgical supplies
Water bath	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document