Une approche d’imagerie intravitale fluorescente pour étudier la dynamique de la signalisation calcique induite par la charge dans les ostéocytes de souris

Résumé

Le présent article décrit la mise en œuvre d’une approche d’imagerie intravitale pour observer la signalisation calcique induite mécaniquement des ostéocytes intégrés in vivo en temps réel en réponse à la charge mécanique au niveau tissulaire du troisième métatarsien de souris.

Résumé

Le tissu osseux est extrêmement sensible aux différences d’amplitude de charge mécanique. Les ostéocytes, cellules dendritiques qui forment un syncytium dans tout l’os, sont responsables de la fonction mécanosensorielle du tissu osseux. Des études utilisant l’histologie, la modélisation mathématique, la culture cellulaire et les cultures d’organes osseux ex vivo ont considérablement fait progresser la compréhension de la mécanobiologie des ostéocytes. Cependant, la question fondamentale de la réponse et de l’encodage des informations mécaniques au niveau moléculaire in vivo n’est pas bien comprise. Les fluctuations de la concentration intracellulaire de calcium dans les ostéocytes offrent une cible utile pour en savoir plus sur les mécanismes de mécanotransduction osseuse aiguë. Ici, nous rapportons une méthode d’étude de la mécanobiologie des ostéocytes in vivo, combinant une souche de souris avec un indicateur de calcium génétiquement codé par fluorescence exprimé dans les ostéocytes avec un système de chargement et d’imagerie in vivo pour détecter directement les niveaux de calcium des ostéocytes pendant le chargement. Ceci est réalisé avec un dispositif de flexion à trois points qui peut fournir des charges mécaniques bien définies au troisième métatarsien de souris vivantes tout en surveillant simultanément les réponses calciques indiquées par fluorescence des ostéocytes à l’aide de la microscopie à deux photons. Cette technique permet l’observation directe in vivo des événements de signalisation calcique des ostéocytes en réponse à la charge osseuse entière et est utile dans le but de révéler les mécanismes de la mécanobiologie des ostéocytes.

Introduction

La matrice osseuse est organisée en fonction de la demande mécanique^1,2 et peut changer dynamiquement pour tenir compte des exigences mécaniques changeantes ^3,4,5. Des travaux fondamentaux concernant le mécanisme mécanosensoriel dans l’os ont été publiés sous forme d’article de modélisation il y a environ 30 ans ^6,7,8, où il a été proposé que les ostéocytes intégrés dans l’os détectent la déformation mécanique au niveau du tissu via le mouvement des fluides dans leur environnement local. Ce modèle a été validé expérimentalement avec des expériences in vitro et ex vivo, où il a été clairement démontré que les ostéocytes sont assez mécanosensibles 1,2,3,4,5,6 et expriment également des cytokines, qui dirigent le comportement des ostéoblastes de construction osseuse 7 et des ostéoclastes ^{8,9,10, 11 et 12}.

La signalisation calcique est un second messager omniprésent qui a été établi comme une figure centrale et une cible expérimentale fiable en mécanobiologie ostéocytaire 13,14,15,16. La signalisation calcique a l’avantage d’être largement étudiée en biologie cellulaire¹⁷, ce qui signifie que l’on sait beaucoup de choses sur ses effets en aval et les outils fluorescents correspondants disponibles pour l’observation expérimentale. Des analyses in vitro ont utilisé la signalisation calcique comme moyen d’identifier l’activation mécanique des ostéocytes et de caractériser le comportement de signalisation dynamique ^5,18,19. Il convient de noter que l’observation de la signalisation calcique dans une lignée cellulaire d’ostéocytes a fourni des preuves définitives que l’activation liquidienne au niveau des attaches d’intégrine le long du processus cellulaire est probablement la principale forme d’activation de l’écoulement liquidien²⁰. Cette étude est l’une des nombreuses qui mettent en évidence l’utilité de la signalisation calcique. Il est induit de manière fiable par l’activation mécanique des ostéocytes et sert donc de cible puissante pour interroger la mécanobiologie des ostéocytes.

La mécanotransduction des ostéocytes in vivo dépend fortement de leur microenvironnement immédiat. Les protéines de liaison matricielle (par exemple, les protéoglycanes, les intégrines) fournissent des attaches fonctionnelles entre les membranes cellulaires ostéocytaires dans un arrangement qui est essentiel pour l’activation liquidienne de la cellule^21,22. Bien que les analyses in vitro bidimensionnelles (2D) soient utiles, elles sont limitées en ce sens qu’elles n’intègrent pas ces caractéristiques tridimensionnelles (3D) critiques. Des préparations ex vivo de la signalisation calcique ostéocytaire à l’aide de la microscopie confocale ont mis en lumière la façon dont les ostéocytes réagissent tout en gardant la matrice environnante intacte^13,16. Cependant, on pense que l’élimination de l’apport sanguin de l’os modifie les nutriments et la dynamique des fluides du système lacunocanaliculaire. L’interrogation de la mécanobiologie ostéocytaire nécessite l’étude in vivo de la signalisation ostéocytaire induite par la charge.

L’étude in vivo des cellules intégrées dans l’os a été largement entravée par les limites des techniques d’imagerie traditionnelles, telles que le fond clair et la microscopie confocale. Les ostéocytes sont positionnés dans une matrice minéralisée²³ composée d’hydroxyapatite, de collagène de type 1 et d’autres protéines non collagéniques qui limitent l’accessibilité optique²⁴ et rendent l’investigation in vivo techniquement difficile. Cependant, les progrès récents de l’imagerie fluorescente non linéaire et des rapporteurs calciques génétiquement codés offrent la possibilité de surmonter ces défis.

Ici, nous rapportons une nouvelle approche avec la capacité d’imager les ostéocytes in vivo pour mesurer la signalisation calcique avec une résolution de²⁵ au niveau cellulaire. Ceci est réalisé en utilisant un marqueur fluorescent dynamique utilisant pour la première fois un indicateur de calcium génétiquement codé dans des ostéocytes de souris. Les souris dont l’expression de GCaMP6f est ciblée sur les ostéocytes par DMP1-Cre présentent une fluorescence visible dans les ostéocytes dans tout le cortex diaphysaire des métatarses de souris^17,26. Nous utilisons un système de flexion en trois points afin d’appliquer des niveaux physiologiques d’amplitude de déformation entre 250 et 2 000 με²⁷. Cette technique permet de visualiser in vivo la dynamique de signalisation calcique des ostéocytes lors du chargement mécanique de l’os entier et pourrait être utile à toute personne cherchant à comprendre la mécanobiologie des ostéocytes. Cette méthode conviendrait aux chercheurs qui cherchent à étendre leurs travaux des analyses in vitro aux applications in vivo, en particulier tout en conservant les analyses moléculaires fonctionnelles (c’est-à-dire l’étude de l’activité cellulaire par la signalisation calcique) par opposition aux études de phénotypage à grande échelle.

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Protocole

Toutes les méthodes ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Cornell.

1. Préparation des matériaux et des équipements

1. Concevoir et construire le dispositif de charge métatarsienne pour une utilisation avec un microscope multiphotonique aérien.
   REMARQUE : Les détails des spécifications des composants et du fonctionnement de l’appareil sont décrits dans la documentation supplémentaire d’une étude précédente²⁵. En bref, les principaux composants se composent d’un actionneur en série avec un capteur de charge et un support de charge, d’un bain-marie et d’une goupille d’appui. L’actionneur et le capteur de pesage peuvent être obtenus dans le commerce et doivent être capables de supporter des charges allant jusqu’à 300 g. Le bain-marie, la goupille d’appui et le support de charge doivent être en titane ou en acier inoxydable. Ils peuvent être fabriqués en interne ou commercialement via l’impression 3D métal.
2. Calibrez à l’avance les valeurs de l’amplitude de la déformation en fonction du déplacement de l’actionneur pour des groupes de souris individuels (c’est-à-dire le sexe, le traitement, le génotype). Cela se fait à l’aide d’une cartographie de la déformation de surface selon une procédure décrite dans une étude précédente²⁵.
3. Utilisez des souris avec un fond C57BL/6, âgées de 16 à 18 semaines, qui expriment des constructions indicatrices de calcium fluorescentes dans les ostéocytes. L’expression ciblée des ostéocytes est obtenue en croisant des souris GCaMP6f et Dmp1-Cre activées par flox. Les détails des stratégies de reproduction et des fournisseurs de souris fondatrices sont décrits dans une étude publiée précédemment²⁵.
4. Stérilisez tous les outils chirurgicaux, le support de charge, le bain-marie et la goupille d’appui à l’aide d’un autoclave (57,2 °C, 15 psi, 3-4 min). Désinfectez les objectifs de microscope avec de l’éthanol à 100 %.
5. Allumez les composants électroniques, notamment la source laser, le microscope, la cellule de charge et l’actionneur. Attendez 15 à 20 minutes pour que chaque composant se réchauffe avant l’imagerie intravitale.
   1. Assurez-vous que les composants de l’actionneur et du capteur de pesage sont connectés et activés dans l’appareil de commande. Générez le logiciel de contrôle avec une variété de plates-formes, notamment Matlab, LabView et Python, selon les préférences de l’utilisateur. Le code Matlab principal utilisé dans cette étude s’appelle Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (à l’intérieur du dossier MT3 Loading Device Control Software.zip Supplementary File 1).
      REMARQUE : La plupart des systèmes de microscope à deux photons disponibles dans le commerce sont équipés d’un logiciel d’imagerie robuste. Les principales caractéristiques requises pour cette méthode sont la capacité de régler un laser sur l’excitation appropriée pour GCaMP6f (920 nm), la capacité d’ajuster l’intensité de la puissance laser et une collection de séries chronologiques avec une fréquence d’au moins 6 Hz. Avant l’expérimentation, la connexion du laser au logiciel d’imagerie et la disposition appropriée du chemin lumineux pour l’imagerie à deux photons doivent être confirmées. Ceci est confirmé de différentes manières selon la configuration d’imagerie. Habituellement, il y a un indicateur lumineux.

2. Chirurgie

1. Préparez une étape chirurgicale et stérilisez la surface avec de l’éthanol à 70 %. S’assurer que des techniques aseptiques sont employées tout au long des interventions chirurgicales. Maintenez le niveau de propreté requis pour ce protocole, car il s’agit d’une procédure terminale.
2. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane vaporisé mélangé à de l’air ou de l’oxygène de qualité médicale à un débit de 1 L/min. Effectuer l’anesthésie initiale dans une chambre d’induction de rongeurs avec 3 à 5 % d’isoflurane. Maintenir l’anesthésie à 1 % à 2,5 % d’isoflurane dans un cône nasal pour les procédures d’imagerie chirurgicales et intravitales.
3. Placez un appareil chauffant sous ou à côté de la souris pour aider à maintenir la température corporelle centrale homéostatique. Surveillez la température corporelle de la souris, son rythme cardiaque et sa saturation en oxygène tout au long de la chirurgie. Maintenez le rythme respiratoire entre 60 et 80 respirations par minute et maintenez-le en ajustant la dose d’isoflurane.
4. Placez la souris en position couchée. Confirmez la profondeur de l’anesthésie avant l’incision par un pincement des orteils. Identifiez l’emplacement entre le deuxième et le troisième métatarsien. Faites une incision au scalpel à travers le derme entre le deuxième et le troisième métatarsien, en commençant par l’extrémité distale et en progressant proximale sur toute la longueur des os (~5 mm).
   REMARQUE : Les métatarses sont distaux par rapport aux os de la cheville sur la patte et suivent directement proximal les phalanges distales. Ils sont constitués des métatarses I, II, III, IV et V (médiaux à latéraux). Le troisième métatarsien est centré au milieu de la face palmaire de la patte arrière.
5. À l’aide d’une pince, ouvrez le site chirurgical en tirant la peau vers les bords médiaux/latéraux. Réséquez les tendons extenseurs à l’aide de ciseaux Vannas droits pour exposer le troisième métatarsien.
6. Insérez la goupille centrale du dispositif de charge métatarsien sous le troisième métatarsien.
   1. Dans un premier temps, insérez la goupille dans le petit espace à l’extrémité distale où le troisième métatarsien rencontre la phalange proximale, puis déplacez la goupille vers la proximale jusqu’à ce qu’elle repose au milieu de la tige du troisième métatarsien.
   2. Veillez tout particulièrement à garantir une interface directe entre l’os et l’axe, à l’exclusion de tout muscle et facia. Ceci est essentiel pour une imagerie stable pendant les protocoles de chargement.
7. Tenez la cheville à l’aide d’une pince et placez le pied dans le bain-marie rempli de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco (8-10 ml). Fixez la patte en place avec le support de chargement et connectez le support à l’arrangement actionneur/cellule de charge. La figure 1 montre une préparation chirurgicale complète et un arrangement à l’intérieur de l’appareil.

3. Imagerie

REMARQUE : La configuration complète de la microscopie à deux photons utilisée dans ce protocole comporte deux progiciels : Chameleon Discovery GUI V2.0.6 pour le laser (Figure 2) et ThorImageLS4.0 pour le microscope (Figure 3). Pour obtenir une image sur le photon à deux photons, appuyez sur Live (Figure 3, bouton de lecture bleu). Lorsque vous effectuez une expérience pour imager et enregistrer des données, appuyez sur Capture (Figure 3, onglet en haut, en regard de Configuration de la capture). Celles-ci sont spécifiques à l’équipement et aux fournisseurs utilisés dans cette expérience, mais de nombreuses alternatives avec les spécifications nécessaires trouvées dans ce protocole (longueurs d’onde d’excitation, taille de la fenêtre visible, taux de capture d’image, etc.) fonctionneraient également.

1. Prenez très soigneusement le dispositif de chargement configuré avec la souris et placez-le sur la plate-forme du microscope.
2. Commencez avec un objectif à faible grossissement en mode épifluorescence (Figure 3, menu déroulant en haut avec les sélections Multiphoton ou Configuration de fluorescence) pour localiser et centrer la diaphyse moyenne de l’os.
3. Une fois qu’une région d’intérêt est localisée, passez à un grossissement d’objectif d’immersion dans l’eau plus élevé (20x-40x) et basculez l’optique à deux photons (Figure 3, menu déroulant en haut avec les sélections Configuration multiphotonique ou Fluorescence).
   REMARQUE : La taille recommandée du champ de vision est d’au moins 250 μm x 250 μm pour l’activité cellulaire et peut être obtenue avec un zoom optique ou numérique selon le système d’imagerie.
   1. La densité de pixels minimale appropriée est de 512 pixels x 512 pixels. Pour définir la densité de pixels, utilisez les paramètres Galvo/Resonance Area Control (Figure 3).
   2. Lorsque vous trouvez le retour sur investissement, évitez le photoblanchiment en réduisant la puissance à l’aide de l’option de contrôle de puissance (Figure 3) et en augmentant l’amplification PMT dans les paramètres de contrôle du scanner Galvo/Résonance (Figure 3).
   3. Identifiez la surface de l’os en mode biphoton en recherchant l’autofluorescence du périoste fibreux dans le canal vert qui utilise un filtre passe-bande centré à 525 nm.
      REMARQUE : L’autofluorescence est plus visible avec la longueur d’onde d’excitation à 1 000 nm, mais elle est également disponible à une excitation à 920 nm (Figure 3, Contrôle laser multiphotonique). Ce repère est important pour déterminer la profondeur relative du ROI dans le cortex métatarsien lors de l’observation des ostéocytes. Il convient de noter que lors d’expériences de séries chronologiques, la profondeur exacte du plan imagé n’est pas enregistrée, bien qu’elle ait tendance à se situer entre 15 et 30 μm. Si des mesures de profondeur exactes sont souhaitées, une pile z devrait être prise.
4. Effectuez un test de chargement pour vous assurer que la préparation chirurgicale et le positionnement dans le dispositif de chargement étaient efficaces pour obtenir un champ de retour sur investissement stable (c’est-à-dire aucun déplacement du plan z). Brièvement, exécutez un cycle de chargement pour évaluer la stabilité de la préparation chirurgicale. Effectuez le chargement en exécutant la section Switch on Servo et Move dans le code Matlab.
   1. Appliquez une petite charge de tare. Assurez-vous que les protocoles appropriés de chargement par vagues de haversine sont préparés à l’avance. Entrez les paramètres de charge appropriés obtenus lors de l’étalonnage au point 1.2. Effectuez le chargement en exécutant la section Switch on Servo et Move dans le code Matlab.
   2. S’il y a un mouvement visible des cellules à l’écran, qui provient du micromouvement de l’os en réponse à la charge ou à la respiration, sélectionnez un retour d’intérêt différent le long des directions y ou z pour vous assurer qu’il se trouve directement au-dessus de la goupille du point d’appui central. Si le mouvement persiste, ajustez manuellement la position chirurgicale de la broche sous le troisième métatarsien.
      REMARQUE : Une bonne région d’intérêt (ROI) est une région où les cellules ne se déplacent pas dans et hors du plan/foyer. Le mouvement dans les directions x et y peut être ajusté pour le post-traitement à l’aide du plugin de correspondance de modèle sur ImageJ.
5. Effectuer une imagerie de la pile z ou de la série t avec charge selon le plan expérimental pour enregistrer les événements de signalisation morphométriques ou dynamiques induits par la charge, respectivement.
   1. Réglez la longueur d’onde d’excitation de l’indicateur fluorescent (par exemple, 920 nm pour GCaMP6f). Pour z-stack, utilisez une résolution suffisamment faible pour capturer les caractéristiques des ostéocytes, telles que des pas de 0,25 à 1 μm. Pour la série t, utilisez les paramètres pour échantillonner au moins 6 fois le taux de chargement. Pour un taux de charge de 1 Hz, l’imagerie à 6 images par seconde (FPS) représente le taux de capture minimal approprié (Figure 3, Galvo/Resonance Scanner Control).
   2. Pour le chargement et l’imagerie en direct, collectez les données de référence non chargées à chaque épisode. Dans cette étude, il est préférable de préférer 60 s d’imagerie non chargée suivie de 60 s de charge et d’imagerie. Concevez les protocoles de chargement et d’imagerie en conséquence. Pour collecter des données, appuyez sur Capture (Figure 3, onglet en haut, en regard de Configuration de la capture).
      1. La période réfractaire pour une réponse de signalisation calcique complète dans les cellules osseuses est estimée à environ 15 min²⁸. Attendez au moins autant entre les épisodes de chargement séquentiel lors de la collecte de données de signalisation dynamique.
      2. Tout au long de l’expérience, ne laissez pas l’animal sans surveillance pour vous assurer qu’il ne se réveille pas de manière inattendue après l’anesthésie ou qu’il ne ressente pas de détresse sans possibilité d’intervention.
         REMARQUE : L’euthanasie à la fin de la procédure doit être effectuée par luxation cervicale ou d’autres mesures appropriées conformément aux méthodes approuvées par l’IACUC. Il s’agit d’un protocole de non-survie, ce qui signifie que tous les animaux sont euthanasiés après l’imagerie.

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Résultats

Nous présentons ici une méthodologie pour étudier la signalisation calcique dans les ostéocytes intégrés in vivo à l’aide d’une préparation chirurgicale aiguë et de l’imagerie fluorescente multiphotonique. Un signal fluorescent vert peut être observé à partir d’indicateurs calciques génétiquement codés dans les ostéocytes via l’expression de DMP1-Cre. La figure 4 est une image monoplane d’ostéocytes intégrés. ...

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Discussion

Il est difficile d’étudier expérimentalement les ostéocytes en raison de leur position intégrée dans la matrice des tissus durs, vers laquelle ils se détériorent ou se dédifférencient rapidement lors de l’élimination de cette niche. La recherche sur les ostéocytes a nécessité une immense ingéniosité au cours des 3 dernières décennies, comme la création de lignées de type ostéocytes^29,30,31

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Handle scalpel	Electron Microscopy Sciences	72040-03	Surgical supplies
20x Water immersion objective	Olympus	XLUMPLFLN20XW	This is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIR	AM Bickford	80120	A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit	AM Bickford	80000	An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJ	The Jackson Laboratory	28865	GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJ	The Jackson Laboratory	23047	Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cell	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	905898	LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesium	VWR International	21-030-CV	Ionically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick tool	Electron Microscopy Sciences		Surgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%	Sigma Aldrich	SIAL-459844-500ML	Sterilization purposes
Fulcrum pin	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kit	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	717435	Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)	NIH	N/A	Install here https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-013-25	100% inhalation vapour liquid
Loading bracket	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019a	MathWorks		For running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isoflurane	Butler Schein Animal Health	14309	Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet		2500A Vet
Piezo servo controller	PI-USA	E-625	Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuator	PI-USA	P-602.5SL	Actuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100	Electron Microscopy Sciences	72044-10	Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mm	Electron Microscopy Sciences	78326-42	Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscope	ThorLabs	N/A	This is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)	Coherent	N/A	This system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed.
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edge	Fine Science Tools	15018-10	Surgical supplies
Water bath	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document