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요약

현재 논문에서는 마우스 세 번째 중족골의 조직 수준 기계적 부하에 대한 반응으로 생체 내에서 내장된 골세포의 기계적으로 유도된 칼슘 신호를 실시간으로 관찰하기 위해 생체 내 이미징 접근 방식을 수행하는 방법을 설명합니다.

초록

뼈 조직은 기계적 하중 크기의 차이에 매우 민감합니다. 뼈 전체에 세포융합을 형성하는 수지상 세포인 골세포(osteocyte)는 뼈 조직의 기계 감각 기능을 담당합니다. 조직학, 수학적 모델링, 세포 배양 및 생체 외 뼈 장기 배양을 사용하는 연구는 골세포 기계생물학에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다. 그러나 골세포가 생체 내 분자 수준에서 기계적 정보에 어떻게 반응하고 인코딩하는지에 대한 근본적인 질문은 잘 이해되지 않았습니다. 골세포의 세포 내 칼슘 농도 변동은 급성 뼈 기계 전달 메커니즘에 대해 더 많이 배울 수 있는 유용한 표적을 제공합니다. 여기에서는 골세포에서 발현되는 형광 유전자 인코딩 칼슘 지표와 마우스 균주를 in vivo loading and imaging system과 결합하여 로딩 중 골세포 칼슘 수치를 직접 감지하는 in vivo osteocyte mechanobiology를 연구하는 방법을 보고합니다. 이는 살아있는 마우스의 제3 중족골에 잘 정의된 기계적 부하를 전달하는 동시에 이광자 현미경을 사용하여 골세포의 형광 지시 칼슘 반응을 모니터링할 수 있는 3점 굽힘 장치를 통해 달성됩니다. 이 기술은 전체 뼈 부하에 대한 반응으로 골세포 칼슘 신호 전달 이벤트를 직접 생체 내에서 관찰할 수 있게 해주며 골세포 기계생물학에서 메커니즘을 밝히려는 노력에 유용합니다.

서문

뼈 매트릭스는 기계적 요구량 1,2에 따라 조직되어 있으며 기계적 요구 사항의 변화 3,4,5를 고려하여 동적으로 변화할 수 있습니다. 뼈의 기계감각 메커니즘에 관한 획기적인 연구는 약 30년 전에 모델링 논문으로 발표되었으며, 6,7,8 뼈 내에 내장된 골세포는 국소 환경에서 유체 이동을 통해 조직 수준의 기계적 변형을 감지한다고 제안되었습니다. 이 모델은 시험관 내 및 생체 외 실험을 통해 실험적으로 검증되었으며, 여기서 골세포는 매우 기계적으로 민감하며(1,2,3,4,5,6) 뼈를 형성하는 조골세포(osteoblasts) 7 및 파골세포(osteoclast) 8,9,10의 거동을 지시하는 사이토카인(cytokine)도 발현한다는 것이 명확하게 밝혀졌습니다. 11,12.

칼슘 신호전달(calcium signaling)은 골세포 기계생물학(osteocyte mechanobiology)에서 중심적이고 신뢰할 수 있는 실험 표적으로 확립된 유비쿼터스 제2의 메신저입니다 13,14,15,16. 칼슘 신호전달은 세포 생물학17에서 널리 연구되고 있다는 장점이 있는데, 이는 칼슘 신호전달의 다운스트림 효과와 실험적 관찰에 사용할 수 있는 해당 형광 도구에 대해 많이 알려져 있다는 것을 의미합니다. 체외 분석은 골세포의 기계적 활성화를 확인하고 동적 신호 전달 행동을 특성화하는 수단으로 칼슘 신호를 사용했습니다 5,18,19. 주목할 점은 골세포 세포주에서 칼슘 신호전달을 관찰한 결과, 세포 돌기를 따라 인테그린 부착부(integrin attachments)에서 이루어지는 유체 활성화(fluid activation)가 유체 흐름 활성화(fluid flow activation)의 주요 형태일 가능성이 높다는 결정적인 증거를 제공했다는 것입니다20. 이 연구는 칼슘 신호의 유용성을 보여주는 많은 연구 중 하나입니다. 이는 골세포의 기계적 활성화로 안정적으로 유도되므로 골세포 기계생물학을 조사하기 위한 강력한 표적 역할을 합니다.

in vivo에서 골세포 메카노트랜스덕션은 즉각적인 미세환경에 크게 의존합니다. 기질 결합 단백질(예: 프로테오글리칸, 인테그린)은 세포의 유체 활성화에 중요한 배열로 골세포 세포막 사이에 기능적 부착을 제공합니다21,22. 2차원(2D) 체외 분석은 유용하지만 이러한 중요한 3차원(3D) 기능을 통합하지 않는다는 점에서 제한적입니다. 컨포칼 현미경을 이용한 골세포 칼슘 신호전달의 체외 제제는 주변 기질을 그대로 유지하면서 골세포가 어떻게 반응하는지에 대한 실마리를 제공했다13,16. 그러나 뼈에서 혈액 공급을 제거하면 lacunocanalicular system의 영양분과 유체 역학이 변하는 것으로 생각됩니다. 골세포 기계생물학에 대한 조사는 부하 유도 골세포 신호에 대한 생체 내 조사가 필요합니다.

뼈에 내장된 세포에 대한 생체 내 조사는 명시야 및 컨포칼 현미경과 같은 기존 이미징 기술의 한계로 인해 크게 방해를 받았습니다. 골세포는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 콜라겐 타입 1(collagen type 1) 및 기타 비콜라겐성 단백질로 구성된 광물화된 매트릭스(23)에 위치하며, 이는 광학적 접근성(24)을 제한하고 생체 내 연구를 기술적으로 어렵게 만듭니다. 그러나 최근 비선형 형광 이미징과 유전적으로 암호화된 칼슘 리포터의 발전은 이러한 문제를 극복할 수 있는 기회를 제공합니다.

여기에서는 세포 수준 해상도25로 칼슘 신호를 측정하기 위해 in vivo에서 골세포를 이미지화할 수 있는 새로운 접근 방식을 보고합니다. 이는 마우스 골세포에서 처음으로 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하는 동적 형광 마커를 사용하여 달성됩니다. DMP1-Cre 주도 골세포 표적 GCaMP6f 발현을 가진 마우스는 마우스 중족골 세포의 diaphyseal 피질 전반에 걸쳐 골세포에서 가시적 형광을 나타냅니다17,26. 우리는 250-2,000 με27 사이의 변형 크기의 생리학적 수준을 적용하기 위해 3점 굽힘 시스템을 사용합니다. 이 기술은 전체 뼈의 기계적 하중 동안 골세포 칼슘 신호 역학의 생체 내 시각화를 가능하게 하며 골세포 기계생물학을 이해하고자 하는 모든 사람에게 유용할 수 있습니다. 이 방법은 특히 광범위한 표현형 연구와 달리 기능 기반 분자 분석(즉, 칼슘 신호 전달을 통한 세포 활성 조사)을 유지하면서 체외 분석에서 생체 내 응용 분야로 작업을 확장하려는 연구자에게 적합합니다.

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프로토콜

모든 방법은 코넬 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 재료 및 장비 준비

  1. 오버헤드 다광자 현미경과 함께 사용할 중족골 로딩 장치를 설계하고 제작합니다.
    참고: 구성 요소 사양 및 장치 작동에 대한 세부 사항은 이전 연구25의 보충 문서에 설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 주요 구성 요소는 로드셀과 로딩 브래킷이 있는 직렬의 액추에이터, 수조 및 지점점 핀으로 구성됩니다. 액추에이터와 로드셀은 상업적으로 구할 수 있으며 최대 300g의 하중을 수용할 수 있어야 합니다. 수조, 받침점 핀 및 하중 브래킷은 티타늄 또는 스테인리스강으로 구성되어야 합니다. 사내에서 제작하거나 3D 금속 프린팅 을 통해 상업적으로 제작할 수 있습니다.
  2. 개별 마우스 그룹(즉, 성별, 처리, 유전자형)에 대해 사전에 액추에이터 변위에 대한 변형률 크기 값을 보정합니다. 이는 이전 연구25에서 설명한 절차에서 표면 변형률 매핑을 사용하여 수행됩니다.
  3. 골세포에서 형광 칼슘 지시약 구조를 발현하는 16-18주 령의 C57BL/6 배경을 가진 마우스를 사용합니다. 골세포 표적 발현은 플록스 활성화 GCaMP6f 및 Dmp1-Cre 마우스를 교차시켜 달성됩니다. 창시생쥐의 육종 전략 및 공급업체에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 연구25에 설명되어 있습니다.
  4. 오토클레이브(57.2°C, 15psi, 3-4분)를 사용하여 모든 수술 도구, 로드 브래킷, 수조 및 받침 핀을 소독합니다. 100% 에탄올로 현미경 대물렌즈를 소독합니다.
  5. 레이저 소스, 현미경, 로드셀 및 액추에이터를 포함한 전자 부품을 켭니다. 생체 내 이미징 전에 각 구성 요소가 예열되는 데 15-20분을 허용합니다.
    1. 액추에이터 및 로드셀 구성 요소가 제어 장치에서 연결되고 활성화되어 있는지 확인하십시오. 사용자의 선호도에 따라 Matlab, LabView 및 Python을 포함한 다양한 플랫폼에서 제어 소프트웨어를 생성합니다. 이 연구에서 사용된 주요 Matlab 코드는 Actuator_Control_Software_withLoadCell.m ( MT3 Loading Device Control Software.zip 폴더 Supplementary File 1 내부)이라고 합니다.
      참고: 대부분의 상용 이광자 현미경 시스템에는 강력한 이미징 소프트웨어가 함께 제공됩니다. 이 방법에 필요한 주요 기능은 GCaMP6f(920nm)에 대한 적절한 여기로 레이저를 조정하는 기능, 레이저 출력 강도를 조정하는 기능, 최소 6Hz의 주파수로 시계열 수집입니다. 실험에 앞서 이미징 소프트웨어에 대한 레이저 연결과 이광자 이미징을 위한 적절한 광 경로 배열을 확인해야 합니다. 이는 이미징 설정에 따라 다양한 방법으로 확인됩니다. 일반적으로 표시등이 있습니다.

2. 수술

  1. 수술 단계를 준비하고 70% 에탄올로 표면을 살균합니다. 수술 절차 전반에 걸쳐 무균 기술이 사용되는지 확인하십시오. 이 프로토콜은 터미널 절차이므로 이 프로토콜에 필요한 청결 수준을 유지하십시오.
  2. 의료용 공기 또는 산소와 혼합된 기화된 이소플루란으로 1L/min의 유속으로 마우스를 마취합니다. 설치류 유도 챔버에서 3%-5% 이소플루란이 함유된 초기 마취를 수행합니다. 수술 및 생체 내 영상 절차를 위해 콧방울에서 1%-2.5% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
  3. 항상성 심부 체온을 유지하는 데 도움이 되도록 마우스 아래 또는 옆에 가열 장치를 놓으십시오. 수술 내내 마우스의 체온, 심박수 및 산소 포화도를 모니터링합니다. 호흡 속도를 분당 60-80회 사이로 유지하고 이소플루란 복용량을 조정하여 유지하십시오.
  4. 마우스를 누운 위치에 놓습니다. 발가락 꼬집기를 통해 절개 전에 마취 깊이를 확인합니다. 두 번째와 세 번째 중족골 사이의 위치를 확인합니다. 두 번째와 세 번째 중족골 사이의 진피를 통해 메스를 절개하여 원위 끝에서 시작하여 뼈의 길이(~5mm)를 따라 근위적으로 진행합니다.
    참고: 중족골은 발의 발목 뼈 원위부에 있으며 원위 지골 바로 근위부를 따릅니다. 그들은 (내측에서 측면으로) 중족골 I, II, III, IV 및 V로 구성됩니다. 세 번째 중족골은 뒷발의 볼라(volar) 측면의 중앙에 있습니다.
  5. 겸자를 사용하여 피부를 내측/외측 가장자리 쪽으로 당겨 수술 부위를 엽니다. 세 번째 중족골을 노출시키기 위해 직선 Vannas 가위를 사용하여 신전근 힘줄을 절제합니다.
  6. 세 번째 중족골 아래에 중족골 로딩 장치의 중앙 받침 핀을 삽입합니다.
    1. 처음에는 세 번째 중족골이 근위 지골과 만나는 원위 끝의 작은 공간에 핀을 삽입한 다음 세 번째 중족골의 중간 샤프트에 놓일 때까지 핀을 근방으로 움직입니다.
    2. 근육과 근막을 제외한 뼈와 핀 사이의 직접적인 인터페이스를 보장하기 위해 특히 주의하십시오. 이는 로딩 프로토콜 중 안정적인 이미징에 매우 중요합니다.
  7. 집게로 발목을 잡고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 채워진 수조(8-10mL)에 발을 넣습니다. 로딩 브래킷으로 발을 제자리에 고정하고 브래킷을 액추에이터/로드셀 배열에 연결합니다. 장치 내에서 완료된 수술 준비 및 배열이 그림 1에 나와 있습니다.

3. 이미징

참고: 이 프로토콜에 사용된 전체 이광자 현미경 설정에는 레이저용 Chameleon Discovery GUI V2.0.6(그림 2)과 현미경용 ThorImageLS4.0(그림 3)의 두 가지 소프트웨어 패키지가 있습니다. 이광자에서 이미지를 촬영하려면 Live 를 누릅니다(그림 3, 파란색 재생 버튼). 데이터를 이미지화하고 저장하기 위한 실험을 수행할 때 Capture 를 누릅니다(그림 3, Capture Setup 옆 상단 탭). 이는 이 실험에 사용된 장비 및 공급업체에 따라 다르지만 이 프로토콜에 있는 필수 사양(여기 파장, 가시 가능한 창 크기, 이미지 캡처 속도 등)을 가진 많은 대안도 사용할 수 있습니다.

  1. 마우스로 로딩 장치 설정을 매우 조심스럽게 들어 현미경 플랫폼에 놓습니다.
  2. epifluorescence 모드(그림 3, Multiphoton 또는 Fluorescence Setup을 선택한 상단의 드롭다운 메뉴)에서 저배율 대물렌즈로 시작하여 뼈의 중간 골격을 찾고 중앙에 배치합니다.
  3. 관심 영역을 찾은 후 더 높은 수침 대물렌즈 배율(20x-40x)로 전환하고 광학 장치를 이광자로 전환합니다(그림 3, 다광자 또는 형광 설정을 선택할 수 있는 상단의 드롭다운 메뉴).
    참고: 권장 시야 크기는 세포 활동의 경우 최소 250μm x 250μm이며 이미징 시스템에 따라 광학 또는 디지털 줌으로 달성할 수 있습니다.
    1. 적절한 최소 픽셀 밀도는 512 픽셀 x 512 픽셀입니다. 픽셀 밀도를 설정하려면 Galvo/Resonance Area Control 설정을 사용하십시오(그림 3).
    2. ROI를 찾을 때 Power Control 옵션(그림 3)을 사용하여 전력을 줄이고 Galvo/Resonance Scanner Control 설정(그림 3)에서 PMT 증폭을 증가시켜 광표백을 방지합니다.
    3. 525nm를 중심으로 하는 대역통과 필터를 사용하는 녹색 채널에서 섬유성 골막 자가형광을 찾아 이광자 모드에서 뼈 표면을 식별합니다.
      참고: 자가형광은 1,000nm의 여기 파장에서 가장 잘 보이지만 920nm 여기에서도 사용할 수 있습니다(그림 3, 다광자 레이저 제어). 이 랜드마크는 골세포를 관찰할 때 중족골 피질에 대한 ROI의 상대적 깊이를 결정하는 데 중요합니다. 시계열 실험 중에는 이미지화 된 평면의 정확한 깊이가 기록되지 않지만 15-30 μm 사이의 경향이 있다는 점에 유의해야합니다. 정확한 깊이 측정이 필요한 경우 z-스택을 수행해야 합니다.
  4. 테스트 로딩 시합을 실행하여 로딩 장치 내의 수술 준비 및 포지셔닝이 안정적인 ROI 필드(즉, z-평면 변위 없음)를 달성하는 데 효과적인지 확인합니다. 간단히 말해서, 로딩 사이클을 실행하여 수술 준비의 안정성을 평가합니다. Matlab 코드에서 Switch on Servo와 Move 섹션을 실행하여 불러오기를 수행합니다.
    1. 작은 용기 하중을 가하십시오. 적절한 haversine 파동 로딩 프로토콜이 미리 준비되었는지 확인하십시오. 섹션 1.2에서 교정 중에 얻은 적절한 로딩 매개변수를 입력합니다. Matlab 코드에서 Switch on Servo와 Move 섹션을 실행하여 불러오기를 수행합니다.
    2. 하중 또는 호흡에 대한 반응으로 뼈의 미세 모션에서 비롯된 세포의 가시적인 움직임이 화면에 나타나는 경우, y 또는 z 방향을 따라 다른 ROI를 선택하여 중앙 받침점 핀 바로 위에 있는지 확인합니다. 움직임이 지속되면 세 번째 중족골 아래에 있는 핀의 수술 위치를 수동으로 조정하십시오.
      참고: 좋은 관심 영역(ROI)은 세포가 평면/초점 안팎으로 움직이지 않는 영역입니다. x 및 y 방향의 이동은 ImageJ의 템플릿 일치 플러그인을 사용하여 후처리를 위해 조정할 수 있습니다.
  5. 실험 설계에 따라 로딩이 있는 z-stack 또는 t-series 이미징을 수행하여 형태 측정 또는 동적 하중 유도 신호 이벤트를 각각 기록합니다.
    1. 형광 지표의 여기 파장을 설정합니다(예: GCaMP6f의 경우 920nm). z-스택의 경우 0.25-1μm 단계와 같은 골세포의 특징을 캡처할 수 있을 만큼 충분히 낮은 해상도를 사용합니다. T 시리즈의 경우 설정을 사용하여 로딩 속도의 6배 이상을 샘플링합니다. 1Hz 로딩 속도의 경우 초당 6프레임(FPS)의 이미징은 최소한으로 적절한 캡처 속도를 나타냅니다(그림 3, Galvo/Resonance Scanner Control).
    2. 로딩 및 라이브 이미징의 경우, 각 시합에서 로드되지 않은 기준선 데이터를 수집합니다. 이 연구에서는 60초의 무부하 이미징 후 60초의 로딩 및 이미징이 선호됩니다. 그에 따라 로딩 및 이미징 프로토콜을 설계합니다. 데이터를 수집하려면 Capture 를 누릅니다(그림 3, Capture Setup 옆 상단의 탭).
      1. 뼈 세포에서 완전한 칼슘 신호 반응의 불응 기간은 약 15분28로 추정됩니다. 동적 신호 데이터를 수집할 때 순차적 로딩 시합 사이에 최소한 그 시간을 기다립니다.
      2. 전체 실험 동안 동물이 예기치 않게 마취에서 깨어나거나 개입할 기회 없이 고통을 겪지 않도록 동물을 방치하지 마십시오.
        참고: 절차가 끝날 때 안락사는 IACUC가 승인한 방법에 따라 자궁경부 탈구 또는 기타 적절한 조치를 통해 수행되어야 합니다. 이것은 모든 동물이 이미징 후 안락사된다는 것을 의미하는 비생존 프로토콜입니다.

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결과

여기에서는 급성 수술 준비 및 다광자 형광 이미징을 사용하여 생체 내에서 내장된 골세포의 칼슘 신호 전달을 연구하는 방법론을 보고합니다. 녹색 형광 신호는 DMP1-Cre 발현 을 통해 골세포의 유전적으로 암호화된 칼슘 지표에서 관찰할 수 있습니다. 그림 4 는 포매된 골세포의 단일 평면 이미지입니다. 모든 세포에는 라벨링이 되어 ?...

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토론

골세포는 경조직 기질(hard tissue matrix)에 박혀 있는 위치 때문에 실험적으로 연구하기 어려우며, 이 틈새가 제거되면 빠르게 악화되거나 역분화됩니다. 지난 30년 동안 골세포를 연구하기 위해서는 골세포와 유사한 계통(line)을 만드는 것 29,30,31, 일차 골세포를 분리하기 위한 프로토콜의 수립

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공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

없음.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
#3 Handle scalpelElectron Microscopy Sciences72040-03Surgical supplies
20x Water immersion objectiveOlympusXLUMPLFLN20XWThis is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80120A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit AM Bickford80000An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJThe Jackson Laboratory28865GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJThe Jackson Laboratory23047Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cellFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesiumVWR International21-030-CVIonically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick toolElectron Microscopy SciencesSurgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%Sigma AldrichSIAL-459844-500MLSterilization purposes
Fulcrum pinFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kitFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.717435Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)NIHN/AInstall here https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal Critical Care66794-013-25100% inhalation vapour liquid
Loading bracketFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019aMathWorksFor running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isofluraneButler Schein Animal Health14309Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet2500A Vet
Piezo servo controllerPI-USAE-625Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuatorPI-USAP-602.5SLActuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100Electron Microscopy Sciences72044-10Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mmElectron Microscopy Sciences78326-42Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscopeThorLabsN/AThis is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)CoherentN/AThis system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed. 
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edgeFine Science Tools15018-10Surgical supplies
Water bathFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document

참고문헌

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