Un enfoque de imagen intravital fluorescente para estudiar la dinámica de señalización de calcio inducida por la carga en osteocitos de ratón

Resumen

El presente artículo describe la realización de un enfoque de imagen intravital para observar la señalización de calcio inducida mecánicamente de osteocitos incrustados in vivo en tiempo real en respuesta a la carga mecánica a nivel tisular del tercer metatarsiano del ratón.

Resumen

El tejido óseo es exquisitamente sensible a las diferencias en la magnitud de la carga mecánica. Los osteocitos, células dendríticas que forman un sincitio en todo el hueso, son responsables de la función mecanosensorial del tejido óseo. Los estudios que emplean la histología, el modelado matemático, el cultivo celular y los cultivos de órganos óseos ex vivo han avanzado enormemente en la comprensión de la mecanobiología de los osteocitos. Sin embargo, la cuestión fundamental de cómo los osteocitos responden y codifican la información mecánica a nivel molecular in vivo no se comprende bien. Las fluctuaciones de la concentración de calcio intracelular en los osteocitos ofrecen un objetivo útil para aprender más sobre los mecanismos agudos de mecanotransducción ósea. Aquí, presentamos un método para estudiar la mecanobiología de los osteocitos in vivo, combinando una cepa de ratón con un indicador de calcio codificado genéticamente en fluorescencia expresado en osteocitos con un sistema de carga e imagen in vivo para detectar directamente los niveles de calcio de los osteocitos durante la carga. Esto se logra con un dispositivo de flexión de tres puntos que puede administrar cargas mecánicas bien definidas al tercer metatarsiano de ratones vivos y, al mismo tiempo, monitorear las respuestas de calcio indicadas fluorescentemente de los osteocitos mediante microscopía de dos fotones. Esta técnica permite la observación directa in vivo de los eventos de señalización del calcio de los osteocitos en respuesta a la carga ósea total y es útil en el esfuerzo por revelar los mecanismos de la mecanobiología de los osteocitos.

Introducción

La matriz ósea se organiza de acuerdo con la demanda mecánica ^1,2 y puede cambiar dinámicamente para tener en cuenta los requisitos mecánicos cambiantes ^3,4,5. Hace unos 30 años se publicó un trabajo seminal sobre el mecanismo mecanosensorial en el hueso como un artículo de modelización ^6,7,8, donde se propuso que los osteocitos incrustados dentro del hueso detectan la deformación mecánica del nivel de tejido a través del movimiento del fluido en su entorno local. Este modelo fue validado experimentalmente con experimentos in vitro y ex vivo, donde se demostró claramente que los osteocitos son bastante mecanosensibles ^1,2,3,4,5,6 y también expresan citoquinas, que dirigen el comportamiento de los osteoblastos constructores de hueso⁷ y osteoclastos ^{8,9,10, Isaías 11,12}.

La señalización del calcio es un segundo mensajero ubicuo que se ha establecido como una figura central y un objetivo experimental confiable en la mecanobiología de osteocitos 13,14,15,16. La señalización del calcio tiene la ventaja de ser ampliamente estudiada en biología celular¹⁷, lo que significa que se sabe mucho sobre sus efectos posteriores y las correspondientes herramientas fluorescentes disponibles para la observación experimental. Los análisis in vitro han utilizado la señalización del calcio como medio para identificar la activación mecánica de los osteocitos y caracterizar el comportamiento de la señalización dinámica ^5,18,19. Cabe destacar que la observación de la señalización del calcio en una línea celular de osteocitos proporcionó evidencia definitiva de que la activación del líquido en las uniones de integrinas a lo largo del proceso celular es probablemente la principal forma de activación del flujo de líquido²⁰. Este estudio es uno de los muchos que muestran la utilidad de la señalización del calcio. Se induce de forma fiable con la activación mecánica de los osteocitos y, por lo tanto, sirve como un potente objetivo para interrogar la mecanobiología de los osteocitos.

La mecanotransducción de osteocitos in vivo depende en gran medida de su microentorno inmediato. Las proteínas de unión a la matriz (por ejemplo, proteoglicanos, integrinas) proporcionan uniones funcionales entre las membranas celulares de los osteocitos en una disposición que es crítica para la activación fluida de la célula^21,22. Si bien los análisis in vitro bidimensionales (2D) son útiles, son limitados en el sentido de que no incorporan estas características tridimensionales (3D) críticas. Las preparaciones ex vivo de señalización de calcio en osteocitos mediante microscopía confocal han arrojado algo de luz sobre cómo responden los osteocitos mientras mantienen intacta la matriz circundante^13,16. Sin embargo, se cree que la eliminación del suministro de sangre del hueso cambia los nutrientes y la dinámica de fluidos del sistema lacunocanalicular. La interrogación de la mecanobiología de los osteocitos requiere la investigación in vivo de la señalización de los osteocitos inducida por la carga.

La investigación in vivo de las células incrustadas en el hueso se ha visto obstaculizada en gran medida por las limitaciones de las técnicas de imagen tradicionales, como la microscopía de campo claro y la confocal. Los osteocitos se colocan en una matriz mineralizada²³ compuesta por hidroxiapatita, colágeno tipo 1 y otras proteínas no colágenas que limitan la accesibilidad óptica²⁴ y hacen que la investigación in vivo sea técnicamente desafiante. Sin embargo, los avances recientes en imágenes fluorescentes no lineales y reporteros de calcio codificados genéticamente presentan la oportunidad de superar estos desafíos.

Aquí, reportamos un enfoque novedoso con la capacidad de obtener imágenes de osteocitos in vivo para medir la señalización de calcio con una resolución a nivel celular²⁵. Esto se logra mediante el uso de un marcador fluorescente dinámico que utiliza un indicador de calcio codificado genéticamente por primera vez en osteocitos de ratón. Los ratones con expresión de GCaMP6f dirigida a osteocitos impulsada por DMP1-Cre exhiben fluorescencia visible en los osteocitos a lo largo de la corteza diafisaria de los metatarsianos de los ratones^17,26. Utilizamos un sistema de flexión de tres puntos para aplicar niveles fisiológicos de magnitud de deformación entre 250-2.000 με²⁷. Esta técnica permite la visualización in vivo de la dinámica de señalización del calcio de los osteocitos durante la carga mecánica de todo el hueso y podría ser útil para cualquier persona que busque comprender la mecanobiología de los osteocitos. Este método sería apropiado para los investigadores que buscan expandir su trabajo de los análisis in vitro a las aplicaciones in vivo, especialmente mientras se conservan los análisis moleculares basados en funciones (es decir, la investigación de la actividad celular a través de la señalización del calcio) en lugar de los estudios de fenotipado de base amplia.

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Protocolo

Todos los métodos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Cornell.

1. Preparación de materiales y equipos

1. Diseñar y construir el dispositivo de carga metatarsiana para su uso con un microscopio multifotónico aéreo.
   NOTA: Los detalles sobre las especificaciones de los componentes y el funcionamiento del dispositivo se describen en la documentación complementaria de un estudio anterior²⁵. En resumen, los componentes principales consisten en un actuador en serie con una célula de carga y un soporte de carga, un baño de agua y un pasador de apoyo. El actuador y la célula de carga se pueden obtener comercialmente y deben ser capaces de acomodar cargas de hasta 300 g. El baño de agua, el pasador de apoyo y el soporte de carga deben estar construidos de titanio o acero inoxidable. Pueden fabricarse internamente o comercialmente mediante impresión 3D en metal.
2. Calibrar los valores de la magnitud de la deformación con el desplazamiento del actuador por adelantado para grupos individuales de ratones (es decir, sexo, tratamiento, genotipo). Esto se hace utilizando el mapeo de deformaciones superficiales en un procedimiento descrito en un estudio previo²⁵.
3. Se utilizaron ratones con fondo C57BL/6, de 16 a 18 semanas de edad, que expresan construcciones indicadoras de calcio fluorescentes en los osteocitos. La expresión dirigida a los osteocitos se logra mediante el cruce de ratones GCaMP6f y Dmp1-Cre activados por flox. Los detalles de las estrategias de cría y los proveedores de ratones fundadores se describen en un estudio publicado anteriormente²⁵.
4. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos, el soporte de carga, el baño de agua y el pin de apoyo con un autoclave (57,2 °C, 15 psi, 3-4 min). Desinfecte los objetivos del microscopio con etanol al 100%.
5. Encienda los componentes electrónicos, incluida la fuente láser, el microscopio, la celda de carga y el actuador. Espere de 15 a 20 minutos para que cada componente se caliente antes de la toma de imágenes intravitales.
   1. Asegúrese de que los componentes del actuador y la célula de carga estén conectados y activados en el dispositivo de control. Genere el software de control con una variedad de plataformas, incluidas Matlab, LabView y Python, de acuerdo con las preferencias del usuario. El código principal de Matlab utilizado en este estudio se denomina Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (dentro de la carpeta MT3 Loading Device Control Software.zip Supplementary File 1).
      NOTA: La mayoría de los sistemas de microscopio de dos fotones disponibles en el mercado vienen con un sólido software de imágenes. Las características clave requeridas para este método son la capacidad de ajustar un láser a la excitación adecuada para GCaMP6f (920 nm), la capacidad de ajustar la intensidad de la potencia del láser y una recopilación de series temporales con una frecuencia de al menos 6 Hz. Antes de la experimentación, se debe confirmar la conexión del láser al software de imagen y la disposición adecuada de la trayectoria de luz para la obtención de imágenes de dos fotones. Esto se confirma de diferentes maneras dependiendo de la configuración de la imagen. Por lo general, hay un indicador de luz.

2. Cirugía

1. Preparar una etapa quirúrgica y esterilizar la superficie con etanol al 70%. Asegurar que se empleen técnicas asépticas durante todos los procedimientos quirúrgicos. Mantenga el nivel de limpieza requerido para este protocolo, ya que es un procedimiento terminal.
2. Anestesiar al ratón con isoflurano vaporizado mezclado con aire u oxígeno de grado médico a un caudal de 1 L/min. Realizar la anestesia inicial en una cámara de inducción de roedores con 3%-5% de isoflurano. Mantenga la anestesia al 1%-2.5% de isoflurano en un cono nasal para procedimientos quirúrgicos y de imágenes intravitales.
3. Coloque un dispositivo de calentamiento debajo o al lado del mouse para ayudar a mantener la temperatura corporal central homeostática. Controle la temperatura corporal, la frecuencia cardíaca y la saturación de oxígeno del ratón durante toda la cirugía. Mantenga la frecuencia respiratoria entre 60 y 80 respiraciones por minuto y manténgala ajustando la dosis de isoflurano.
4. Coloque el ratón en posición supina. Confirme la profundidad de la anestesia antes de la incisión mediante un pellizco en el dedo del pie. Identificar la ubicación entre el segundo y el tercer metatarsiano. Hacer una incisión con bisturí a través de la dermis entre el segundo y el tercer metatarsiano, comenzando en el extremo distal y progresando proximalmente a lo largo de los huesos (~5 mm).
   NOTA: Los metatarsianos son distales a los huesos del tobillo en la pata y siguen directamente proximales a las falanges distales. Constan de los metatarsianos I, II, III, IV y V (medial a lateral). El tercer metatarsiano está centrado en el centro de la cara volar de la pata trasera.
5. Con fórceps, abra el sitio quirúrgico tirando de la piel hacia los bordes medial/lateral. Resecar los tendones extensores con unas tijeras Vannas rectas para exponer el tercer metatarsiano.
6. Inserte el pin central del dispositivo de carga metatarsiano debajo del tercer metatarsiano.
   1. Inicialmente, inserte el clavo en el pequeño espacio en el extremo distal donde el tercer metatarsiano se encuentra con la falange proximal y luego mueva el clavo proximalmente hasta que descanse en la diáfisis media del tercer metatarsiano.
   2. Tenga especial cuidado para garantizar una interfaz directa entre el hueso y el clavo, excluyendo cualquier músculo y facia. Esto es fundamental para la creación de imágenes estables durante los protocolos de carga.
7. Sujete el tobillo con pinzas y coloque el pie en el baño de agua lleno de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (8-10 mL). Asegure la pata en su lugar con el soporte de carga y conecte el soporte a la disposición del actuador/celda de carga. En la Figura 1 se muestra una preparación quirúrgica completa y la disposición dentro del dispositivo.

3. Imágenes

NOTA: La configuración completa de microscopía de dos fotones utilizada en este protocolo tiene dos paquetes de software: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 para el láser (Figura 2) y ThorImageLS4.0 para el microscopio (Figura 3). Para obtener imágenes en el fotón de dos fotones, presione Live (Figura 3, botón azul de reproducción). Al realizar un experimento para crear una imagen y guardar datos, presione Capturar (Figura 3, la pestaña en la parte superior, junto a Configuración de captura). Estos son específicos del equipo y los proveedores utilizados en este experimento, pero muchas alternativas con las especificaciones necesarias que se encuentran en este protocolo (longitudes de onda de excitación, tamaño de la ventana visible, velocidad de captura de imágenes, etc.) también funcionarían.

1. Levante con mucho cuidado la configuración del dispositivo de carga con el ratón y colóquelo en la plataforma del microscopio.
2. Comience con un objetivo de bajo aumento en modo de epifluorescencia (Figura 3, menú desplegable en la parte superior con selecciones Multiphoton o Fluorescence Setup) para ubicar y centrar la diáfisis media del hueso.
3. Después de localizar una región de interés, cambie a un aumento del objetivo de inmersión en agua más alto (20x-40x) y cambie la óptica a dos fotones (Figura 3, menú desplegable en la parte superior con selecciones Configuración de multifotón o fluorescencia).
   NOTA: El tamaño de campo de visión recomendado es de al menos 250 μm x 250 μm para la actividad celular y se puede lograr con zoom óptico o digital, según el sistema de imágenes.
   1. La densidad de píxeles mínima adecuada es de 512 píxeles x 512 píxeles. Para establecer la densidad de píxeles, utilice la configuración de Control de área de Galvo/Resonancia (Figura 3).
   2. Al encontrar el retorno de la inversión, evite el fotoblanqueo reduciendo la potencia utilizando la opción de control de potencia (Figura 3) y aumentando la amplificación de PMT en la configuración de control del escáner de galvo/resonancia (Figura 3).
   3. Identifique la superficie del hueso en modo de dos fotones buscando la autofluorescencia del periostio fibroso en el canal verde que utiliza un filtro de paso de banda centrado a 525 nm.
      NOTA: La autofluorescencia es más visible con la longitud de onda de excitación a 1.000 nm, pero también está disponible con una excitación de 920 nm (Figura 3, Control láser multifotónico). Este punto de referencia es importante para determinar la profundidad relativa del ROI en la corteza metatarsiana cuando se observan osteocitos. Hay que tener en cuenta que durante los experimentos de series temporales, no se registra la profundidad exacta del plano fotografiado, aunque suele oscilar entre 15-30 μm. Si se desean mediciones de profundidad exactas, entonces se tendría que tomar una pila z.
4. Ejecute una prueba de carga para asegurarse de que la preparación quirúrgica y el posicionamiento dentro del dispositivo de carga sean efectivos para lograr un campo de ROI estable (es decir, sin desplazamiento del plano z). Brevemente, ejecute un ciclo de carga para evaluar la estabilidad de la preparación quirúrgica. Realice la carga ejecutando la sección Switch on Servo and Move en el código de Matlab.
   1. Aplique una pequeña carga de tara. Asegúrese de que se preparen con anticipación los protocolos adecuados de carga de onda haversine. Introduzca los parámetros de carga apropiados obtenidos durante la calibración en la sección 1.2. Realice la carga ejecutando la sección Switch on Servo and Move en el código de Matlab.
   2. Si hay un movimiento visible de las células en la pantalla, que proviene del micromovimiento del hueso en respuesta a la carga o la respiración, seleccione un ROI diferente a lo largo de las direcciones Y o Z para asegurarse de que esté directamente sobre el punto de apoyo central. Si el movimiento persiste, ajuste manualmente la posición quirúrgica del clavo debajo del tercer metatarsiano.
      NOTA: Una buena región de interés (ROI) es aquella en la que las células no se mueven dentro y fuera del plano/foco. El movimiento en las direcciones x e y se puede ajustar para el posprocesamiento utilizando el complemento de coincidencia de plantillas en ImageJ.
5. Realice imágenes de la serie z o t con carga de acuerdo con el diseño experimental para registrar eventos de señalización morfométricos o dinámicos inducidos por carga, respectivamente.
   1. Ajuste la longitud de onda de excitación para el indicador fluorescente (por ejemplo, 920 nm para GCaMP6f). Para el apilamiento z, utilice una resolución lo suficientemente baja como para capturar las características de los osteocitos, como pasos de 0,25-1 μm. Para la serie t, use la configuración para muestrear al menos 6 veces la velocidad de carga. Para una velocidad de carga de 1 Hz, la obtención de imágenes a 6 fotogramas por segundo (FPS) representa la velocidad de captura mínimamente apropiada (Figura 3, Galvo/Control de escáner de resonancia).
   2. Para la carga y las imágenes en vivo, recopile datos de línea base no cargados con cada combate. En este estudio, se prefieren 60 s de imágenes sin carga seguidas de 60 s de carga e imágenes. Diseñe los protocolos de carga e imagen en consecuencia. Para recopilar datos, presione Capturar (Figura 3, pestaña en la parte superior, junto a Configuración de captura).
      1. Se estima que el período refractario para una respuesta completa de señalización de calcio en las células óseas es de aproximadamente 15 min²⁸. Espere al menos ese tiempo entre los episodios de carga secuencial al recopilar datos de señalización dinámica.
      2. A lo largo de todo el experimento, no deje al animal desatendido para asegurarse de que no se despierte inesperadamente de la anestesia o experimente angustia sin la oportunidad de intervenir.
         NOTA: La eutanasia al final del procedimiento debe realizarse a través de la dislocación cervical u otras medidas apropiadas de acuerdo con los métodos aprobados por IACUC. Este es un protocolo de no supervivencia, lo que significa que todos los animales son sacrificados después de la toma de imágenes.

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Resultados

Aquí reportamos una metodología para estudiar la señalización de calcio en osteocitos embebidos in vivo utilizando preparación quirúrgica aguda e imágenes fluorescentes multifotónicas. La señal fluorescente verde se puede observar a partir de indicadores de calcio codificados genéticamente en osteocitos a través de la expresión de DMP1-Cre. La Figura 4 es una imagen de un solo plano de los osteocitos incrustados. Tenga en cuenta...

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Discusión

Es difícil estudiar experimentalmente los osteocitos debido a su posición incrustada en la matriz del tejido duro, a la que se deterioran o desdiferencian rápidamente al eliminar este nicho. La investigación de los osteocitos ha requerido un inmenso ingenio en las últimas 3 décadas, como la creación de líneas similares a los osteocitos 29,30,31, el establecimiento de protocolos para aislar osteocitos

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Handle scalpel	Electron Microscopy Sciences	72040-03	Surgical supplies
20x Water immersion objective	Olympus	XLUMPLFLN20XW	This is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIR	AM Bickford	80120	A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit	AM Bickford	80000	An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJ	The Jackson Laboratory	28865	GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJ	The Jackson Laboratory	23047	Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cell	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	905898	LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesium	VWR International	21-030-CV	Ionically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick tool	Electron Microscopy Sciences		Surgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%	Sigma Aldrich	SIAL-459844-500ML	Sterilization purposes
Fulcrum pin	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kit	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	717435	Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)	NIH	N/A	Install here https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-013-25	100% inhalation vapour liquid
Loading bracket	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019a	MathWorks		For running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isoflurane	Butler Schein Animal Health	14309	Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet		2500A Vet
Piezo servo controller	PI-USA	E-625	Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuator	PI-USA	P-602.5SL	Actuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100	Electron Microscopy Sciences	72044-10	Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mm	Electron Microscopy Sciences	78326-42	Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscope	ThorLabs	N/A	This is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)	Coherent	N/A	This system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed.
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edge	Fine Science Tools	15018-10	Surgical supplies
Water bath	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document