銀ナノ粒子を用いたマウスの変形性関節症の改善

要約

ここでは、滑膜炎症、滑膜過形成、血管過形成など、II型コラゲナーゼ誘発性変形性関節症マウスの急性症状を効果的に改善するために銀ナノ粒子を使用するためのプロトコルを紹介します。

要約

変形性膝関節症(KOA)は、45歳以上の人に最もよく見られる関節の変性疾患の1つです。現在、KOAの効果的な治療法はなく、唯一のエンドポイント戦略は人工膝関節全置換術(TKA)です。したがって、KOAは経済的負担と社会的コストに関連しています。免疫炎症反応は、KOAの発生と発症に関与しています。我々は以前、II型コラーゲンを用いたKOAのモデルマウスを樹立した。滑膜組織の過形成は、多数の浸潤炎症細胞とともにモデルに存在した。銀ナノ粒子は実質的な抗炎症効果があり、腫瘍治療や外科的薬物送達に広く使用されています。そこで、銀ナノ粒子の治療効果をコラゲナーゼII誘導KOAモデルで評価しました。実験結果は、銀ナノ粒子が滑膜過形成と滑膜組織への好中球の浸潤を有意に減少させることを示しました。したがって、この研究は、オープンアクセスのための新しい戦略の特定を示し、KOAの進行を防ぐための理論的基礎を提供します。

概要

変形性膝関節症(KOA)は、変形性膝関節症の最も頻繁な形態の1つであり、滑膜関節全体に複雑な疾患プロセスを伴います¹。世界人口の高齢化が進む中、KOAの罹患率は大幅に増加しています。膝関節の痛みが続くと、KOAの患者は一般的に治療を受けるように促されます。KOAの疼痛の病因は、炎症反応、滑膜過形成、軟^骨変性に関連している可能性があります2。滑膜組織は、滑膜線維芽細胞とマクロファージの2種類の細胞で構成されています^3,4,5。滑膜線維芽細胞は滑液を産生します。滑膜マクロファージは通常休眠状態にあり、炎症反応によって活性化されます。滑膜の初期炎症は膝関節の痛みを引き起こします⁶.

滑膜組織の炎症性免疫応答は、KOAの病因に重要な役割を果たします。以前の研究では、滑膜炎として知られるKOAの滑膜組織に炎症反応があることが確認されており、KOAの滑膜炎の程度は、滑膜組織の炎症性細胞浸潤と密接に関連しています^7,8,9。滑膜炎は滑膜の炎症反応であり、その病理学的特徴は滑膜細胞の増殖、新しい血管の形成、および炎症細胞の浸潤である^5,10,11。

KOA治療の目標は、滑膜の炎症反応を和らげ、病気の進行を遅らせることです。現在、KOAを治療するための主要な臨床薬は非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)です。しかし、それらは腎毒性^12,13などの重大な副作用を示します。関節内グルココルチコイド注射は、KOAを治療するための別の選択肢です。ただし、グルココルチコイドは急速に広がり、関節液貯留によって急速に代謝される可能性があります。.一方、基礎疾患のある高血糖症の糖尿病患者は、進行中のステロイド注射に注意する必要があります¹⁴。要約すると、KOAに利用可能な薬物治療戦略はありません。そのため、KOA治療薬の探索は急務です。

銀ナノ粒子のサイズは100nm未満です。抗炎症作用、抗菌作用、抗酸化作用が顕著であるため、創傷治癒や火傷など、医療や医学のさまざまな側面で広く利用されています^15,16。また、標的薬物送達、医用画像、分子診断にも使用されています¹⁷。銀(Ag)は、銅(Cu)、亜鉛(Zn)、鉄(Fe)などの他の金属ナノ粒子よりも優れた抗炎症作用と抗菌作用を持っています¹⁵。新しいタイプのナノ材料である銀ナノ粒子は、広域スペクトルで強力な抗菌特性を持っています。以前の研究では、火傷および腹膜炎マウスモデル^18,19において、銀ナノ粒子が炎症因子の産生を効果的に抑制し、創傷治癒を促進する可能性があることがわかった。以前の研究では、銀ナノ粒子が成長因子の合成とコラーゲン沈着を促進することにより、糖尿病性創傷の治癒を改善することも実証されました²⁰。

銀ナノ粒子の抗炎症作用に基づき、銀ナノ粒子を用いてマウスのII型コラーゲン誘発性KOAを治療することを目指しました。その結果、マウスの滑膜関節の炎症性浸潤細胞の数が有意に減少したことが示唆されました。また、銀ナノ粒子がマウスのKOAの症状を有意に緩和する可能性も示唆されました。したがって、銀ナノ粒子の応用は、臨床KOAの新たな治療法の開発を後押しする可能性がある。

プロトコル

すべての動物実験は、広州フォーエバーゲン医療実験動物センターの動物倫理福祉委員会(AEWC)によって承認されました(2018-0186)。

1. KOAマウスモデルの構築

1. BALB/cマウス(18-24g;12-14週齢)を湿度70%、26°C、明暗サイクル12時間で維持する。この実験では、動物は広州フォーエバーゲン医学実験動物センターで飼育されました。
2. II型コラーゲンを使用して、前述のようにKOAマウスモデルを確立します²¹。以下に説明するように関節内注射を行います。.
   1. 麻酔には2%ペントバルビタールナトリウム(40 mg / kg)、鎮痛にはブプレノルフィン(0.05 mg / kg、皮下注射)を適用します。.次に、マウスの手足をテープで固定し、カミソリで毛を取り除き、0.1%ヨードフォアとアルコールを交互に3回こすり洗いして消毒します。
   2. 滅菌手袋を着用し、滅菌ハサミを使用して、皮膚、皮下組織、膝蓋骨下靭帯を順番に露出させます。切開面積は0.5cm未満に保ちます。
      注:手術中にマウスの体温を維持するために、加熱ブランケットを使用しました。
   3. 1 mLのインスリン注射器を使用して、10 Uの30 mg / kg(0.4 mg / mL)II型コラゲナーゼを関節腔(膝蓋骨下靭帯の下)に注入します²²。
      注意: 針と皮膚の間の角度は約15°である必要があります。次に、針の方向を変え、針を完全に引き抜く必要があります。
   4. 注射後、最初に皮下組織を縫合し、次に皮膚を縫合します。縫合部を0.1%ヨードフォアで滅菌します。マウスが麻酔から目覚めた後、個別に換気ケージ(IVC)に入れます。

2. 銀ナノ粒子の合成

注:銀ナノ粒子の調製は、以前に詳細に説明した¹⁹。調合プロセス全体は氷上で行われます。調製後、混合物を4°Cで保存する。そうでなければ、混合物は室温で容易に固化する。

1. 合計400μLのI型コラーゲン(4mg/mL)を1.5mLの微量遠心チューブに加え、氷上に置いた。
2. 上記のコラーゲンに合計200μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、溶液をよく混ぜて氷上に置く。
3. 最後に、上記の溶液に400μLの銀ナノ粒子を加え、十分に混合します。ナノ粒子溶液の最終濃度は1mMです。
   注:銀ナノ粒子の平均直径は、5nm〜15nm^{の範囲である23}。これは電子顕微鏡によって確認されました。

3. II型コラゲナーゼ誘導KOAマウスの銀ナノ粒子処理

1. 1週間後にII型コラゲナーゼ誘導KOAマウスをケージから取り出し、銀ナノ粒子を注入します。銀ナノ粒子を週に1回注入し、30日後に検体を採取します。
2. 麻酔用に合計2%ペントバルビタールナトリウム(用量:2 mL / kg)を腹腔内注射 で 注射し、手順1.2の説明に従って皮膚を固定、準備、および滅菌します。.
3. 滅菌手袋を着用し、滅菌ハサミを使用して、皮膚、皮下組織、膝靭帯を順番に露出させます。
4. 1 mLのインスリン注射器を使用し、針で15°の角度で関節腔に入ります。約20μLの銀ナノ粒子コラーゲン混合物をゆっくりと注入し、針²⁴をゆっくりと引き抜く。
5. 皮下組織と皮膚を順番に縫合し、滅菌します。マウスが麻酔から目覚めた後、個別に換気ケージ(IVC)に入れます。
6. この銀ナノ粒子コラーゲン混合物(20μL)の注入を週に1回の頻度で4回行います。
   注:銀ナノ粒子コラーゲン混合物で処理したマウスは、個別のケージで保管する必要があります。マウス同士が一緒に飼育されていると、ネズミの喧嘩が起こり、実験結果に影響が出るかもしれません。注射中、針が関節腔に達すると緊張感があり、注射後に膝関節に腫れが生じます。これら2つの方法を組み合わせることで、研究者は薬物が膝関節に正常に注入されたことを確認できます。

4.膝関節と滑膜組織の収集

1. マウスを二酸化炭素窒息または関連する動物倫理委員会によって承認されたその他のプロトコルで犠牲にします。
2. 皮膚と皮下組織を順次滅菌および解剖し、膝関節を完全に露出させます。
3. 大腿骨と脛骨を含む膝関節を採取し、筋肉組織を取り除きます。
4. 大腿骨、脛骨、および周囲の軟部組織(靭帯と被膜)を含む膝関節組織を10%ホルマリンで収集し、保存と固定を行います。

5. ヘマトキシリン-エオシン染色

1. 一晩固定した後、切片をパラフィン包埋し、ミクロトームを使用してパラフィン包埋組織を0.4μmの厚さに切断します。調製した切片をさらなる染色(ヘマトキシリン-エオシン染色、サフラニンO/ファストグリーン染色、免疫組織化学(IHC)染色)に使用します。
2. 切片をキシレンで2回脱パラフィンし、100%、95%、80%、70%のエタノールを順番に5分間ずつ浸し、再水和します。
3. 切片をヘマトキシリン(0.1 g/100 mL)で5分間染色した後、1%塩酸で10秒間、エオシン(0.5 g/100 mL)で1分間直接入れます。
4. 滑膜の組織病理学的変化を顕微鏡で観察します。

6.サフラニンO /ファストグリーン

1. 組織をパラフィンに包埋し、ステップ5.1の説明に従って組織切片を調製します。
2. 切片をキシレンで2回脱パラフィンし、エタノールシリーズ(蒸留水に100%、95%、80%、70%エタノールをそれぞれ5分間)で再水和します。
3. 調製した切片をヘマトキシリンで染色し、PBSで3回、それぞれ2分間洗浄します。
4. 塩酸アルコールで切片を分別し、PBSで2分間ずつ3回洗浄します。
5. 切片を0.02%ファストグリーン染色溶液に5〜10分間浸し、続いて0.1%サフラニンO染色を1〜2分間浸します。
6. 切片を1%酢酸で区別し、続いてPBS洗浄します。
7. 切片の線維軟骨形成を検出して分析します。

7. 免疫組織化化学(IHC)染色

1. 組織をパラフィンに包埋し、ステップ5.1で説明したように組織切片を調製する。
2. 切片をキシレンで2回脱パラフィンし、エタノールシリーズ(蒸留水に100%、95%、80%、70%エタノールをそれぞれ5分間)で再水和します。切片をTris-EDTAバッファー(10 mM Tris 塩基、1 mM EDTA溶液、pH 9.0)に浸漬し、95°Cの電子レンジで10分間加熱して抗原賦活化を行います。
3. 切片を3%過酸化水素溶液に10分間曝露し、内因性ペルオキシダーゼを除去します。
4. 切片を5%ヤギ血清で処理して、非特異的結合をブロックします。
5. 希釈したCD177に対する一次抗体(1:1,000希釈)を添加し、4°Cで一晩インキュベートします。 次に、切片をPBSで3回洗浄します。
6. 切片をPBSに浸し、適切な二次抗体(HRP標識ポリマー抗ウサギ系)と室温で30分間インキュベートします。
7. 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を発色剤として使用してIHC染色の可視化を行います。
8. 切片を顕微鏡で観察し、取得した画像を解析します。

結果

KOAマウスモデルは、II型コラゲナーゼを用いて誘導した。モデル導入の1週間後から、調製した銀ナノ粒子コラーゲン混合物を週に1回、4週間関節腔内に注入しました(図1)。各群のマウスの体重を毎日観察し、記録した。その結果、KOAマウスの平均体重は、正常対照群のマウスよりも有意に低いことが示されました。しかし、II型コラゲナーゼ+AgNP群のマウスの平均体重は、KOAマウスと比較して高かったが、この差は統計学的に有意ではなかった(図2)。30日後、マウスから膝関節の滑膜組織を採取し、病理学的検査を行った。過形成、血管増殖、滑膜の炎症性浸潤、および軟骨の損傷^{が分析されました5,10,11}。その結果、KOA群のマウスの滑膜の厚さは、正常な対照群と比較して有意に高いことが示されました。銀ナノ粒子コラーゲン混合物で処理した群では、KOA群と比較して滑膜の厚さが減少しました(図3)。KOAマウスの滑膜には正常対照群と比較して血管過形成があり、銀ナノ粒子コラーゲン混合物で処理したマウスの滑膜では血管過形成が有意に減少しました(図4)。Safranin-O染色の結果は、KOAマウスの軟骨マトリックスが破壊されたのに対し、銀ナノ粒子コラーゲン混合物で処理されたマウスは有意に良好な軟骨マトリックスを示したことを示しました(図5)。各群の形態学的特徴スコアは、前述のように評価された²²。結果は、生理食塩水群で0±0、II型コラーゲン群で7±0.63、II型コラゲナーゼ+AgNP群で4.2±1.17でした(図6)。CD177は主要な好中球マーカー^である25。CD177は、通常の条件下で好中球の40%〜60%で発現します。しかし、好中球におけるCD177の発現は、急性炎症時に有意に増加します。IHC染色の結果、滑膜領域の浸潤好中球は、KOA群と比較してAgNPで治療されたグループで有意に減少することが示され(図7)、AgNPによる治療がKOAの症状を改善する可能性があることが示唆されました。

図1:注入位置。 (A)II型コラゲナーゼ注射の代表画像。(B)II型コラゲナーゼ注射後の代表画像。(C)KOAマウスモデルにおける銀ナノ粒子コラーゲン混合物注入の代表画像。(D)KOAモデルマウスにおける銀ナノ粒子コラーゲン混合物注入後の代表画像。赤い点線は、マウスの膝靭帯に平行な線を表しています。黒い矢印は、インスリン注射器の針と皮膚の間の角度を表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:各群のマウスの体重変化。 このパネルは、異なる時点での各グループのマウスの平均体重を示しています。X軸はII型コラゲナーゼ注射後の日数、Y軸は体重の倍増率を示す。生理食塩水群(n = 7)、II型コラゲナーゼ基(n = 5)、II型コラゲナーゼ+AgNPs基(n = 5)。*p < 0.05 です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:滑膜過形成を表すヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色。 マウスの各群の滑膜組織を採取し、固定し、切片化し、術後30日目にH&Eで染色した。二重矢印は、検出された滑膜の厚さを表します。スケールバー = 0.1 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:滑膜周囲血管過形成の代表画像。 矢印は船舶を示す。スケールバー = 0.05 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:マウスの各グループにおける膝関節のサフラニン-O染色。 スケールバー = 0.2 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:各グループの形態学的特徴スコア。 滑膜組織を使用して、各グループのマウスの形態学的特徴スコアを測定しました。滑膜内層細胞層の過形成/拡大の程度、滑膜組織への好中球浸潤の程度、および滑膜間質の活性化の程度を分析するために、各グループの5つの組織切片が選択されました(表1)。平均値を最終スコアとして使用しました。**p < 0.01 および ***p < 0.001 で、未治療の KOA グループと比較した各コホートの Student の t 検定。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図7:マウスの各グループの滑膜組織における好中球マーカーの免疫組織化学的染色。 免疫組織化学的染色を用いて、各群のマウスの滑膜組織における好中球マーカーCD177の発現を検出した。矢印は好中球を示す。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:形態学的特徴のスコアリング。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

銀ナノ粒子は、抗炎症作用、抗菌作用、抗酸化作用、免疫調節作用を示し、活性酸素種の産生を減少させることで、細胞や組織を損傷から保護することができる²⁶。一部の研究者は、銀ナノ粒子の毒性を懸念しています²⁷。銀ナノ粒子の毒性は、遊離銀イオンの存在に直接関係しています。銀ナノ粒子はナノスケールであるため、生体分子、細胞、および人間の臓器に容易に干渉する可能性があります15,28,29。いくつかの研究は、銀ナノ粒子が酸化ストレスを誘発し、ヒト細胞のミトコンドリア機能を損なう可能性があることを報告しています³⁰。さらに、Agは、大量の銀ナノ粒子を使用した後、人間の臓器、特に肝臓と脾臓で検出できます。研究者はまた、銀ナノ粒子が経シナプス輸送を介して血液脳関門を通過し、脳に蓄積する能力を有することを報告している³¹。銀ナノ粒子の生体毒性に関する体系的な報告は行われていないが、一部の研究者は銀ナノ粒子の安全性を認めている³²。

本研究では、銀ナノ粒子コラーゲン混合物を調製した。実際、ヒト組織における銀ナノ粒子の持続期間は短いが、コラーゲン混合物を塗布すると銀ナノ粒子の持続期間を延長することができる。これにより、外傷だけでなく、薬物の投与量も減少します。銀ナノ粒子の毒性を考慮すると、この研究で適用された銀ナノ粒子の用量は30 mg / kgであり、以前の研究^{と一致していました33}。

実験操作のいくつかの重要な考慮事項は次のとおりです。II型コラゲナーゼは、酵素切断による分解を防ぐために、調製後に-20°Cで保存する必要があります。銀ナノ粒子コラーゲン混合物は急速に半固体ゲルになり、その後注射に使用できないため、銀ナノ粒子コラーゲン混合物の調製は室温で氷上で連続的に行う必要があります。溶液は調製後4°Cで保存する必要があります。関節内投与には、針の細い1mLのインスリン注射器を選択する必要があり、これにより、注射された薬物の漏れを効果的に防ぐことができます。針を15°の角度で挿入して、銀ナノ粒子コラーゲン混合物を注入する必要があります。針が無抵抗の場合、これは針が膝関節腔に到達したことを示します。注射後は、注射の角度を変え、注射した薬剤の漏れを防ぐために、針をゆっくりと引き抜く必要があります。

本研究では、銀ナノ粒子がマウスのII型コラゲナーゼ誘発性KOAの症状を効果的に改善し、銀ナノ粒子の抗炎症作用を実証しました。いくつかの研究は、銀ナノ粒子^34,35,36でin vitroでインキュベートした細胞におけるアポトーシスの存在を報告しています。滑膜過形成の減少は、ミトコンドリア機能の障害に関与している銀ナノ粒子によって引き起こされたか、またはこれらの結果は活性酸素種によって媒介された可能性があります。血管過形成は、KOAモデル群のマウスの滑膜で観察されました。この過程でケモカインが好中球を血管から滑膜組織に追いやり、炎症の爆発により細胞がより多くの酸素を消費し、血管過形成を引き起こした可能性があります。したがって、この仮説の信頼性を証明するには、さらなる実験が必要です。この研究は、臨床KOAの治療に関する研究に理論的利益をもたらします。今後の研究では、前十字靭帯(ACL)法と化学的に誘導したKOAモデル法を組み合わせて、銀ナノ粒子の効果を観察することを目指しています。実験結果は、銀ナノ粒子がKOAマウスの滑膜における炎症細胞の浸潤を有意に減少させることができることを示していますが、この効果のメカニズムはまださらなる研究が必要であり、KOAの病因を解明する可能性があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL insulin syringe	BD	305932	None
CD177 Polyclonal Antibody	ThermoFisher Scientific	PA5-98759	None
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	302-17-0	None
DAB	MCE	HY-15912	None
Eosin	Beyotime Biotechnology	C0109	None
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	None
Hematoxylin	Beyotime Biotechnology	C0107	None
Light Microscopy	Leica	DM500	None
Silver nanoparticle	Wolcacvi	S-10-20	Store product in the dark at 4°C
Safranine O-Fast Green FCF Cartilage Stain Kit	Solarbio	90-15-3	None
Type II collagen	Sigma-Aldrich	C6885-500mg	None