Helicoverpa armigeraに対するファイトケミカルの殺虫効果を評価するための摂食アッセイシステムの開発

要約

このプロトコルは鱗翅目の昆虫の幼虫に対するphytochemicalの潜在的に有毒な効果を評価するために義務的な供給の試金を記述する。これは、亜致死量および致死量、抑止活性、および生理学的効果の最適化が容易な、拡張性の高い昆虫バイオアッセイです。これは、環境に優しい殺虫剤のスクリーニングに使用できます。

要約

鱗翅目の昆虫であるHelicoverpa armigeraは、世界中に分布する多食性の害虫です。この草食性昆虫は、植物や農業の生産性を脅かす存在です。これに反応して、植物は昆虫の成長と生存に悪影響を与えるいくつかの植物化学物質を産生します。このプロトコルは昆虫の成長、開発および存続に対するphytochemical (quercetin)の効果を評価する義務的な供給の試金方法を示す。管理された条件下で、新生児は事前に定義された人工飼料で2番目の星齢まで維持されました。これらの2齢幼虫は、対照群とケルセチンを含む人工食を10日間摂食させました。昆虫の体重、発生段階、フラス重量、死亡率を隔日で記録しました。体重の変化、摂食パターンの違い、および発生表現型は、アッセイ時間全体を通じて評価されました。 記載の義務的摂食アッセイは、自然な摂取様式をシミュレートし、多数の昆虫にスケールアップすることができる。これにより、H. armigeraの成長動態、発生遷移、および全体的な適応度に対するファイトケミカルの影響を分析できます。さらに、このセットアップは、栄養パラメータや消化生理学的プロセスの変化を評価するためにも利用できます。本稿では、毒物学的研究、殺虫分子スクリーニング、植物と昆虫の相互作用における化学的影響の理解に応用できる可能性のある給餌アッセイシステムの詳細な方法論を提供します。

概要

作物の生産性に影響を与える生物的要因は、主に病原体と害虫です。いくつかの害虫は、農作物の損失の15%から35%を引き起こし、経済的^{持続可能性の実践}に影響を与えます1。鞘翅目、半翅目、鱗翅目に属する昆虫は、壊滅的な害虫の主要な目です。環境の適応性が高いため、鱗翅目類はいくつかの生存メカニズムを進化させるのに役立っています。鱗翅目昆虫の中で、Helicoverpa armigera(ワタボリムシ)は約180種類の作物を食べ、生殖組織に重大な損傷を与える可能性があります²。世界全体では、H. armigeraの蔓延により、約50億ドルの損失が発生しています³。綿、ひよこ豆、ハトマメ、トマト、ヒマワリ、その他の作物は、H. armigeraの宿主です。宿主植物のさまざまな部分でライフサイクルを完了します。雌の蛾が産んだ卵は葉の上で孵化し、幼虫期に栄養組織を食べます。幼虫期は、その貪欲で適応性の高い性質のために最も破壊的です^4,5。H. armigeraは、多食性、優れた移動能力、より高い繁殖力、強い休眠、既存の昆虫防^{除戦略に対する}抵抗性の出現などの顕著な特性により、世界的な分布と新しい領域への侵入を示しています6。

テルペン、フラボノイド、アルカロイド、ポリフェノール、シアン化グルコシドなど、さまざまな化学分子が、H. armigera^の蔓延の防除に広く用いられている7。しかし、化学分子の頻繁な適用は、それらの残留物の獲得により、環境および人間の健康に悪影響を及ぼします。また、それらはさまざまな害虫捕食者に有害な影響を及ぼし、生態学的不均衡をもたらします^8,9。したがって、害虫駆除の化学分子の安全で環境に優しいオプションを調査する必要があります。

植物が産生する天然の殺虫分子(ファイトケミカル)は、化学農薬の有望な代替品として使用できます。これらの植物化学物質には、アルカロイド、テルペノイド、およびフェノールのクラスに属するさまざまな二次代謝産^{物が含まれます7,10}。ケルセチンは、さまざまな穀物、野菜、果物、葉に含まれる最も豊富なフラボノイド(フェノール化合物)の1つです。昆虫に対する摂食抑止力と殺虫活性を示します。また、害虫の天敵にも害はありません^11,12。従って、このプロトコルはH. armigeraに対する毒性効果を評価するのにケルセチンを使用して供給の試金を示す。

昆虫の摂食、成長、発達、および行動パターンに対する天然および合成分子の影響を評価するために、さまざまなバイオアッセイ法が開発されています¹³。一般的に使用される方法には、リーフディスクアッセイ、選択給餌アッセイ、液滴給餌アッセイ、接触アッセイ、ダイエットカバーアッセイ、および義務給餌アッセイが含まれます^13,14。これらの方法は、殺虫剤が昆虫にどのように適用されるかに基づいて分類されます。義務的摂食アッセイは、殺虫剤とその致死量¹⁴をテストするために最も一般的に使用される、感度が高く、シンプルで適応性の高い方法の1つです。義務的な摂食アッセイでは、目的の分子を人工飼料と混合します。これにより、食事組成の一貫性と制御が可能になり、堅牢で再現性のある結果が得られます。摂食アッセイに影響を与える重要な変数は、昆虫の発生段階、殺虫剤の選択、環境要因、およびサンプルサイズです。アッセイの期間、2つのデータ記録の間隔、給餌の頻度と量、昆虫の健康状態、およびオペレーターの取り扱いスキルも、給餌アッセイの結果に影響を与える可能性があります^14,15。

この研究は、ケルセチンが H. armigera の生存と適応度に及ぼす影響を評価するための義務的な摂食アッセイを実証することを目的としています。昆虫の体重、死亡率、発達障害などのさまざまなパラメータを評価することで、ケルセチンの殺虫効果に関する洞察が得られます。一方、摂取食品の変換効率(ECI)、消化食品の変換効率(ECD)、おおよその消化率(AD)などの栄養パラメータを測定することで、ケルセチンの抗摂食特性が浮き彫りになります。

プロトコル

H. armigera の幼虫は、インドのバンガロールにあるICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources(NBAIR)から入手しました。本研究では、合計21匹の2齢幼虫を使用しました。

1. ひよこ豆ベースの人工飼料の調製

注:人工飼料の調製に必要な成分のリストを 表1に示します。

1. 表1に示すように、すべてのフラクションをビーカーで個別に秤量し、スパチュラ/マグネチックスターラーを使用して均質な混合物を調製します。
2. フラクションCを電子レンジで約100°Cで5分間茹で、フラクションAに加え、よく混ぜる。
3. 十分に混合した後、混合画分を少し冷ましてから、画分Bを加えます(画分Bには熱に弱い成分が含まれています)。
4. 透明なポリスチレン製、150 mm x 150 mmのシャーレに注ぎます。

2.ケルセチン含有人工飼料の調製

1. ケルセチン水和物( 材料表参照)を適量(1,000ppm)秤量し、エタノール(2 mg/mL)、ジメチルスルホキシド(DMSO;30 mg/mL)、ジメチルホルムアミド(DMF)などの有機溶媒に適切に溶解します。ここで、ケルセチンを溶解するためにDMSOが用いられる。
2. 溶解したケルセチンをフラクションBに加え、続いてフラクションAとフラクションCの混合物に添加します(フラクションBから還元された水の量は、添加されたDMSOの量に等しくなります)。
3. ケルセチンの溶解に使用した同量の有機溶媒を対照食に加えます。
   注: 図1 は、人工飼料およびケルセチン含有飼料の調製を概略的に示しています。

3. ホモ・アルミゲラの養殖と維持

注意: 昆虫の飼育とメンテナンスには、適切に洗浄および滅菌された材料を使用してください。昆虫は、すべての無菌性および安全関連の標準操作慣行^16、17、18に従って慎重に取り扱ってください。

1. H. armigeraの卵は、ステップ3.3で説明したように、飼育室(モスリンの布で覆われたプラスチック製の瓶)に維持された状態で保管します。次に、新しく生まれた新生児を、細い絵筆を使って、作りたてのひよこ豆ベースの人工飼料に優しく移します。
2. 幼虫の飼育には人工飼料を使用し、成虫には1%(w / v)のマルチビタミン(材料表を参照)を含む20%(w / v)のスクロース溶液を使用します^19,20。
   注: H. armigera の3齢齢幼虫は共食い傾向を示すため、各幼虫を別々のバイアルで飼育する必要があります。
3. 昆虫培養室の温度を25±1°C、相対湿度を70%に維持し、16時間の光:8時間の暗長²¹とする。
4. 実験室で1世代の昆虫を飼育して均質性を確保し、摂食アッセイに使用します。
5. 必要に応じて、昆虫培養室の温度を28°Cに上げて、幼虫と蛹の成長を早めます²²。

4. 給餌アッセイのセットアップ

1. 各セット(コントロールと処理)で21秒の幼虫を収集し、約1〜3時間、食事から遠ざけます。
2. 対照飼料とケルセチン含有飼料を細かく切り、与えた飼料の重量と昆虫の体を記録し、昆虫を培養バイアルに慎重に移します。昆虫がそれぞれの食事を食べるのを許します。
   注:これは、摂食アッセイの0日目と見なす必要があります。
3. 昆虫の体の体重、与えられた食事、食べていない食事、およびアッセイの10日目までの隔日(2、4、6、8、および10日目)のフラスを記録します。
4. 10日目以降は、それぞれの餌を食べさせて、さらなる発達的および形態学的変化を観察します。
   注:(1)幼虫のクチクラパッチ、頭嚢、胸脚を備えた蛹の後半身などの幼虫-蛹の中間体。(2)完全に黒くなった体を持つ前蛹。(3)体が収縮した小さめの蛹。(4)蛹-蛾-古い蛹の皮を持つ中間蛾。形態学的変化には、異常な体、ねじれた翼、および関節のある脚を持つ奇形の蛾の成虫が含まれます。次に、これらの変化を対照食で与えられた昆虫と比較します。
5. 発生的および形態学的欠陥の研究が必要ない場合は、10日目に昆虫を凍結します。
   注:幼虫を冷凍する前に、消化管から残留飼料を取り除くために、少なくとも3時間食事を奪われたままにしておく必要があります。

5. データの記録と分析

1. GraphPad Prismソフトウェア( 材料表を参照)で、「ようこそまたは新しいテーブル」ダイアログから XY データテーブルを選択し、そのサブ列に並んで複製する 昆虫の数 を入力します。次に、X軸にタイトル名を 日数として付け、グループAとグループBで、それぞれ コントロール と ケルセチン処理としてタイトル名を付けます。各昆虫の体重を管理して処理し、体重グラフを生成します。
   注:GraphPadでの分析は、サンプルサイズと処理回数によって異なる場合があります。
2. スチューデントのt検定(α = 0.05)を使用して、対照群と治療群の間で昆虫の体重を比較します。
3. 10日目に生きている幼虫と死んだ幼虫と蛹を数え、グラフ作成ソフトウェアを使用して生存率のカプランマイヤー曲線をプロットします。
4. 蛹の数を数え、与えられた式を使用して蛹化の割合を計算します。
5. 蛹化率(%)=(形成された蛹の数/幼虫の総数)x 100
6. ECI(%)=(幼虫の体重増加/食べた飼料の重量)×100の計算式を用いて、栄養指数²³の観点から幼虫の発育を比較する
   ECD(%)=(幼虫の体重増加/[食べた飼料の重量-フラスの重量])x 100
   AD (%) = ([食べた飼料の重量 - フラスの重量]/食べた飼料の重量) x 100

結果

1,000 ppmのケルセチンを含む飼料を与えた昆虫の幼虫は、対照群と比較して体重が~57%の有意な減少を示しました(図2A)。体重の減少により、ケルセチン処理された幼虫の体のサイズが小さくなりました(図2B)。対照群と比較して、ケルセチンを給餌した幼虫の摂食速度に顕著な低下が観察されました(図2C)。

?...

ディスカッション

ラボ用バイオアッセイは、結果を予測し、複数の化合物について、短期間で妥当なコストで比較毒性データを作成するのに役立ちます。摂食バイオアッセイは、昆虫-殺虫剤と昆虫-植物-殺虫剤の間の相互作用を解釈するのに役立ちます。これは、致死量50(LD₅₀)、致死濃度50(LC₅₀)、またはその他の致死濃度または用量^24,25を確立するプ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar	Himedia	RM666	Solidifying agent
Ascorbic acid	Himedia	CMS1014	Vitamin C source
Bengal Gram	NA	NA	Protein and carbohydrate source
Casein	Sigma	C-5890	Protein source
Cholesterol	Sisco Research Laboratories	34811	Fatty acid source
Choline Chloride	Himedia	GRM6824	Ammonium salt
DMSO	Sigma	67-68-5	Solvent
GraphPad Prism v8.0			https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
Methyl Paraben	Himedia	GRM1291	Antifungal agent
Multivitamin capsule	GalaxoSmithKline	NA	Vitamin source
Quercetin	Sigma	Q4951-10G	Phytochemical
Sorbic Acid	Himedia	M1880	Antimicrobail agent
Streptomycin	Himedia	CMS220	Antibiotic
Vitamin E capsule	Nukind Healthcare	NA	Vitamin E source
Yeast Extract	Himedia	RM027	Amino acid source