Mise au point d’un système d’analyse de l’alimentation pour évaluer l’effet insecticide des composés phytochimiques sur Helicoverpa armigera

Résumé

Ce protocole décrit l’essai d’alimentation obligatoire pour évaluer l’effet potentiellement toxique d’un phytochimique sur les larves d’insectes lépidoptères. Il s’agit d’un essai biologique sur les insectes hautement évolutif, facile à optimiser la dose sublétale et létale, l’activité dissuasive et l’effet physiologique. Cela pourrait être utilisé pour le criblage d’insecticides respectueux de l’environnement.

Résumé

Helicoverpa armigera, un insecte lépidoptère, est un ravageur polyphage répandu dans le monde entier. Cet insecte herbivore est une menace pour les plantes et la productivité agricole. En réponse, les plantes produisent plusieurs composés phytochimiques qui ont un impact négatif sur la croissance et la survie de l’insecte. Ce protocole démontre une méthode d’essai d’alimentation obligatoire pour évaluer l’effet d’un produit phytochimique (quercétine) sur la croissance, le développement et la survie des insectes. Dans des conditions contrôlées, les nouveau-nés ont été maintenus jusqu’au deuxième stade avec un régime artificiel prédéfini. Ces larves du deuxième stade ont été autorisées à se nourrir d’un régime artificiel témoin et contenant de la quercétine pendant 10 jours. Le poids corporel des insectes, leur stade de développement, leur poids d’excréments et leur mortalité ont été enregistrés un jour sur deux. Le changement de poids corporel, la différence dans le mode d’alimentation et les phénotypes de développement ont été évalués tout au long de la période d’essai. Le test d’alimentation obligatoire décrit simule un mode naturel d’ingestion et peut être mis à l’échelle d’un grand nombre d’insectes. Il permet d’analyser l’effet des composés phytochimiques sur la dynamique de croissance, la transition développementale et la valeur adaptative globale de H. armigera. En outre, cette configuration peut également être utilisée pour évaluer les altérations des paramètres nutritionnels et des processus de physiologie digestive. Cet article fournit une méthodologie détaillée pour l’alimentation des systèmes d’essai, qui peut avoir des applications dans les études toxicologiques, le criblage de molécules insecticides et la compréhension des effets chimiques dans les interactions plantes-insectes.

Introduction

Les facteurs biotiques qui affectent la productivité des cultures sont principalement les agents pathogènes et les ravageurs. Plusieurs insectes ravageurs sont à l’origine de 15 à 35 % des pertes de récoltes agricoles et nuisent aux pratiques de durabilité économique¹. Les insectes appartenant aux ordres des coléoptères, des hémiptères et des lépidoptères sont les principaux ordres de ravageurs dévastateurs. La nature hautement adaptative de l’environnement a aidé les lépidoptères à développer plusieurs mécanismes de survie. Parmi les lépidoptères, Helicoverpa armigera (ver de la capsule du cotonnier) peut se nourrir d’environ 180 cultures différentes et causer des dommages importants à leurs tissus reproducteurs². À l’échelle mondiale, l’infestation par H. armigera a entraîné une perte d’environ 5 milliards de dollars³. Le coton, les pois chiches, les pois d’Angole, les tomates, les tournesols et d’autres cultures sont des hôtes de H. armigera. Il complète son cycle de vie sur différentes parties des plantes hôtes. Les œufs pondus par les papillons femelles éclosent sur les feuilles, puis se nourrissent sur les tissus végétatifs pendant les stades larvaires. Le stade larvaire est le plus destructeur en raison de sa nature vorace et très adaptable ^4,5. H. armigera montre une distribution mondiale et un empiètement sur de nouveaux territoires en raison de ses attributs remarquables, tels que la polyphagie, d’excellentes capacités migratoires, une fécondité plus élevée, une forte diapause et l’émergence d’une résistance aux stratégies de lutte contre les insectes existantes⁶.

Diverses molécules chimiques provenant de terpènes, de flavonoïdes, d’alcaloïdes, de polyphénols, de glucosides cyanogènes et de bien d’autres sont largement utilisées pour le contrôle de l’infestation par H. armigera ⁷. Cependant, l’application fréquente de molécules chimiques entraîne des effets néfastes sur l’environnement et la santé humaine en raison de l’acquisition de leurs résidus. De plus, ils ont un effet néfaste sur divers prédateurs de ravageurs, ce qui entraîne un déséquilibre écologique ^8,9. Par conséquent, il est nécessaire d’étudier des options sûres et respectueuses de l’environnement pour les molécules chimiques de lutte antiparasitaire.

Les molécules insecticides naturelles produites par les plantes (composés phytochimiques) peuvent être utilisées comme une alternative prometteuse aux pesticides chimiques. Ces composés phytochimiques comprennent divers métabolites secondaires appartenant aux classes des alcaloïdes, des terpénoïdes et des composés phénoliques ^7,10. La quercétine est l’un des flavonoïdes (composé phénolique) les plus abondants présents dans divers grains, légumes, fruits et feuilles. Il montre l’activité dissuasive et insecticide de l’alimentation contre les insectes ; De plus, il n’est pas nocif pour les ennemis naturels des ravageurs^11,12. Ainsi, ce protocole démontre l’essai d’alimentation utilisant la quercétine pour évaluer son effet toxique sur H. armigera.

Diverses méthodes d’essais biologiques ont été développées pour évaluer l’effet des molécules naturelles et synthétiques sur l’alimentation, la croissance, le développement et les comportements d’un insecte¹³. Les méthodes couramment utilisées comprennent l’essai du disque foliaire, l’essai d’alimentation par choix, l’essai d’alimentation par gouttelettes, l’essai de contact, l’essai de couverture alimentaire et l’essai d’alimentation obligatoire^13,14. Ces méthodes sont classées en fonction de la façon dont les pesticides sont appliqués sur les insectes. Le test d’alimentation obligatoire est l’une des méthodes les plus couramment utilisées, sensibles, simples et adaptables pour tester les insecticides probables et leur dose létale¹⁴. Lors d’un test d’alimentation obligatoire, la molécule d’intérêt est mélangée à un régime artificiel. Cela permet d’assurer la cohérence et le contrôle de la composition de l’alimentation, générant des résultats robustes et reproductibles. Les variables importantes qui influent sur les tests d’alimentation sont le stade de développement de l’insecte, le choix de l’insecticide, les facteurs environnementaux et la taille de l’échantillon. La durée de l’essai, l’intervalle entre deux enregistrements de données, la fréquence et la quantité d’alimentation servie, la santé des insectes et l’habileté des opérateurs à manipuler peuvent également influencer le résultat des essais d’alimentation^14,15.

Cette étude vise à démontrer le test d’alimentation obligatoire pour évaluer l’effet de la quercétine sur la survie et la valeur adaptative de H. armigera . L’évaluation de divers paramètres, tels que le poids corporel des insectes, le taux de mortalité et les défauts de développement, fournira des informations sur les effets insecticides de la quercétine. Pendant ce temps, la mesure des paramètres nutritionnels, y compris l’efficacité de la conversion des aliments ingérés (ECI), l’efficacité de la conversion des aliments digérés (ECD) et la digestibilité approximative (AD), mettra en évidence les attributs anti-nutritionnels de la quercétine.

Protocole

Les larves de H. armigera ont été acquises auprès de l’ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), à Bangalore, en Inde. Au total, 21 larves du deuxième stade larvaire ont été utilisées dans le cadre de la présente étude.

1. Préparation d’un régime artificiel à base de pois chiches

REMARQUE : Une liste des ingrédients nécessaires à la préparation d’un régime artificiel est mentionnée dans le tableau 1.

1. Peser toutes les fractions séparément dans un bécher, comme indiqué dans le tableau 1, et préparer un mélange homogène à l’aide d’une spatule ou d’un agitateur magnétique.
2. Faites bouillir la fraction C à environ 100 °C à l’aide d’un micro-ondes pendant 5 minutes, ajoutez-la à la fraction A et mélangez-la soigneusement.
3. Après avoir bien mélangé, laissez la fraction mélangée refroidir un peu avant d’ajouter la fraction B (la fraction B contient des composants thermolabiles).
4. Verser dans une boîte de Pétri transparente en polystyrène de 150 mm x 150 mm.

2. Préparation d’un régime artificiel contenant de la quercétine

1. Peser la quantité appropriée (1 000 ppm) d’hydrate de quercétine (voir le tableau des matériaux) et la dissoudre correctement dans le volume minimal de solvants organiques, tels que l’éthanol (2 mg/mL), le diméthylsulfoxyde (DMSO ; 30 mg/mL) ou le diméthylformamide (DMF). Ici, le DMSO est utilisé pour dissoudre la quercétine.
2. Ajouter la quercétine dissoute dans la fraction B, puis l’ajouter au mélange des fractions A et C (le volume d’eau réduit de la fraction B est égal au volume de DMSO ajouté).
3. Ajouter un volume égal de solvant organique utilisé pour dissoudre la quercétine dans le régime témoin.
   REMARQUE : La figure 1 montre la représentation schématique de la préparation d’aliments artificiels et contenant de la quercétine.

3. Élevage et entretien de la culture de H. armigera

REMARQUE : Utilisez des matériaux nettoyés et stérilisés de manière appropriée pour l’élevage et l’entretien des insectes. Manipulez les insectes avec précaution en suivant toutes les pratiques d’exploitation normalisées liées à la stérilité et à la sécurité 16,17,18.

1. Conservez les œufs de H. armigera dans la chambre d’élevage (bocal en plastique recouvert d’une toile de mousseline) dans des conditions maintenues, comme décrit à l’étape 3.3. Ensuite, transférez délicatement les nouveau-nés nouvellement émergés à l’aide d’un pinceau fin sur un régime artificiel à base de pois chiches fraîchement préparé.
2. Utiliser un régime artificiel pour l’élevage des larves et une solution de saccharose à 20 % (p/v) avec 1 % (p/v) de multivitamines (voir le tableau des matériaux) pour les papillons adultes^19,20.
   NOTA : Comme les larves du troisième stade et les larves plus âgées de H. armigera ont tendance à cannibale, il est nécessaire d’élever chaque larve dans un flacon séparé.
3. Maintenir la température à 25 ± 1 °C et l’humidité relative à 70 % dans la salle d’élevage d’insectes, avec une photopériode de 16 h de lumière et 8 h de lumière²¹.
4. Élever une génération d’insectes en laboratoire pour l’homogénéité, puis l’utiliser pour l’analyse de l’alimentation.
5. En option, augmenter la température de la salle d’élevage d’insectes à 28 °C pour accélérer la croissance des larves et des pupes²².

4. Configuration pour le test d’alimentation

1. Prélever 21 larves de deuxième stade pour chaque ensemble (contrôle et traitement) et les tenir à l’écart de l’alimentation pendant environ 1 à 3 h.
2. Coupez le régime témoin et contenant de la quercétine en petits morceaux, notez le poids de l’alimentation administrée et le corps de l’insecte, et transférez soigneusement les insectes dans des flacons de culture. Laissez les insectes se nourrir de leur régime alimentaire respectif.
   REMARQUE : Cela doit être considéré comme le jour 0 de l’essai d’alimentation.
3. Notez le poids du corps de l’insecte, le régime alimentaire donné, le régime non consommé et les excréments un jour sur deux (jours 2, 4, 6, 8 et 10) jusqu’au 10e jour de l’analyse.
4. Après le 10e jour, continuez à les nourrir de leur alimentation respective pour observer d’autres changements développementaux et morphologiques.
   NOTA : Les changements de développement sont dus à : (1) des intermédiaires larvaires-nymphales, tels que la moitié postérieure du corps des pupes avec des taches de cuticules larvaires, une capsule céphalique et des pattes thoraciques ; (2) prénymphes avec un corps complètement noirci ; (3) pupes sous-dimensionnées avec rétrécissement du corps ; (4) Papillons de nuit intermédiaires avec l’ancienne peau nymphale. Les changements morphologiques comprennent des papillons adultes malformés avec des corps anormaux, des ailes tordues et des pattes articulées. Ces changements sont ensuite comparés à ceux d’insectes nourris avec le régime témoin.
5. Congeler les insectes au jour 10 si l’étude des défauts de développement et morphologiques n’est pas nécessaire.
   REMARQUE : Avant de congeler les larves, elles doivent être privées de nourriture pendant au moins 3 heures pour éliminer la nourriture résiduelle du tube digestif.

5. Enregistrement et analyse des données

1. Dans le logiciel GraphPad Prism (voir Tableau des matériaux), choisissez une table de données XY dans la boîte de dialogue « Bienvenue ou Nouvelle table », et entrez le nombre d’insectes qui répliquent les valeurs côte à côte dans les sous-colonnes. Ensuite, donnez le nom du titre à l’axe des abscisses en tant que nombre de jours, et dans les groupes A et B, donnez le nom du titre en tant que contrôle et traitement à la quercétine, respectivement. Mettez le poids corporel de chaque insecte sous contrôle et traitement pour générer le graphique du poids corporel.
   REMARQUE : L’analyse dans GraphPad peut varier en fonction de la taille de l’échantillon et du nombre de traitements.
2. Comparez le poids corporel des insectes entre le groupe témoin et le groupe de traitement à l’aide d’un test t de Student (α = 0,05).
3. Comptez les larves et les pupes vivantes et mortes au jour 10 pour tracer une courbe de Kaplan-Meier pour le pourcentage de survie à l’aide du logiciel graphique.
4. Comptez le nombre de pupes et calculez le pourcentage de nymphose à l’aide de la formule donnée :
5. Pourcentage de nymphose (%) = (nombre de pupes formées/nombre total de larves) x 100
6. Comparez le développement larvaire en termes d’indices nutritionnels²³ à l’aide des formules suivantes, ECI (%) = (gain de poids des larves/poids des aliments consommés) x 100
   DPE (%) = (gain de poids des larves/[poids de l’aliment consommé - poids des excréments]) x 100
   DA (%) = ([poids de l’aliment consommé - poids des excréments]/poids de l’aliment consommé) x 100

Résultats

Les larves d’insectes nourries avec un régime contenant 1 000 ppm de quercétine ont montré une diminution significative du poids corporel de ~57 % par rapport au groupe témoin (Figure 2A). La réduction du poids corporel a entraîné une réduction de la taille corporelle des larves traitées à la quercétine (figure 2B). Une réduction notable a été observée dans le taux d’alimentation des larves nourries à la quercétine par rapport au témoin (

Discussion

Les essais biologiques en laboratoire sont utiles pour prédire les résultats et produire des données comparatives sur la toxicité de plusieurs composés dans un court laps de temps et à un coût raisonnable. Le bioessai d’alimentation permet d’interpréter les interactions entre insecticide et insecticide insecte plante. Il s’agit d’une méthode efficace de mesure de la toxicité d’une variété de substances qui simplifie considérablement le processus d’établissement de la dose létale 50 (DL₅₀

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar	Himedia	RM666	Solidifying agent
Ascorbic acid	Himedia	CMS1014	Vitamin C source
Bengal Gram	NA	NA	Protein and carbohydrate source
Casein	Sigma	C-5890	Protein source
Cholesterol	Sisco Research Laboratories	34811	Fatty acid source
Choline Chloride	Himedia	GRM6824	Ammonium salt
DMSO	Sigma	67-68-5	Solvent
GraphPad Prism v8.0			https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
Methyl Paraben	Himedia	GRM1291	Antifungal agent
Multivitamin capsule	GalaxoSmithKline	NA	Vitamin source
Quercetin	Sigma	Q4951-10G	Phytochemical
Sorbic Acid	Himedia	M1880	Antimicrobail agent
Streptomycin	Himedia	CMS220	Antibiotic
Vitamin E capsule	Nukind Healthcare	NA	Vitamin E source
Yeast Extract	Himedia	RM027	Amino acid source