Helicoverpa armigera에 대한 Phytochemicals의 살충 효과를 평가하기 위한 공급 분석 시스템 개발

요약

이 프로토콜은 나비목 곤충 유충에 대한 식물 화학 물질의 잠재적 독성 효과를 평가하기 위한 의무 섭식 분석을 설명합니다. 이것은 확장성이 뛰어난 곤충 생물 검정으로 치사 및 치사 용량, 억제 활동 및 생리학적 효과를 쉽게 최적화할 수 있습니다. 이것은 친환경 살충제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

나비목 곤충인 Helicoverpa armigera는 전 세계에 분포하는 다식성 해충입니다. 이 초식성 곤충은 식물과 농업 생산성에 위협이 됩니다. 이에 대응하여 식물은 곤충의 성장과 생존에 부정적인 영향을 미치는 여러 가지 식물 화학 물질을 생산합니다. 이 프로토콜은 곤충의 성장, 발달 및 생존에 대한 식물 화학 물질(퀘르세틴)의 영향을 평가하기 위한 의무 섭식 분석 방법을 보여줍니다. 통제된 조건 하에서, 신생아들은 미리 정의된 인공 식단으로 두 번째 인스타까지 유지되었다. 이 두 번째 인스타 유충은 10일 동안 대조군과 퀘르세틴이 함유된 인공 식단을 먹도록 허용되었습니다. 곤충의 체중, 발달 단계, 프라스 체중 및 사망률은 격일로 기록되었습니다. 체중의 변화, 섭식 패턴의 차이 및 발달 표현형은 분석 시간 동안 평가되었습니다. 설명된 필수 섭식 분석은 자연적인 섭취 모드를 시뮬레이션하며 많은 수의 곤충으로 확장할 수 있습니다. 이를 통해 H. armigera의 성장 역학, 발달 전환 및 전반적인 적합성에 대한 식물 화학 물질의 영향을 분석할 수 있습니다. 또한 이 설정은 영양 매개변수 및 소화 생리학 과정의 변화를 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 독성 연구, 살충 분자 스크리닝 및 식물-곤충 상호 작용의 화학적 영향 이해에 적용할 수 있는 사료 분석 시스템에 대한 자세한 방법론을 제공합니다.

서문

작물 생산성에 영향을 미치는 생물적 요인은 주로 병원체와 해충입니다. 여러 해충은 농작물 손실의 15%에서 35%를 유발하고 경제적 지속 가능성 관행에 영향을 미칩니다¹. 딱정벌레목(Coleoptera), 반구목(Hemiptera), 나비목(Lepidoptera)에 속하는 곤충은 파괴적인 해충의 주요 목입니다. 환경의 고도의 적응력은 나비목이 여러 생존 메커니즘을 진화시키는 데 도움이 되었습니다. 나비목(lepidopteran) 곤충 중 헬리코베파 아미게라(Helicoverpa armigera)는 약 180종의 작물을 먹고 생식 조직에 심각한 손상을 입힐 수 있다². 전 세계적으로 H. armigera 감염으로 인해 약 50억 달러의 손실이 발생했습니다³. 목화, 병아리콩, 비둘기 완두콩, 토마토, 해바라기 및 기타 작물은 H. armigera의 숙주입니다. 호스트 식물의 여러 부분에서 수명 주기를 완료합니다. 암컷 나방이 낳은 알은 잎에서 부화한 다음 유충 단계에서 식물 조직을 먹습니다. 유충 단계는 탐욕스럽고 적응력이 뛰어나기 때문에 가장 파괴적입니다 ^4,5. H. armigera는 다식성, 뛰어난 이동 능력, 높은 번식력, 강한 분열, 기존 곤충 방제 전략에 대한 저항력의 출현과 같은 놀라운 특성으로 인해 전 세계적으로 분포하고 새로운 영역에 대한 잠식을 보여줍니다⁶.

테르펜, 플라보노이드, 알칼로이드, 폴리페놀, 시아노겐 글루코시드 등 다양한 화학 분자가 H. armigera 감염 방제에 널리 사용된다⁷. 그러나 화학 분자를 자주 적용하면 잔류물이 획득되어 환경과 인체 건강에 악영향을 미칩니다. 또한 다양한 해충 포식자에게 해로운 영향을 미쳐 생태 불균형을 초래합니다 ^8,9. 따라서 해충 방제의 화학 분자에 대한 안전하고 친환경적인 옵션을 조사할 필요가 있습니다.

식물에서 생산되는 천연 살충 분자(파이토케미컬)는 화학 살충제의 유망한 대안으로 사용될 수 있습니다. 이러한 식물 화학 물질에는 알칼로이드, 테르 페 노이드 및 페놀 ^7,10 클래스에 속하는 다양한 2 차 대사 산물이 포함됩니다. 퀘르세틴은 다양한 곡물, 채소, 과일 및 잎에 존재하는 가장 풍부한 플라보노이드(페놀 화합물) 중 하나입니다. 그것은 곤충에 대한 먹이 억제 및 살충 활동을 보여줍니다. 또한 해충^11,12의 천적에게 해롭지 않습니다. 따라서 이 프로토콜은 H. armigera에 대한 독성 효과를 평가하기 위해 퀘르세틴을 사용한 수유 분석을 보여줍니다.

곤충의 섭식, 성장, 발달 및 행동 패턴에 대한 천연 및 합성 분자의 영향을 평가하기 위해 다양한 생물학적 분석 방법이 개발되었습니다¹³. 일반적으로 사용되는 방법에는 잎 디스크 분석, 선택 공급 분석, 액적 공급 분석, 접촉 분석, 다이어트 커버링 분석 및 의무 공급 분석^13,14가 포함됩니다. 이러한 방법은 살충제가 곤충에 적용되는 방식에 따라 분류됩니다. 의무 섭식 분석법은 가능한 살충제와 그 치사량을 시험하기 위해 가장 일반적으로 사용되고, 민감하고, 간단하고, 적응 가능한 방법 중 하나이다¹⁴. 의무 섭식 분석에서 관심 분자는 인공 식단과 혼합됩니다. 이것은 식단 구성에 대한 일관성과 제어를 제공하여 강력하고 재현 가능한 결과를 생성합니다. 사료 분석에 영향을 미치는 중요한 변수는 곤충의 발달 단계, 살충제 선택, 환경 요인 및 샘플 크기입니다. 분석 기간, 두 데이터 기록 사이의 간격, 먹이는 사료의 빈도 및 양, 곤충의 건강 및 작업자의 취급 기술 또한 먹이 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다^14,15.

이 연구는 H. armigera 생존 및 체력에 대한 퀘르세틴의 효과를 평가하기 위한 의무 섭식 분석을 입증하는 것을 목표로 합니다. 곤충 체중, 사망률 및 발달 결함과 같은 다양한 매개변수의 평가는 퀘르세틴의 살충 효과에 대한 통찰력을 제공합니다. 한편, 섭취된 음식의 전환 효율(ECI), 소화된 음식의 전환 효율(ECD) 및 대략적인 소화율(AD)을 포함한 영양 매개변수를 측정하면 퀘르세틴의 항수유 특성이 강조됩니다.

프로토콜

H. armigera 유충은 인도 방갈로르에 있는 ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources(NBAIR)에서 획득했습니다. 본 연구에는 총 21초의 인스타 유충이 사용되었다.

1. 병아리콩 기반 인공 식단 준비

참고: 인공 식단을 준비하는 데 필요한 성분 목록은 표 1에 언급되어 있습니다.

1. 표 1에 나열된 대로 비커에서 모든 분획을 개별적으로 칭량하고 주걱/자석 교반기를 사용하여 균질한 혼합물을 준비합니다.
2. 분획 C를 약 100°C에서 전자레인지를 사용하여 5분 동안 끓인 후 분획 A에 넣고 잘 섞습니다.
3. 완전히 혼합한 후 혼합 분획을 약간 식힌 후 분획 B를 추가합니다(분획 B에는 열 불안정성 성분이 포함되어 있음).
4. 투명한 폴리스티렌 150mm x 150mm 페트리 접시에 붓습니다.

2. 퀘르세틴 함유 인공 식단의 준비

1. 적절한 양(1,000ppm)의 퀘르세틴 수화물( 재료 표 참조)을 칭량하고 에탄올(2mg/mL), 디메틸 설폭사이드(DMSO, 30mg/mL) 또는 디메틸 포름아미드(DMF)와 같은 최소 부피의 유기 용매에 적절하게 용해시킵니다. 여기서, DMSO는 퀘르세틴을 용해시키는 데 사용된다.
2. 용해된 퀘르세틴을 분획 B에 첨가한 다음 분획 A와 C의 혼합물에 첨가합니다(분획 B에서 감소된 물의 부피는 첨가된 DMSO의 부피와 동일).
3. 퀘르세틴을 용해하는 데 사용되는 동일한 양의 유기 용매를 대조 식단에 첨가하십시오.
   참고: 그림 1 은 인공 및 퀘르세틴 함유 식단을 준비하는 개략도를 보여줍니다.

3. H. armigera 배양물의 사육 및 유지

알림: 곤충 사육 및 유지 관리를 위해 적절하게 세척 및 멸균된 재료를 사용하십시오. 모든 멸균 및 안전 관련 표준 운영 관행 16,17,18에 따라 곤충을 조심스럽게 다루십시오.

1. H. armigera 알을 번식실(모슬린 천으로 덮인 플라스틱 병)에 3.3단계에 설명된 대로 상태를 유지하여 보관합니다. 그런 다음 갓 태어난 신생아를 갓 준비한 병아리콩 기반 인공 사료에 가는 붓을 사용하여 부드럽게 옮깁니다.
2. 유충을 기르기 위해 인공 식단을 사용하고 성인 나방의 경우 20 % (w / v) 종합 비타민이 함유 된 1 % (w / v) 자당 용액 (재료 표 참조)을 사용하십시오^19,20.
   참고: H. armigera 의 세 번째 이상 인스타 유충은 식인 경향을 보이기 때문에 각 유충을 별도의 유리병에 보관해야 합니다.
3. 곤충 배양실에서 온도를 25± 1°C, 상대습도를 70%로 유지하고, 16시간 광주기:8시간 어두운 광주기²¹.
4. 균질성을 위해 실험실에서 한 세대의 곤충을 사육한 다음 먹이 분석에 사용합니다.
5. 선택적으로 곤충 배양실의 온도를 28°C로 높여 유충과 번데기²²의 성장 속도를 높입니다.

4. 공급 분석을 위한 설정

1. 각 세트(대조군 및 치료)에 대해 21초 인스타 유충을 수집하고 약 1-3시간 동안 식단에서 멀리 유지합니다.
2. 대조군과 퀘르세틴 함유 사료를 작은 조각으로 자르고 주어진 사료의 무게와 곤충의 몸을 기록하고 곤충을 배양 바이알에 조심스럽게 옮깁니다. 곤충이 각각의 식단을 먹도록 하십시오.
   알림: 이것은 수유 분석의 0일로 간주되어야 합니다.
3. 곤충 몸의 무게, 주어진 식단, 먹지 않은 식단 및 frass를 분석 10일째까지 격일(2, 4, 6, 8, 10일)에 기록합니다.
4. 10일째 이후에는 각각의 식단을 계속 먹으면서 추가적인 발달 및 형태학적 변화를 관찰합니다.
   참고 : 발달 변화 : (1) 유충 큐티클 패치가있는 번데기의 뒤쪽 반쪽 몸체, 머리 캡슐 및 흉부 다리와 같은 유충-번데기 중간체; (2) 몸이 완전히 검게 변한 번데기; (3) 몸 수축이 있는 크기가 작은 번데기; (4) 번데기 나방 중간체 - 오래된 번데기 피부를 가진 나방. 형태학적 변화에는 비정상적인 몸, 뒤틀린 날개, 관절이 있는 다리를 가진 기형 나방 성충이 포함됩니다. 그런 다음 이러한 변화를 대조 식단을 먹은 곤충과 비교합니다.
5. 발달 및 형태학적 결함에 대한 연구가 필요하지 않은 경우 10일째에 곤충을 동결합니다.
   알림: 유충을 얼리기 전에 소화관에서 잔류 식단을 제거하기 위해 최소 3시간 동안 식단을 박탈해야 합니다.

5. 데이터 기록 및 분석

1. GraphPad Prism 소프트웨어( 재료 테이블 참조)의 "시작 또는 새 테이블" 대화상자에서 XY 데이터 테이블을 선택하고 해당 하위 열에 값을 나란히 반복하는 곤충 수를 입력합니다. 그런 다음 X축에 제목 이름을 일 수로 지정하고 그룹 A와 B에서 각각 대조군 과 퀘르세틴 처리로 제목 이름을 지정합니다. 각 곤충의 체중을 통제하고 처리하여 체중 그래프를 생성합니다.
   참고: GraphPad에서의 분석은 표본 크기와 처리 횟수에 따라 달라질 수 있습니다.
2. 학생 t-검정(α = 0.05)을 사용하여 대조군과 치료군 간의 곤충 체중을 비교합니다.
3. 10일째에 살아 있는 유충과 죽은 유충과 번데기를 세어 그래프 소프트웨어를 사용하여 생존율에 대한 Kaplan-Meier 곡선을 그립니다.
4. 번데기의 수를 세고 주어진 공식을 사용하여 번데기의 백분율을 계산하십시오.
5. 번데기 비율(%) = (형성된 번데기 수/총 유충 수) x 100
6. 다음 공식을 사용하여 영양 지수²³ 측면에서 유충 발달을 비교합니다. ECI (%) = (유충의 체중 증가 / 먹은 사료의 무게) x 100
   ECD(%) = (유충의 체중 증가/[먹은 사료의 무게 - 배설물의 무게]) x 100
   AD (%) = ([먹은 사료의 무게 - 프래스의 무게]/먹은 사료의 무게) x 100

결과

1,000ppm의 퀘르세틴을 함유한 식단을 먹은 곤충 유충은 대조군에 비해 체중이 ~57% 크게 감소했습니다(그림 2A). 체중의 감소는 퀘르세틴으로 처리된 유충의 몸 크기를 감소시키는 결과를 가져왔다(그림 2B). 대조군에 비해 퀘르세틴을 먹인 유충의 섭식 속도가 눈에 띄게 감소하는 것이 관찰되었습니다(그림 2C).

?...

토론

실험실 생물학적 분석은 합리적인 비용으로 단기간에 결과를 예측하고 여러 화합물에 대한 비교 독성 데이터를 생성하는 데 유용합니다. 먹이 생물학적 분석은 곤충-살충제와 곤충-식물-살충제 사이의 상호 작용을 해석하는 데 도움이 됩니다. 이는 치사량(50)(LD₅₀), 치사량(50)(LC₅₀) 또는 임의의 다른 치사량 또는 선량^(24,25)을 설정하는 과?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar	Himedia	RM666	Solidifying agent
Ascorbic acid	Himedia	CMS1014	Vitamin C source
Bengal Gram	NA	NA	Protein and carbohydrate source
Casein	Sigma	C-5890	Protein source
Cholesterol	Sisco Research Laboratories	34811	Fatty acid source
Choline Chloride	Himedia	GRM6824	Ammonium salt
DMSO	Sigma	67-68-5	Solvent
GraphPad Prism v8.0			https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
Methyl Paraben	Himedia	GRM1291	Antifungal agent
Multivitamin capsule	GalaxoSmithKline	NA	Vitamin source
Quercetin	Sigma	Q4951-10G	Phytochemical
Sorbic Acid	Himedia	M1880	Antimicrobail agent
Streptomycin	Himedia	CMS220	Antibiotic
Vitamin E capsule	Nukind Healthcare	NA	Vitamin E source
Yeast Extract	Himedia	RM027	Amino acid source