Desenvolvimento de um Sistema de Ensaio Alimentar para Avaliação do Efeito Inseticida de Fitoquímicos sobre Helicoverpa armigera

Resumo

Este protocolo descreve o ensaio alimentar obrigatório para avaliar o efeito potencialmente tóxico de um fitoquímico sobre as larvas de insetos lepidópteros. Este é um bioensaio de insetos altamente escalável, fácil de otimizar a dose subletal e letal, atividade dissuasora e efeito fisiológico. Isso poderia ser usado para a triagem de inseticidas ecológicos.

Resumo

Helicoverpa armigera, um inseto lepidóptero, é uma praga polífaga com distribuição mundial. Este inseto herbívoro é uma ameaça às plantas e à produtividade agrícola. Em resposta, as plantas produzem vários fitoquímicos que impactam negativamente o crescimento e a sobrevivência do inseto. Este protocolo demonstra um método de ensaio alimentar obrigatório para avaliar o efeito de um fitoquímico (quercetina) sobre o crescimento, desenvolvimento e sobrevivência de insetos. Sob condições controladas, os neonatos foram mantidos até o segundo ínstar em dieta artificial pré-definida. Essas larvas de segundo ínstar foram autorizadas a se alimentar de uma dieta artificial controle e contendo quercetina por 10 dias. O peso corporal dos insetos, o estágio de desenvolvimento, o peso do frass e a mortalidade foram registrados em dias alternados. A mudança no peso corporal, a diferença no padrão alimentar e fenótipos de desenvolvimento foram avaliados ao longo do tempo de ensaio. O ensaio alimentar obrigatório descrito simula um modo natural de ingestão e pode ser escalado para um grande número de insetos. Permite analisar o efeito de fitoquímicos na dinâmica de crescimento, transição de desenvolvimento e aptidão geral de H. armigera. Além disso, esse arranjo também pode ser utilizado para avaliar alterações em parâmetros nutricionais e processos fisiológicos digestivos. Este artigo fornece uma metodologia detalhada para sistemas de ensaio de alimentação, que pode ter aplicações em estudos toxicológicos, triagem de moléculas inseticidas e compreensão de efeitos químicos em interações planta-inseto.

Introdução

Os fatores bióticos que afetam a produtividade das culturas são principalmente agentes patogênicos e pragas. Vários insetos-praga causam de 15% a 35% das perdas nas culturas agrícolas e afetam as práticas de sustentabilidade econômica¹. Insetos pertencentes às ordens Coleoptera, Hemiptera e Lepidoptera são as principais ordens de pragas devastadoras. A natureza altamente adaptativa do ambiente tem beneficiado os lepidópteros na evolução de vários mecanismos de sobrevivência. Dentre os insetos lepidópteros, Helicoverpa armigera (Cotton bollworm) pode se alimentar de cerca de 180 culturas diferentes e causar danos significativos aos seus tecidos reprodutivos². Em todo o mundo, a infestação por H. armigera resultou em uma perda de cerca de US$ 5 bilhões³. Algodão, grão-de-bico, feijão guandu, tomate, girassol e outras culturas são hospedeiros de H. armigera. Ele completa seu ciclo de vida em diferentes partes das plantas hospedeiras. Ovos postos por mariposas fêmeas eclodem nas folhas, seguindo-se de sua alimentação em tecidos vegetativos durante os estágios larvais. A fase larval é a mais destrutiva devido à sua natureza voraz e altamente^{adaptável4,5}. H. armigera apresenta distribuição global e invasão de novos territórios devido a seus atributos marcantes, como polifagia, excelentes habilidades migratórias, maior fecundidade, forte diapausa e surgimento de resistência às estratégias de controle de insetos existentes⁶.

Diversas moléculas químicas provenientes de terpenos, flavonoides, alcaloides, polifenóis, glicosídeos cianogênicos e muitos outros são amplamente utilizadas para o controle da infestação por H. armigera ⁷. No entanto, a aplicação frequente de moléculas químicas acarreta efeitos adversos ao meio ambiente e à saúde humana devido à aquisição de seus resíduos. Além disso, apresentam efeito prejudicial sobre vários predadores de pragas, resultando em desequilíbrio ecológico ^8,9. Portanto, há necessidade de investigar opções seguras e ecologicamente corretas para moléculas químicas de controle de pragas.

Moléculas inseticidas naturais produzidas por plantas (fitoquímicos) podem ser usadas como uma alternativa promissora aos pesticidas químicos. Esses fitoquímicos incluem vários metabólitos secundários pertencentes às classes alcaloides, terpenóides e fenólicos ^7,10. A quercetina é um dos flavonoides (compostos fenólicos) mais abundantes presentes em vários grãos, vegetais, frutas e folhas. Apresenta atividade dissuasora alimentar e inseticida contra insetos; Além disso, não é prejudicial aos inimigos naturais de pragas^11,12. Assim, este protocolo demonstra o ensaio alimentar utilizando quercetina para avaliar seu efeito tóxico sobre H. armigera.

Vários métodos de bioensaio têm sido desenvolvidos para avaliar o efeito de moléculas naturais e sintéticas sobre a alimentação, crescimento, desenvolvimento e padrões comportamentais de um inseto¹³. Os métodos comumente utilizados incluem o ensaio de disco foliar, ensaio de escolha alimentar, ensaio de alimentação por gotículas, ensaio de contato, ensaio de cobertura de dieta e ensaio de alimentação obrigatória^13,14. Esses métodos são classificados com base em como os pesticidas são aplicados aos insetos. O ensaio alimentar obrigatório é um dos métodos mais comumente utilizados, sensíveis, simples e adaptáveis para testar prováveis inseticidas e sua dose letal¹⁴. Em um ensaio de alimentação obrigatória, a molécula de interesse é misturada com uma dieta artificial. Isso proporciona consistência e controle sobre a composição da dieta, gerando resultados robustos e reprodutíveis. Variáveis importantes que afetam os ensaios alimentares são o estágio de desenvolvimento do inseto, a escolha do inseticida, fatores ambientais e tamanho da amostra. A duração do ensaio, o intervalo entre dois registros de dados, a frequência e a quantidade de dieta alimentada, a saúde dos insetos e a habilidade de manuseio dos operadores também podem influenciar o resultado dos ensaios alimentares ^14,15.

Este estudo tem como objetivo demonstrar o ensaio de obrigatoriedade alimentar para avaliar o efeito da quercetina na sobrevivência e aptidão física de H. armigera . A avaliação de vários parâmetros, como peso corporal do inseto, taxa de mortalidade e defeitos de desenvolvimento, fornecerá informações sobre os efeitos inseticidas da quercetina. Enquanto isso, a mensuração de parâmetros nutricionais, incluindo a eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI), eficiência de conversão do alimento digerido (ECD) e digestibilidade aproximada (AD), destacará os atributos antialimentares da quercetina.

Protocolo

Larvas de H. armigera foram adquiridas do ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), Bangalore, Índia. Um total de 21 larvas de segundo estádio foi utilizado para o presente estudo.

1. Preparação de dieta artificial à base de grão-de-bico

NOTA: Uma lista de ingredientes necessários para preparar uma dieta artificial é mencionada na Tabela 1.

1. Pesar todas as fracções separadamente num copo, tal como indicado no quadro 1, e preparar uma mistura homogénea utilizando uma espátula/agitador magnético.
2. Ferva a Fração C a cerca de 100 °C usando um micro-ondas por 5 min, adicione à Fração A e misture bem.
3. Depois de misturar completamente, deixe a fração mista esfriar um pouco antes de adicionar a Fração B (a Fração B contém componentes termolábeis).
4. Despeje em uma placa de Petri transparente, de poliestireno, 150 mm x 150 mm.

2. Preparação de dieta artificial contendo quercetina

1. Pesar a quantidade adequada (1.000 ppm) de hidrato de quercetina (ver Tabela de Materiais) e dissolvê-la adequadamente no volume mínimo de solventes orgânicos, como etanol (2 mg/mL), dimetilsulfóxido (DMSO; 30 mg/mL) ou dimetilformamida (DMF). Aqui, DMSO é usado para dissolver quercetina.
2. Adicionar quercetina dissolvida na Fração B, seguida de adição na mistura das Frações A e C (o volume de água reduzido da Fração B é igual ao volume de DMSO adicionado).
3. Adicione um volume igual de solvente orgânico usado para dissolver a quercetina na dieta controle.
   NOTA: A Figura 1 mostra a representação esquemática do preparo de dietas artificiais e contendo quercetina.

3. Criação e manutenção da cultura de H. armigera

OBS: Utilizar materiais adequadamente limpos e esterilizados para criação e manutenção de insetos. Manusear os insetos cuidadosamente, seguindo todas as práticas operacionais padrão relacionadas à esterilidade e segurança 16,17,18.

1. Manter os ovos de H. armigera na câmara de reprodução (frasco plástico coberto com pano de musselina nas condições de manutenção, conforme descrito na etapa 3.3. Em seguida, transfira suavemente neonatos recém-surgidos usando um pincel fino em uma dieta artificial à base de grão-de-bico recém-preparada.
2. Utilizar dieta artificial para criação das larvas e solução de sacarose a 20% (p/v) com multivitamínico a 1% (p/v) (ver Tabela de Materiais) para mariposas adultas^19,20.
   NOTA: Como as larvas de terceiro e mais velho ínstar de H. armigera apresentam uma tendência canibalística, é necessário criar cada larva em um frasco separado.
3. Manter a temperatura de 25 ± 1 °C e umidade relativa do ar de 70% na sala de cultivo de insetos, com fotoperíodo de 16 h claro:8 h escuro²¹.
4. Criar uma geração de insetos no laboratório para homogeneidade e, em seguida, usá-lo para o ensaio de alimentação.
5. Opcionalmente, aumentar a temperatura da sala de cultivo de insetos para 28 °C para acelerar o crescimento de larvas e pupas²².

4. Configuração para o ensaio de alimentação

1. Coletar larvas de 21 segundos ínstares para cada conjunto (controle e tratamento) e mantê-las longe da dieta, por aproximadamente 1-3 h.
2. Corte a dieta controle e contendo quercetina em pequenos pedaços, registre o peso da dieta dada e o corpo do inseto e transfira cuidadosamente os insetos para frascos de cultura. Permita que os insetos se alimentem da respectiva dieta.
   NOTA: Isso deve ser considerado como o Dia 0 do ensaio de alimentação.
3. Registre o peso do corpo do inseto, dada dieta, dieta não consumida e frass em dias alternados (Dias 2, 4, 6, 8 e 10) até o 10º dia de ensaio.
4. Após o 10º dia, mantê-los se alimentando de sua respectiva dieta para observar novas mudanças de desenvolvimento e morfológicas.
   OBS: As alterações de desenvolvimento por meio de: (1) intermediários larval-pupa, como a metade posterior da pupa com retalhos de cutícula larval, cápsula cefálica e pernas torácicas; (2) pré-pupas com corpo completamente enegrecido; (3) pupas subdimensionadas com encolhimento corporal; (4) mariposas-pupas intermediárias-mariposas com a pele pupal velha. As alterações morfológicas incluem adultos malformados de mariposas com corpos anormais, asas torcidas e pernas articuladas. Essas mudanças são então comparadas com insetos alimentados com a dieta controle.
5. Congelar os insetos no dia 10 se o estudo de defeitos de desenvolvimento e morfológicos não for necessário.
   NOTA: Antes de congelar as larvas, elas precisam ser mantidas privadas da dieta por pelo menos 3 h para remover a dieta residual do trato digestivo.

5. Registro e análise dos dados

1. No software GraphPad Prism (consulte Tabela de Materiais), escolha uma tabela de dados XY na caixa de diálogo "Bem-vindo ou Nova Tabela" e, nela, insira o número de insetos que replicam valores lado a lado nas subcolunas. Em seguida, dê o nome do título ao eixo X como número de dias e, nos grupos A e B, dê o nome do título como controle e tratamento com quercetina, respectivamente. Coloque o peso corporal de cada inseto sob controle e tratamento para gerar o gráfico de peso corporal.
   NOTA: A análise no GraphPad pode variar de acordo com o tamanho da amostra e o número de tratamentos.
2. Comparar o peso corporal do inseto entre os grupos controle e tratamento usando o teste t de Student (α = 0,05).
3. Conte as larvas e pupas vivas e mortas no Dia 10 para traçar uma curva de Kaplan-Meier para porcentagem de sobrevivência usando o software gráfico.
4. Conte o número de pupas e calcule a porcentagem de pupação usando a fórmula dada:
5. Porcentagem de pupação (%) = (número de pupas formadas/número total de larvas) x 100
6. Comparar o desenvolvimento larval em termos de índices nutricionais²³ utilizando as seguintes fórmulas, ICE (%) = (ganho de peso das larvas/peso da ração ingerida) x 100
   DCE (%) = (ganho de peso das larvas/[peso da ração ingerida - peso do frass]) x 100
   DA (%) = ([peso da ração consumida - peso da ração]/peso da ração ingerida) x 100

Resultados

Larvas de insetos alimentadas com uma dieta contendo 1.000 ppm de quercetina apresentaram uma diminuição significativa no peso corporal de ~57% em relação ao grupo controle (Figura 2A). A redução do peso corporal resultou na redução do tamanho corporal das larvas tratadas com quercetina (Figura 2B). Uma notável redução foi observada na taxa de alimentação das larvas alimentadas com quercetina em relação ao controle (Figura 2C<...

Discussão

Bioensaios laboratoriais são úteis para prever desfechos e produzir dados comparativos de toxicidade de vários compostos em um curto período a um custo razoável. O bioensaio alimentar ajuda a interpretar as interações entre inseto-inseticida e inseto-planta-inseticida. É um método eficiente para medir a toxicidade de uma variedade de substâncias que simplifica significativamente o processo de estabelecimento da dose letal 50 (DL₅₀), concentração letal 50 (CL₅₀), ou qualquer outra concent...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar	Himedia	RM666	Solidifying agent
Ascorbic acid	Himedia	CMS1014	Vitamin C source
Bengal Gram	NA	NA	Protein and carbohydrate source
Casein	Sigma	C-5890	Protein source
Cholesterol	Sisco Research Laboratories	34811	Fatty acid source
Choline Chloride	Himedia	GRM6824	Ammonium salt
DMSO	Sigma	67-68-5	Solvent
GraphPad Prism v8.0			https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
Methyl Paraben	Himedia	GRM1291	Antifungal agent
Multivitamin capsule	GalaxoSmithKline	NA	Vitamin source
Quercetin	Sigma	Q4951-10G	Phytochemical
Sorbic Acid	Himedia	M1880	Antimicrobail agent
Streptomycin	Himedia	CMS220	Antibiotic
Vitamin E capsule	Nukind Healthcare	NA	Vitamin E source
Yeast Extract	Himedia	RM027	Amino acid source