極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

要約

このプロトコールは、 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)を例に、サンプル調製の最適化を通じて不均一な粒子分布に対処する実用的な方法を提示し、研究者が極低温電子顕微鏡(クライオEM)を使用して高分子構造を効率的に解明するための参考資料を提供します。

要約

極低温電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)は、ガラス質の氷に懸濁した天然に近い条件での高分子構造の研究を可能にすることにより、構造生物学に革命をもたらしました。この技術により、結晶化を必要とせずにタンパク質やその他の生体分子を高解像度で可視化することが可能となり、その機能とメカニズムについて重要な洞察を得ることができます。近年の単粒子解析の進歩と計算データ処理の改良により、クライオ電子顕微鏡は現代の構造生物学において不可欠なツールとなっています。クライオ電子顕微鏡は、その採用が進んでいるにもかかわらず、その有効性を制限する可能性のある永続的な課題、特に粒子分布の不均一さに直面しています。この問題は、多くの場合、再構築されたタンパク質構造の分解能の低下や精度の低下につながります。この記事では、 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)由来の小さな熱ショックタンパク質を例に、この課題に対処するためのシンプルで実用的なアプローチを概説します。この分析法は、サンプル調製を最適化して優先的な吸着を最小限に抑え、より均一な粒子分布と高品質のタンパク質クライオ電子顕微鏡構造を確保します。この手法は、構造研究における同様の課題の克服を目指す研究者にとって貴重なガイダンスを提供します。

概要

装置ハードウェア^1,2と画像処理ソフトウェア^3,4,5の最近の進歩により、極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、現代の構造生物学において人気があり強力なツールとして浮上しています。これらのブレークスルーにもかかわらず、クライオ電子顕微鏡を使用して高分解能の高分子構造を実現するには、依然としてボトルネックがあります。そのような重要な課題の1つは、主に空気-水界面^6,7,8,9で観察される配向選好現象を含む不均一な粒子分布である。

サンプルのガラス化中、一部の分子はグリッド上の特定の軸に沿って整列する傾向を示します。これにより、最終データセットのパーティクル ビューの分布が不均一になります。特定の配向性が過大評価され、他の配向性が過小評価されたり、完全に欠落したりする可能性があり、その結果、タンパク質全体の構造が不完全になります。電子ビームに優先的に配向されたタンパク質の領域は、密度マップでより顕著に見えるが、ビームから離れた方向に向けられた領域は、分解が不十分であるか、完全に欠落している可能性がある^10,11。その結果、粒子分布が不均一になると、最終的に再構築された3次元(3D)構造に潜在的なバイアスやアーティファクトが生じます。特に、アルファヘリックスやベータシートなどの主要な構造要素が歪んだり、アミノ酸やヌクレオチド鎖が断片化して見えたり、特定のタンパク質や核酸セグメントの密度が歪みを示すことがあります¹²。最終的に、これらの虚偽表示は、生体分子の構造と機能を正確に解明するための大きな課題を提起します。

このような課題を克服するために、現在、試料調製の最適化^13、14、15、グリッド処理^{16、17、18、19、20、21、22}、およびデータ収集戦略²³を含む、様々な実験的アプローチが使用されている。特に、可能な限りサンプル調製段階で課題に対処することをお勧めします⁷。サンプル調製における一般的な最適化には、バッファー組成の変更、低分子または高分子の結合パートナーの導入、分子内架橋の生成、界面活性剤の変更などがあります。これは膜タンパク質^24,25にも当てはまりますが、界面活性剤は特に精製および安定化の目的で使用する必要があります。その中でも、タンパク質バッファーの最適化は、カスタマイズ性、費用対効果、および広範なアクセス性を備えているため、ほとんどのラボで好まれる戦略となっています。このアプローチにより、各タンパク質サンプルの特定の要件に合わせて、さまざまなパラメーターを正確かつ迅速に調整できます。反復的な改良により、研究者は多様なバッファー条件を体系的にテストし、さまざまなパラメーターを調整することで、好ましい配向を最小限に抑え、クライオ電子顕微鏡データの全体的な品質を向上させることができます。タンパク質緩衝液の成分を変化させ、その濃度を調整するだけで、表面電荷を調節することによりタンパク質の安定性に影響を与える効果が実証されており、その結果、ガラス質氷²⁵内のタンパク質の挙動に影響を与えることが実証されています。したがって、タンパク質バッファーの組成を最適化することは、クライオ電子顕微鏡の一般的な課題に対処するための最も便利でわかりやすいアプローチの1つと考えられています。

ここでは、クライオ電子顕微鏡の一般的な障害である粒子分布の不均一な克服に対処するためのプロトコルが提案されています。このプロトコールでは、タンパク質調製とバッファースクリーニングの主要な手順を、グリッド調製によって補完し、ケーススタディとしてMethanocaldococcus jannaschii(MjsHSP16.5)²⁶由来の小さな熱ショックタンパク質を使用して概説します(図1)。このsHSPは天然に安定しており、モノマーあたり16.5 kDaの分子量を持ち、24 merの八面体ケージに集合する^26,27 は、クライオ電子顕微鏡による構造解析の有望な候補となっています。しかし、クライオ電子顕微鏡のデータ収集中に粒子分布が不均一になることは想定されておらず、実験中に大きな課題として浮かび上がってきました。さらに、同様の課題に取り組む研究者にとって有益なアプローチの可能性について議論し、クライオ電子顕微鏡を用いた高分子構造の効率的な解明を促進します。

プロトコル

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. タンパク質精製

1. 大腸菌BL21(DE3)における組換えMjsHSP16.5の発現を誘導し、前述の²⁶と同様にニッケルキレートクロマトグラフィーカラムを用いてタンパク質を精製する。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム²⁶で精製した後、5 μLのピークフラクションを12.5% SDS-PAGEゲルにロードし、標準的なクマシーブルー染色²⁸で可視化することにより、タンパク質の純度を調べます(図2)。
2. MjsHSP16.5を含むプール画分を、分子量カットオフが50 kDaの遠心フィルターを使用して、4°Cで約65 mg/mLに濃縮します( 材料表を参照)。
   注:遠心分離中は、タンパク質の凝集を防ぐために、5分ごとにタンパク質溶液を静かにピペットで分注してください。
3. 濃縮後、サンプルを 16,000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離して凝集体を除去し、0.2 mL の薄肉 PCR チューブで上清を 50 μL の容量に分注し、チューブを液体窒素で瞬間凍結し、サンプルを -80 °C でさらに使用するまで保存します。

2. 透過型電子顕微鏡(TEM)イメージングのためのタンパク質調製

1. 凍結した2本のタンパク質チューブを氷上で解凍します。解凍後、チューブを数回フリックして溶液を穏やかに混合して均質性を確保し、タンパク質溶液を16,000 × g で4°Cで10分間遠心分離して凝集体を除去します。
2. 上清をSECカラムに注入し、0.5 mLの溶出画分を収集します。
3. 280 nmで最も高いUV吸光度を示すピークに対応する溶出画分を収集し、Bradfordアッセイ²⁹を用いてこれらの画分中のタンパク質濃度を測定する。
   注:ダウンストリームアプリケーションでシングルピークフラクションに十分なタンパク質濃度を確保するには、カラムの推奨容量内にとどまりながら、大量のタンパク質サンプルをSECカラムにロードする必要があります。

3. バッファ交換

1. 目的の緩衝液(9 mMのMOPS-Tris(pH 7.2)、50 mMのNaCl、および0.1 mMのEDTA)を調製し、緩衝液を50 mLビーカーに分注し、緩衝ビーカーを4°Cに保ちます。
   注:標的タンパク質の生化学に関する事前知識に基づいて、20 mMのHEPES(pH 7.5)、100 mMのNaCl、0-5 mMのDTTなど、さまざまな組成(緩衝液の種類、pH、イオン強度)のさまざまな緩衝液を調製し、ダウンストリームグリッド調製における最適なタンパク質溶解性、均一性、および安定性を促進する条件を特定します。
2. 製造元の指示に従って透析メンブレンを準備します( 材料の表を参照)。
3. 透析膜をハサミで30mm×30mmに切ります。これらのメンブレンは、蒸留水または緩衝液でインキュベートすることにより平衡化します(図3A)。
4. 55 μL のタンパク質溶液 (約 2.5 mg/mL) を 50 μL のマイクロダイアリシスボタンのチャンバーに加えます (図 3B)。
5. 鉗子を使用して透析メンブレンを垂直に保持し、メンブレンの一方の端をティッシュペーパーにそっと触れて、余分な液体を排出します(図3C)。マイクロダイアリシスボタンをメンブレンで慎重に覆い、マイクロダイアリシスチャンバーに気泡が入らないようにします(図3D)。Oリングを透析膜の上に置きます。Oリングをボタンの端の溝にそっと転がします。
6. 別の方法:Oリングをゴルフティーの軸に沿って配置し、ゴルフティーをメンブレン上に逆さまに配置します(図3E)。Oリングをゴルフティーにそっとスライドさせて、ボタンの縁に滑り落ちさせます(図3F)。Oリングをボタンの端の溝に慎重に導きます(図3G)。
7. 各透析ボタンを、メンブレン側を上に向けて目的のバッファーを含む別々のビーカーに浸します(図3H)。
8. 透析プロセス中はビーカーを4°Cに保ちます。2時間後に透析バッファーを交換し、透析を一晩続けます。
9. 細い針付きのシリンジ(ハミルトンシリンジやインスリンシリンジなど)を使用してメンブレンを慎重に打ち抜き、マイクロダイアリシスチャンバーからタンパク質溶液を回収します(図3I)。タンパク質サンプルは、さらに使用するまで氷上の微量遠心チューブに保管してください。Bradfordアッセイ²⁹を使用してタンパク質濃度を測定します。

4. グリッドの準備

1. 適切なグリッドタイプを選択します。
   注:銅支持体上のアモルファス穴あきカーボンフィルムが一般的に使用されます。カーボン膜の厚さ、穴のサイズ、メッシュ番号は、目的の氷の厚さに基づいて選択する必要があります。ホーリーカーボンコーティンググリッドは、MjsHSP16.5のサンプル調製に使用されました。
2. ピンセットを使用してグリッドの端をそっとつかみ、グリッドの穴を損傷しないようにします。カーボン面を上に向けてグリッドホルダーにグリッドを配置します。グリッドホルダーをグロー放電システムのチャンバーに入れます。
3. 15mAで60秒間グロー放電を行い、グリッドを親水性にします。このプロセスでは、負の電荷を適用することをお勧めします。
   注:推奨パラメータは、この研究で使用されるグロー放電システムの出発点として機能します。グロー放電装置の種類によっては、特定のグリッド材料に対して望ましいレベルの親水性を達成するために、最適化が必要になる場合があります。プラズマ洗浄の場合は、水素やアルゴン-酸素混合物などの代替ガスまたはガス混合物のテストを検討してください。
4. オプションのステップ:開いたガラス瓶に入った99%アミルアミンなどの追加の化学溶液をグリッドホルダーに隣接するチャンバーに導入して、グリッド上に正味の正電荷を特異的に生成します。
5. 最適なパフォーマンスを確保するために、0.5〜1時間以内に放電されたグリッドを使用してください。

5.ネガティブステイングリッドの準備

1. 5 μLのサンプル(50-300 nMまたは20-120 ng/mL)をグロー放電グリッドにロードします。タンパク質の沈降を容易にするために、サンプルをグリッド表面に1分間放置します。
2. パラフィンフィルムシート上に50μLの水滴を3滴調製します。グリッド表面を最初の水滴の表面にこすりつけて、グリッド上のサンプルをやさしく洗います。残りの2滴の水滴で洗浄手順を繰り返します。
   注:洗浄時間は、各実験の特定の要件に応じて最適化される場合があります。
3. ろ過した1%(w / v)酢酸ウラニル溶液の5μLをグリッドにロードし、すぐに酢酸ウラニル溶液をピペットで取り出します。
4. さらに5 μLの1%(w / v)酢酸ウラニル溶液をグリッドにロードします。グリッドを酢酸ウラニル溶液中で90秒間インキュベートして染色します。
   注:染色時間は、特定のサンプルに応じて調整および最適化できます。
5. グリッドのピンセット側に濾紙でそっと触れて、余分な汚れ溶液を取り除きます。グリッドを室温で完全に風乾させます。乾燥させたグリッドは、観察するまで室温でグリッド容器に保管してください。

6. サンプルガラス化

1. タンパク質サンプルを希望の濃度に希釈します。
   注:タンパク質濃度は、各穴の粒子の数を最大化するのに十分な高さにする必要がありますが、単一の粒子の分布を確保するのに十分な低さにする必要があります。クライオ電子顕微鏡タンパク質の濃度は、通常、0.5〜2 mg/mLの範囲です。ただし、特定のタンパク質は、その分子量と特定のサンプル調製条件によっては、この範囲外の濃度が必要になる場合があります。
2. サンプルを16,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、凝集体を除去します。
3. プランジ凍結装置の電源を入れます。加湿器のリザーバーに蒸留水を入れます。リング付きの濾紙をブロットパッドに取り付けます。ガラス固化のパラメータを設定します(温度:4°C、湿度:100%、ブロット時間:6秒、ブロット力:5単位、待ち時間:10秒)。
   注:ブロットの時間と力は、グリッドからの水の除去と粒子の空気-水界面への曝露が解離または配向バイアスを誘発する可能性があるため、ガラス固化装置の最適化にとって重要なパラメータです。
4. 真鍮製カップ、グリッドボックスホルダー、スパイダーユニット、汚染防止リングなどの極低温容器部品をベーストレイに組み立てます。トレイに液体窒素を充填して、コンテナアセンブリを冷却します。真ちゅう製のカップに極低温物質(液体エタン)を入れます。極低温が溶融温度に達したら、スパイダーユニットを取り外します。
5. ピンセットとグリッドアセンブリを装置に取り付け、サンプル(通常は4μL)をグリッドのカーボン側にロードし、プランジ凍結プロセスを開始します。
6. ピンセットを機器から慎重にドッキング解除し、グリッドを保管グリッドボックスの上に置き、ボックスを蓋で密封します。ガラス固化したサンプルが入ったグリッドボックスを液体窒素で保管します。

7. TEMへのグリッドの読み込み

1. オートグリッド組立ステーションを組み立て、液体窒素で冷却します。
2. ガラス化されたグリッドを含むグリッドボックスを配置し、蓋を慎重に緩めてグリッドにアクセスします。組み立てたグリッドを簡単に移動できるように、空のオートグリッド収納ボックスを近くに配置します。
3. オートグリッドリングを、組立ステーションのリングの指定された切り欠きスペースに配置します。ビトリファイドグリッドをグリッドボックスから慎重に移動し、オートグリッドリングの内側に取り付けます。グリッドとリングが揃っていることを確認します。
4. ディスクの位置を合わせて、円の開口部をオートグリッドリングとグリッドアセンブリの上に配置します。グリッドをオートグリッドリングに固定するには、Cクリップ挿入ツールをグリッドの上に置き、軽く押し下げて内側のCクリップをクリックします。
5. ディスクを回転させて戻し、組み立てたグリッドをオートグリッドストレージボックスに移動します。
6. カセットローディングステーションを組み立て、ローディングステーションを液体窒素で冷却します。
7. オートグリッドストレージボックスをローディングステーションに配置します。グリッドアセンブリをオートグリッドストレージボックスからカセットに移動し、グリッドを軽くたたいて適切な配置を確保します。
8. ハンドルを使用して、カセットをオートローダーカプセルに入れます。オートローダのピンをチェックして、ピンが自由に動き、凍結していないことを確認します。
9. オートローダーカプセルをTEMにドッキングして、グリッド観察を行います。

結果

MjsHSP16.5の最適なグリッド条件を特定するために、主にさまざまなタンパク質バッファー条件の調査に焦点を当てた最初のクライオEMスクリーニングが実施されました:(1)MjsHSP16.5の安定性と均質性を確保し、その結晶化に重要な最終精製^{バッファー30};(2)高品質のMjsHSP16.5結晶の成長に必要な条件から適応した^{バッファー30};(3)以前にMjsHSP...

ディスカッション

すべてのタンパク質構造研究は、タンパク質の精製から始まり、タンパク質ターゲットを高純度かつ均一に単離しながら、その本来の機能を維持するための反復プロセスです。タンパク質サンプルを精製および保存するためのバッファー組成は、精製プロセス中に慎重に選択されますが、これらのバッファーは、その後のクライオ電子顕微鏡サンプル調製およびイメ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL Round Bottom Tube	SPL Life Sciences	40114
250 µL Gastight Syringe Model 1725 LTN	Hamilton	81100	Cemented Needle, 22s gauge, 2 in, point style 2
50 µL Dialysis Button	Hampton Research	HR3-326
50-mL Glass Beaker	DIAMOND	HA.1010D.50
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagent	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Micro Centrifuge Tube 1.5 mL	HD Micro	H23015
PCR Tubes 0.2 mL, flat cap	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Discharge unit	Ted Pella	91000
PELCO TEM grid holder block	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Uranyl acetate	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Buffer Screening Kit and Detergents	ThermoFisher Scientific	A49856