Otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica

Resumo

Este protocolo apresenta um método prático usando Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como exemplo para abordar a distribuição desigual de partículas por meio da otimização da preparação de amostras, fornecendo uma referência para os pesquisadores elucidarem eficientemente estruturas macromoleculares usando microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM).

Resumo

A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) revolucionou a biologia estrutural ao permitir o estudo de estruturas macromoleculares em condições quase nativas, suspensas no gelo vítreo. Essa técnica permite a visualização de alta resolução de proteínas e outras biomoléculas sem a necessidade de cristalização, oferecendo informações significativas sobre sua função e mecanismo. Avanços recentes na análise de partícula única, juntamente com o processamento aprimorado de dados computacionais, tornaram o crio-EM uma ferramenta indispensável na biologia estrutural moderna. Apesar de sua crescente adoção, o crio-EM enfrenta desafios persistentes que podem limitar sua eficácia, particularmente a distribuição desigual de partículas. Esse problema geralmente leva a uma resolução ruim e precisão reduzida em estruturas de proteínas reconstruídas. Este artigo descreve uma abordagem simples e prática para enfrentar esse desafio, usando a pequena proteína de choque térmico de Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como exemplo. O método otimiza a preparação da amostra para minimizar a adsorção preferencial, garantindo uma distribuição de partículas mais homogênea e estruturas crio-EM de proteína de maior qualidade. Essa técnica oferece uma orientação valiosa para pesquisadores que desejam superar desafios semelhantes em estudos estruturais.

Introdução

Com os avanços recentes no hardware do instrumento ^1,2 e no software de processamento de imagem ^3,4,5, a microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) emergiu como uma ferramenta popular e poderosa na biologia estrutural moderna. Apesar desses avanços, persistem gargalos na obtenção de estruturas macromoleculares de alta resolução usando crio-EM. Um desses desafios significativos é a distribuição desigual de partículas, incluindo o fenômeno de preferência de orientação, que é predominantemente observado na interface ar-água 6,7,8,9.

Durante a vitrificação da amostra, algumas moléculas exibem uma tendência a se alinhar ao longo de eixos específicos na grade. Isso leva a uma distribuição desigual de visualizações de partículas no conjunto de dados final. Certas orientações podem estar super-representadas, enquanto outras estão sub-representadas ou completamente ausentes, resultando em amostragem incompleta da arquitetura total da proteína. As regiões da proteína que são preferencialmente orientadas para o feixe de elétrons aparecerão mais proeminentes no mapa de densidade, enquanto as regiões orientadas para longe do feixe podem ser mal resolvidas ou completamente ausentes^10,11. Consequentemente, a distribuição desigual de partículas introduz vieses e artefatos potenciais na estrutura tridimensional (3D) reconstruída final. Notavelmente, elementos-chave estruturais, como hélices alfa e folhas beta, podem se tornar distorcidos, cadeias de aminoácidos ou nucleotídeos podem parecer fragmentadas e densidades de segmentos específicos de proteínas ou ácidos nucléicos podem exibir distorção¹². Em última análise, essas deturpações representam um grande desafio para desvendar com precisão a estrutura e a função das moléculas biológicas.

Várias abordagens experimentais são usadas atualmente para superar esses desafios, incluindo otimização da preparação da amostra 13,14,15, tratamento de grade 16,17,18,19,20,21,22 e estratégia de coleta de dados²³. Notavelmente, é aconselhável enfrentar o desafio na fase de preparação da amostra sempre que possível⁷. Otimizações comuns na preparação de amostras incluem modificar a composição do tampão, introduzir parceiros de ligação de pequenos moleculares ou macromoleculares, gerar ligações cruzadas intramoleculares e detergentes variados. Isso também é verdade para proteínas de membrana ^24,25, embora os detergentes devam ser usados especificamente para fins de purificação e estabilização. Entre eles, a personalização, a relação custo-benefício e a ampla acessibilidade da otimização do tampão de proteína a tornam uma estratégia preferida na maioria dos laboratórios. Essa abordagem permite ajustes precisos e imediatos dos vários parâmetros para corresponder às necessidades específicas de cada amostra de proteína. Por meio do refinamento iterativo, os pesquisadores podem testar sistematicamente diversas condições de buffer e ajustar vários parâmetros com o objetivo de minimizar as orientações preferidas e melhorar a qualidade geral dos dados crio-EM. A simples variação dos componentes do tampão proteico e o ajuste de suas concentrações demonstraram eficácia em influenciar a estabilidade da proteína, modulando a carga superficial, consequentemente impactando o comportamento da proteína no gelo vítreo²⁵. Portanto, otimizar a composição do tampão de proteína é considerada uma das abordagens mais convenientes e diretas para enfrentar desafios comuns em crio-EM.

Aqui, é sugerido um protocolo para abordar um obstáculo comum na crio-EM - superar a distribuição desigual de partículas. Neste protocolo, os principais procedimentos para preparação de proteínas e triagem de tampão, complementados pela preparação da grade, são descritos usando uma pequena proteína de choque térmico de Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)²⁶ como um estudo de caso (Figura 1). Este sHSP é nativamente estável, tem uma massa molecular de 16,5 kDa por monômero e se monta em uma gaiola octaédrica de 24 meros ^26,27, tornando-o um candidato atraente para análise estrutural por crio-EM. No entanto, a observação de uma distribuição desigual de partículas durante a coleta de dados crio-EM não foi antecipada e surgiu como um desafio significativo durante os experimentos. Além disso, são discutidas abordagens potenciais benéficas para pesquisadores que enfrentam desafios semelhantes, facilitando assim a elucidação eficiente de estruturas macromoleculares usando crio-EM.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Purificação de proteínas

1. Induza a expressão de MjsHSP16.5 recombinante em E. coli BL21 (DE3) e purifique a proteína usando uma coluna de cromatografia quelante de níquel, conforme descrito anteriormente²⁶. Após a purificação em uma coluna²⁶ de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), examine a pureza da proteína carregando 5 μL de frações de pico em um gel SDS-PAGE a 12,5% e visualizando pela coloração padrão de azul de Coomassie²⁸ (Figura 2).
2. Concentrar as fracções de reservas, contendo MjsHSP16.5 a 4 °C e cerca de 65 mg/ml, utilizando filtros centrífugos com um limite de 50 kDa de peso molecular, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Pipete suavemente a solução de proteína a cada 5 minutos durante a centrifugação para evitar a agregação de proteínas.
3. Após a concentração, centrifugue a amostra a 16.000 x g por 10 min a 4 ° C para remover agregados, alíquota do sobrenadante em volumes de 50 μL em tubos de PCR de parede fina de 0,2 mL, congele rapidamente os tubos em nitrogênio líquido e armazene as amostras a -80 ° C até uso posterior.

2. Preparação de proteínas para imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

1. Descongele dois tubos de proteína congelados no gelo. Depois de descongelado, misturar suavemente a solução agitando o tubo várias vezes para garantir a homogeneidade e centrifugar a solução proteica a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C para remover os agregados.
2. Injectar o sobrenadante numa coluna SEC e recolher fracções de eluição de 0,5 ml.
3. Recolher as fracções de eluição correspondentes ao pico que apresenta a maior absorvância UV a 280 nm e medir a concentração de proteínas nestas fracções utilizando o ensaio de Bradford²⁹.
   NOTA: Para garantir uma concentração de proteína suficiente em uma única fração de pico para as aplicações a jusante, é necessário carregar uma grande quantidade de amostra de proteína na coluna SEC enquanto permanece dentro da capacidade recomendada da coluna.

3. Troca de buffer

1. Prepare a solução tampão desejada (9 mM de MOPS-Tris (pH 7,2), 50 mM de NaCl e 0,1 mM de EDTA), alíquota dos tampões em béqueres de 50 mL e mantenha os copos tampão a 4 °C.
   NOTA: Com base no conhecimento prévio da bioquímica da proteína-alvo, prepare uma variedade de soluções tampão com diferentes composições (tipos de tampão, pH e força iônica), como 20 mM de HEPES (pH 7,5), 100 mM de NaCl e 0-5 mM de DTT, para identificar as condições que promovem a solubilidade, homogeneidade e estabilidade ideais da proteína na preparação da grade a jusante.
2. Prepare a membrana de diálise seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
3. Corte a membrana de diálise em pedaços de 30 mm x 30 mm usando uma tesoura. Equilibre essas membranas incubando-as em água destilada ou soluções tampão ( Figura 3A ).
4. Adicione 55 μL da solução proteica (aproximadamente 2,5 mg / mL) à câmara de botões de microdiálise de 50 μL (Figura 3B).
5. Segure a membrana de diálise verticalmente usando uma pinça e toque suavemente uma borda da membrana contra o papel de seda para drenar o excesso de líquido (Figura 3C). Cubra cuidadosamente o botão de microdiálise com a membrana, garantindo que nenhuma bolha de ar seja introduzida na câmara de microdiálise (Figura 3D). Coloque o O-ring no topo da membrana de diálise. Enrole suavemente o O-ring na ranhura na borda do botão.
6. Método alternativo: Coloque o O-ring ao longo do eixo de um tee de golfe e posicione o tee de golfe de cabeça para baixo na membrana (Figura 3E). Deslize suavemente o O-ring para baixo no tee de golfe até que ele escorregue para a borda do botão (Figura 3F). Guie cuidadosamente o O-ring na ranhura na borda do botão (Figura 3G).
7. Mergulhe cada botão de diálise em um béquer separado contendo o tampão de destino com o lado da membrana voltado para cima (Figura 3H).
8. Mantenha os copos a 4 °C durante o processo de diálise. Troque o tampão de diálise após 2 h e continue a diálise durante a noite.
9. Use uma seringa com uma agulha fina (por exemplo, seringa de Hamilton ou seringa de insulina) para perfurar cuidadosamente a membrana e recuperar a solução proteica da câmara de microdiálise (Figura 3I). Armazene a amostra de proteína em um tubo de microcentrífuga no gelo até uso posterior. Medir a concentração de proteínas utilizando o ensaio de Bradford²⁹.

4. Preparação da grade

1. Escolha o tipo de grade apropriado.
   NOTA: Filme de carbono furado amorfo em um suporte de cobre é comumente usado. A espessura do filme de carbono, o tamanho do furo e o número da malha devem ser escolhidos com base na espessura de gelo desejada. Grades revestidas de carbono Holey foram usadas para a preparação da amostra de MjsHSP16.5.
2. Segure as grades suavemente nas bordas usando uma pinça para evitar danificar os orifícios da grade. Posicione as grades em um suporte de grade com o lado de carbono voltado para cima. Coloque o suporte da grade na câmara do sistema de descarga incandescente.
3. Execute a descarga incandescente por 60 s a 15 mA para tornar a grade hidrofílica. Recomenda-se a aplicação de uma carga negativa durante este processo.
   NOTA: Os parâmetros recomendados servem como ponto de partida para o sistema de descarga luminescente usado neste estudo. A otimização pode ser necessária dependendo do tipo de instrumento de descarga luminescente e para atingir o nível desejado de hidrofilicidade para materiais de grade específicos. Para limpeza de plasma, considere testar gases alternativos ou misturas de gases, como hidrogênio ou misturas de argônio-oxigênio.
4. Etapa opcional: introduzir soluções químicas adicionais, como amilamina a 99% em uma garrafa de vidro aberta, em uma câmara adjacente ao suporte da grade para produzir especificamente uma carga positiva líquida na grade.
5. Use as grades descarregadas dentro de 0,5-1 h para garantir o desempenho ideal.

5. Preparação da grade de manchas negativas

1. Carregue 5 μL da amostra (50-300 nM ou 20-120 ng/mL) na grade de descarga luminescente. Deixe a amostra descansar sem perturbações na superfície da grade por 1 minuto para facilitar a sedimentação das proteínas.
2. Prepare três gotas de água de 50 μL cada em uma folha de filme de parafina. Lave suavemente a amostra na grade esfregando a superfície da grade contra a superfície da primeira gota de água. Repita a etapa de lavagem com as duas gotas de água restantes.
   NOTA: Os tempos de lavagem podem ser otimizados de acordo com os requisitos específicos de cada experimento.
3. Carregue 5 μL da solução filtrada de acetato de uranilo a 1% (p / v) na grade e pipete imediatamente a solução de acetato de uranila.
4. Carregue mais 5 μL da solução de acetato de uranilo a 1% (p / v) na grade. Deixar a grelha incubar na solução de acetato de uranilo durante 90 s para coloração.
   NOTA: O tempo de coloração pode ser ajustado e otimizado de acordo com amostras específicas.
5. Toque suavemente no lado da pinça da grade com papel de filtro para remover o excesso de solução de coloração. Deixe a grade secar completamente ao ar em temperatura ambiente. Armazene a grade seca em um recipiente de grade em temperatura ambiente até a observação.

6. Vitrificação da amostra

1. Diluir a amostra de proteína até à concentração desejada.
   NOTA: A concentração de proteína deve ser alta o suficiente para maximizar o número de partículas em cada orifício, mas baixa o suficiente para garantir a distribuição de partículas individuais. As concentrações de proteína crio-EM geralmente variam de 0,5 a 2 mg / mL. No entanto, certas proteínas, dependendo de seu peso molecular e condições específicas de preparação da amostra, podem exigir concentrações fora dessa faixa.
2. Centrifugar a amostra a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C para remover quaisquer agregados.
3. Ligue o instrumento de congelamento por imersão. Encha o reservatório do umidificador com água destilada. Monte os papéis de filtro com anéis nas almofadas de borrão. Defina os parâmetros para vitrificação (temperatura: 4 °C, umidade: 100%, tempo de borrão: 6 s, força de borrão: 5 unidades, tempo de espera: 10 s).
   NOTA: O tempo e a força do blot são parâmetros importantes para a otimização do dispositivo de vitrificação, pois a remoção de água da grade e a exposição de partículas à interface ar-água podem induzir dissociação ou viés de orientação.
4. Monte os componentes do recipiente de criogênio, incluindo o copo de latão, o suporte da caixa da grade, a unidade de aranha e o anel anticontaminação, na bandeja da base. Resfrie o conjunto do recipiente enchendo a bandeja com nitrogênio líquido. Encha o copo de latão com criogênio (etano líquido). Remova a unidade de aranha assim que o criogênio atingir a temperatura de fusão.
5. Monte a pinça e o conjunto da grade no instrumento, carregue a amostra (normalmente 4 μL) no lado de carbono da grade e inicie o processo de congelamento por imersão.
6. Desencaixe cuidadosamente a pinça do instrumento, coloque a grade em uma caixa de grade de armazenamento e feche a caixa com a tampa. Armazenar a caixa de grelha que contém as amostras vitrificadas em azoto líquido.

7. Carregando as grades para TEM

1. Monte a estação de montagem da rede automática e resfrie-a com nitrogênio líquido.
2. Coloque a caixa da grade contendo as grades vitrificadas e desparafuse a tampa com cuidado para acessar as grades. Posicione uma caixa de armazenamento de grade automática vazia nas proximidades para facilitar a transferência das grades montadas.
3. Coloque o anel de autogrid no espaço de recorte designado para o anel na estação de montagem. Mova cuidadosamente a grade vitrificada da caixa de grade e encaixe-a dentro do anel de grade automática. Certifique-se de que a grade e o anel estejam alinhados.
4. Alinhe o disco para posicionar a abertura do círculo na parte superior do anel de grade automática e do conjunto da grade. Para fixar a grade no anel de grade automática, coloque a ferramenta de inserção de clipe C na parte superior da grade e pressione suavemente para clicar no clipe C dentro.
5. Gire o disco para trás e mova as grades montadas para a caixa de armazenamento da grade automática.
6. Monte a estação de carregamento de e resfrie a estação de carregamento com nitrogênio líquido.
7. Coloque a caixa de armazenamento de grade automática na estação de carregamento. Mova o conjunto da grade da caixa de armazenamento da grade automática para o e bata suavemente na grade para garantir o posicionamento adequado.
8. Use a alça para colocar o na cápsula do carregador automático. Verifique o pino no carregador automático para confirmar seu movimento livre e garantir que não esteja congelado.
9. Acople a cápsula do carregador automático ao MET para observação da grade.

Resultados

Para identificar as condições ideais da grade para MjsHSP16.5, foi realizada uma triagem inicial de crio-EM, concentrando-se principalmente no exame de várias condições de tampão proteico: (1) o tampão de purificação final, que garante a estabilidade e homogeneidade de MjsHSP16.5 e é importante para sua cristalização³⁰; (2) tampões adaptados das condições necessárias para o crescimento de cristais MjsHSP16.5 de alta qualidade de difração

Discussão

Todos os estudos estruturais de proteínas começam com a purificação de proteínas, um processo iterativo para alcançar um equilíbrio entre o isolamento de alvos proteicos com alta pureza e homogeneidade, preservando sua funcionalidade nativa. Embora as composições de tampão para purificar e preservar amostras de proteínas sejam cuidadosamente selecionadas durante o processo de purificação, esses tampões frequentemente representam desafios durante a preparação e imagem subs...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL Round Bottom Tube	SPL Life Sciences	40114
250 µL Gastight Syringe Model 1725 LTN	Hamilton	81100	Cemented Needle, 22s gauge, 2 in, point style 2
50 µL Dialysis Button	Hampton Research	HR3-326
50-mL Glass Beaker	DIAMOND	HA.1010D.50
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagent	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Micro Centrifuge Tube 1.5 mL	HD Micro	H23015
PCR Tubes 0.2 mL, flat cap	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Discharge unit	Ted Pella	91000
PELCO TEM grid holder block	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Uranyl acetate	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Buffer Screening Kit and Detergents	ThermoFisher Scientific	A49856