Optimierung der Probenvorbereitung für die kryogene Elektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine praktische Methode am Beispiel von Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) vor, um eine ungleichmäßige Partikelverteilung durch Optimierung der Probenvorbereitung zu beheben, und bietet Forschern eine Referenz zur effizienten Aufklärung makromolekularer Strukturen mittels kryogener Elektronenmikroskopie (Kryo-EM).

Zusammenfassung

Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat die Strukturbiologie revolutioniert, indem sie die Untersuchung makromolekularer Strukturen unter nahezu nativen Bedingungen ermöglicht, die in Glaseis suspendiert sind. Diese Technik ermöglicht die hochauflösende Visualisierung von Proteinen und anderen Biomolekülen, ohne dass eine Kristallisation erforderlich ist, und bietet wichtige Einblicke in deren Funktion und Mechanismus. Jüngste Fortschritte in der Einzelpartikelanalyse, gepaart mit einer verbesserten rechnerischen Datenverarbeitung, haben die Kryo-EM zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der modernen Strukturbiologie gemacht. Trotz ihrer zunehmenden Akzeptanz steht Kryo-EM vor anhaltenden Herausforderungen, die ihre Wirksamkeit einschränken können, insbesondere bei ungleichmäßiger Partikelverteilung. Dieses Problem führt oft zu einer schlechten Auflösung und verminderter Genauigkeit bei rekonstruierten Proteinstrukturen. Dieser Artikel skizziert einen einfachen, praktischen Ansatz, um diese Herausforderung anzugehen, am Beispiel des kleinen Hitzeschockproteins von Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Die Methode optimiert die Probenvorbereitung, um die bevorzugte Adsorption zu minimieren und eine homogenere Partikelverteilung und hochwertigere Protein-Kryo-EM-Strukturen zu gewährleisten. Diese Technik bietet eine wertvolle Orientierungshilfe für Forscher, die ähnliche Herausforderungen in Strukturstudien bewältigen wollen.

Einleitung

Mit den jüngsten Fortschritten sowohl bei der Instrumentenhardware ^1,2 als auch bei der Bildverarbeitungssoftware ^3,4,5 hat sich die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu einem beliebten und leistungsfähigen Werkzeug in der modernen Strukturbiologie entwickelt. Trotz dieser Durchbrüche gibt es nach wie vor Engpässe bei der Erzielung hochauflösender makromolekularer Strukturen mittels Kryo-EM. Eine dieser großen Herausforderungen ist die ungleichmäßige Partikelverteilung, einschließlich des Phänomens der Orientierungspräferenz, das vor allem an der Luft-Wasser-Grenzfläche^{beobachtet wird 6,7,8,9}.

Während der Vitrifikation von Proben neigen einige Moleküle dazu, sich entlang bestimmter Achsen auf dem Gitter auszurichten. Dies führt zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Partikelansichten im endgültigen Datensatz. Bestimmte Orientierungen können überrepräsentiert sein, während andere unterrepräsentiert sind oder ganz fehlen, was zu einer unvollständigen Probenahme der gesamten Proteinarchitektur führt. Regionen des Proteins, die bevorzugt zum Elektronenstrahl orientiert sind, erscheinen in der Dichtekarte deutlicher, während Regionen, die vom Strahl weg orientiert sind, schlecht aufgelöst sein können oder ganz fehlen^10,11. Folglich führt eine ungleichmäßige Partikelverteilung zu potenziellen Verzerrungen und Artefakten in die rekonstruierte dreidimensionale (3D) Struktur. Insbesondere können Schlüsselstrukturelemente wie Alpha-Helices und Beta-Faltblätter verzerrt werden, Aminosäure- oder Nukleotidketten können fragmentiert erscheinen und die Dichten bestimmter Protein- oder Nukleinsäuresegmente können Verzerrungen aufweisen¹². Letztendlich stellen diese Fehldarstellungen eine große Herausforderung dar, um die Struktur und Funktion biologischer Moleküle genau zu entschlüsseln.

Um solche Herausforderungen zu meistern, werden derzeit verschiedene experimentelle Ansätze verwendet, darunter die Optimierung der Probenvorbereitung ^13,14,15, die Gitterbehandlung 16,17,18,19,20,21,22 und die Datenerfassungsstrategie ²³. Insbesondere wird empfohlen, die Herausforderung nach Möglichkeit bereits in der Phase der Probenvorbereitung anzugehen⁷. Zu den gängigen Optimierungen in der Probenvorbereitung gehören die Modifikation der Pufferzusammensetzung, die Einführung kleinmolekularer oder makromolekularer Bindungspartner, die Erzeugung intramolekularer Vernetzungen und die Variation von Detergenzien. Dies gilt auch für Membranproteine^24,25, obwohl Detergenzien speziell für Reinigungs- und Stabilisierungszwecke verwendet werden müssen. Unter diesen machen die Anpassbarkeit, Kosteneffizienz und breite Zugänglichkeit der Proteinpufferoptimierung sie in den meisten Labors zu einer bevorzugten Strategie. Dieser Ansatz ermöglicht eine präzise und unmittelbare Anpassung der verschiedenen Parameter, um sie an die spezifischen Anforderungen jeder Proteinprobe anzupassen. Durch iterative Verfeinerung können Forscher systematisch verschiedene Pufferbedingungen testen und verschiedene Parameter anpassen, um bevorzugte Orientierungen zu minimieren und die Gesamtqualität der Kryo-EM-Daten zu verbessern. Die einfache Variation der Proteinpufferkomponenten und die Anpassung ihrer Konzentrationen hat sich als wirksam bei der Beeinflussung der Proteinstabilität durch Modulation der Oberflächenladung erwiesen und somit das Proteinverhalten im Glaseis^{beeinflusst 25}. Daher gilt die Optimierung der Proteinpufferzusammensetzung als einer der bequemsten und einfachsten Ansätze, um häufige Herausforderungen in der Kryo-EM zu bewältigen.

Hier wird ein Protokoll vorgeschlagen, um ein häufiges Hindernis in der Kryo-EM zu überwinden – die Überwindung einer ungleichmäßigen Partikelverteilung. In diesem Protokoll werden Schlüsselverfahren für die Proteinpräparation und das Pufferscreening, ergänzt durch die Gitterpräparation, anhand eines kleinen Hitzeschockproteins von Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)²⁶ als Fallstudie skizziert (Abbildung 1). Dieses sHSP ist nativ stabil, hat eine Molekülmasse von 16,5 kDa pro Monomer und assembliert zu einem 24-mer-Oktaederkäfig^26,27, was es zu einem attraktiven Kandidaten für die Strukturanalyse mittels Kryo-EM macht. Die Beobachtung einer ungleichmäßigen Partikelverteilung während der Kryo-EM-Datenerfassung war jedoch nicht zu erwarten und erwies sich während der Experimente als eine große Herausforderung. Darüber hinaus werden potenzielle Ansätze diskutiert, die für Forscher nützlich sind, die ähnliche Herausforderungen angehen und so die effiziente Aufklärung makromolekularer Strukturen mit Kryo-EM erleichtern.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Reinigung von Proteinen

1. Induzieren Sie die Expression von rekombinantem MjsHSP16.5 in E. coli BL21(DE3) und reinigen Sie das Protein mit einer Nickelchelat-Chromatographiesäule, wie zuvor beschrieben²⁶. Nach der Aufreinigung auf einer Größenausschlusschromatographie-Säule (SEC)²⁶ ist die Proteinreinheit zu untersuchen, indem 5 μl Peakfraktionen auf ein 12,5 % SDS-PAGE-Gel geladen und durch Standard-Coomassie-Blau-Färbung²⁸ visualisiert werden (Abbildung 2).
2. Die Poolfraktionen, die MjsHSP16.5 enthalten, werden bei 4 °C auf ca. 65 mg/ml unter Verwendung von Zentrifugalfiltern mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 50 kDa gemäß den Anweisungen des Herstellers konzentriert (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Pipettieren Sie die Proteinlösung während der Zentrifugation alle 5 Minuten vorsichtig, um eine Proteinaggregation zu verhindern.
3. Nach der Konzentration zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 4 °C bei 16.000 x g , um Aggregate zu entfernen, aliquotieren Sie den Überstand in dünnwandigen 0,2-ml-PCR-Röhrchen in ein Volumen von 50 μl, frieren Sie die Röhrchen in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie die Proben bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C.

2. Proteinpräparation für die Bildgebung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

1. Tauen Sie zwei gefrorene Proteinröhrchen auf Eis auf. Nach dem Auftauen die Lösung vorsichtig mischen, indem Sie das Röhrchen mehrmals schnippen, um die Homogenität zu gewährleisten, und die Proteinlösung bei 16.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um Aggregate zu entfernen.
2. Injizieren Sie den Überstand auf eine SEC-Säule und sammeln Sie 0,5 mL Elutionsfraktionen.
3. Sammeln Sie die Elutionsfraktionen, die dem Peak mit der höchsten UV-Absorption bei 280 nm entsprechen, und messen Sie die Proteinkonzentration in diesen Fraktionen mit dem Bradford-Assay²⁹.
   HINWEIS: Um eine ausreichende Proteinkonzentration in einer einzigen Peakfraktion für die Downstream-Anwendungen zu gewährleisten, ist es erforderlich, eine große Menge an Proteinproben auf die SEC-Säule zu laden, während die empfohlene Kapazität der Säule eingehalten wird.

3. Austausch von Puffern

1. Bereiten Sie die gewünschte Pufferlösung vor (9 mM MOPS-Tris (pH 7,2), 50 mM NaCl und 0,1 mM EDTA), aliquotieren Sie die Puffer in 50-ml-Becher und halten Sie die Pufferbecher bei 4 °C.
   HINWEIS: Basierend auf Vorkenntnissen der Biochemie des Zielproteins bereiten Sie eine Vielzahl von Pufferlösungen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen (Puffertypen, pH-Wert und Ionenstärke) her, z. B. 20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl und 0-5 mM DTT, um die Bedingungen zu identifizieren, die eine optimale Proteinlöslichkeit, Homogenität und Stabilität bei der nachgeschalteten Gittervorbereitung fördern.
2. Bereiten Sie die Dialysemembran gemäß den Anweisungen des Herstellers vor (siehe Materialtabelle).
3. Schneiden Sie die Dialysemembran mit einer Schere in 30 mm x 30 mm große Stücke. Äquilibrieren Sie diese Membranen, indem Sie sie in destilliertem Wasser oder Pufferlösungen inkubieren (Abbildung 3A).
4. Geben Sie 55 μl der Proteinlösung (ca. 2,5 mg/ml) in die Kammer mit 50-μl-Mikrodialyseknöpfen (Abbildung 3B).
5. Halten Sie die Dialysemembran mit einer Pinzette senkrecht und berühren Sie vorsichtig eine Kante der Membran gegen Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit abzulassen (Abbildung 3C). Decken Sie den Mikrodialyseknopf vorsichtig mit der Membran ab und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in die Mikrodialysekammer gelangen (Abbildung 3D). Platzieren Sie den O-Ring auf der Dialysemembran. Rollen Sie den O-Ring vorsichtig in die Nut am Rand des Knopfes.
6. Alternative Methode: Platzieren Sie den O-Ring entlang der Achse eines Golfabschlags und positionieren Sie den Golfabschlag kopfüber auf der Membran (Abbildung 3E). Schieben Sie den O-Ring vorsichtig über das Golf-Tee, bis er auf den Rand des Knopfes rutscht (Abbildung 3F). Führen Sie den O-Ring vorsichtig in die Nut am Rand des Knopfes (Abbildung 3G).
7. Tauchen Sie jeden Dialyseknopf mit der Membranseite nach oben in ein separates Becherglas mit dem Zielpuffer (Abbildung 3H).
8. Halten Sie die Becher während des Dialysevorgangs bei 4 °C. Wechseln Sie den Dialysepuffer nach 2 h und setzen Sie die Dialyse über Nacht fort.
9. Verwenden Sie eine Spritze mit einer feinen Nadel (z. B. Hamilton-Spritze oder Insulinspritze), um die Membran vorsichtig zu stanzen und die Proteinlösung aus der Mikrodialysekammer zu gewinnen (Abbildung 3I). Lagern Sie die Proteinprobe bis zur weiteren Verwendung in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay²⁹.

4. Vorbereitung des Gitters

1. Wählen Sie den entsprechenden Rastertyp aus.
   HINWEIS: Amorpher, löchriger Kohlenstofffilm auf einem Kupferträger wird häufig verwendet. Die Dicke des Kohlenstofffilms, die Lochgröße und die Maschenzahl sollten basierend auf der gewünschten Eisdicke gewählt werden. Für die Probenvorbereitung von MjsHSP16.5 wurden kohlenstoffbeschichtete Holey-Gitter verwendet.
2. Fassen Sie die Gitter vorsichtig mit einer Pinzette an den Rändern an, um eine Beschädigung der Gitterlöcher zu vermeiden. Positionieren Sie die Gitter mit der Carbonseite nach oben auf einer Gitterhalterung. Setzen Sie den Gitterhalter in die Kammer des Glimmentladesystems ein.
3. Führen Sie eine Glimmentladung für 60 s bei 15 mA durch, um das Gitter hydrophil zu machen. Während dieses Prozesses wird empfohlen, eine negative Ladung anzuwenden.
   HINWEIS: Die empfohlenen Parameter dienen als Ausgangspunkt für das in dieser Studie verwendete Glimmentladungssystem. Je nach Typ des Glimmentladungsgeräts und um den gewünschten Grad an Hydrophilie für bestimmte Gittermaterialien zu erreichen, kann eine Optimierung erforderlich sein. Für die Plasmareinigung sollten Sie alternative Gase oder Gasgemische wie Wasserstoff oder Argon-Sauerstoff-Gemische testen.
4. Optionaler Schritt: Geben Sie zusätzliche chemische Lösungen, wie z. B. 99 % Amylamin in einer offenen Glasflasche, in eine Kammer neben dem Gitterhalter, um speziell eine positive Nettoladung auf dem Gitter zu erzeugen.
5. Verwenden Sie die entladenen Netze innerhalb von 0,5-1 h, um eine optimale Leistung zu gewährleisten.

5. Vorbereitung des Negativfleckengitters

1. Laden Sie 5 μl der Probe (50-300 nM oder 20-120 ng/ml) auf das glimmentladene Gitter. Lassen Sie die Probe 1 Minute lang ungestört auf der Gitteroberfläche ruhen, um das Absetzen der Proteine zu erleichtern.
2. Bereiten Sie drei Wassertropfen à 50 μL auf einem Paraffinfolienblatt vor. Waschen Sie die Probe vorsichtig auf dem Gitter, indem Sie die Gitteroberfläche gegen die Oberfläche des ersten Wassertropfens reiben. Wiederholen Sie den Waschschritt mit den restlichen zwei Wassertropfen.
   HINWEIS: Die Waschzeiten können entsprechend den spezifischen Anforderungen des jeweiligen Experiments optimiert werden.
3. Laden Sie 5 μl der filtrierten 1%igen (w/v) Uranylacetatlösung auf das Gitter und pipettieren Sie die Uranylacetatlösung sofort weg.
4. Laden Sie weitere 5 μl der 1%igen (w/v) Uranylacetatlösung auf das Gitter. Lassen Sie das Gitter 90 s lang in der Uranylacetatlösung inkubieren, um es zu färben.
   HINWEIS: Die Färbezeit kann je nach Probe angepasst und optimiert werden.
5. Berühren Sie vorsichtig die Pinzettenseite des Gitters mit Filterpapier, um überschüssige Fleckenlösung zu entfernen. Lassen Sie den Rost bei Raumtemperatur vollständig an der Luft trocknen. Lagern Sie den getrockneten Rost in einem Gitterbehälter bei Raumtemperatur bis zur Beobachtung.

6. Vitrifizierung von Proben

1. Verdünnen Sie die Proteinprobe auf die gewünschte Konzentration.
   HINWEIS: Die Proteinkonzentration sollte hoch genug sein, um die Anzahl der Partikel in jedem Loch zu maximieren, aber niedrig genug, um die Verteilung einzelner Partikel zu gewährleisten. Die Proteinkonzentrationen von Kryo-EM liegen in der Regel zwischen 0,5 und 2 mg/ml. Bestimmte Proteine können jedoch abhängig von ihrem Molekulargewicht und den spezifischen Bedingungen der Probenvorbereitung Konzentrationen außerhalb dieses Bereichs erfordern.
2. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 16.000 × g bei 4 °C zentrifugiert, um alle Aggregate zu entfernen.
3. Schalten Sie das Tauchgefrierinstrument ein. Füllen Sie den Befeuchterbehälter mit destilliertem Wasser. Montieren Sie Filterpapiere mit Ringen auf Blot-Pads. Stellen Sie die Parameter für die Vitrifikation ein (Temperatur: 4 °C, Luftfeuchtigkeit: 100 %, Abtupftzeit: 6 s, Abtupfkraft: 5 Einheiten, Wartezeit: 10 s).
   HINWEIS: Die Zeit und die Kraft der Fleckung sind wichtige Parameter für die Optimierung des Vitrifikationsgeräts, da die Wasserentfernung aus dem Gitter und die Exposition der Partikel gegenüber der Luft-Wasser-Grenzfläche eine Dissoziation oder Orientierungsverzerrung hervorrufen können.
4. Bauen Sie die Komponenten des Kryobehälters, einschließlich des Messingbechers, des Gitterboxhalters, der Spinneneinheit und des Antikontaminationsrings, in die Bodenschale ein. Kühlen Sie die Behälterbaugruppe, indem Sie die Schale mit flüssigem Stickstoff füllen. Füllen Sie den Messingbecher mit Kryogen (flüssiges Ethan). Entfernen Sie die Spinneneinheit, sobald das Kryogen die Schmelztemperatur erreicht hat.
5. Montieren Sie die Pinzette und die Gitterbaugruppe am Gerät, laden Sie die Probe (typischerweise 4 μl) auf die Kohlenstoffseite des Gitters und starten Sie den Tauchgefriervorgang.
6. Docken Sie die Pinzette vorsichtig vom Instrument ab, legen Sie den Rost auf eine Aufbewahrungsgitterbox und verschließen Sie die Box mit dem Deckel. Lagern Sie die Gitterbox mit den verglasten Proben in flüssigem Stickstoff.

7. Laden der Gitter in TEM

1. Montieren Sie die autogrid-Montagestation und kühlen Sie sie mit flüssigem Stickstoff.
2. Platzieren Sie die Gitterbox mit den verglasten Gittern und schrauben Sie den Deckel vorsichtig ab, um an die Gitter zu gelangen. Positionieren Sie eine leere Autogrid-Aufbewahrungsbox in der Nähe, um die zusammengesetzten Gitter einfach zu übertragen.
3. Platzieren Sie den Autogrid-Ring in der dafür vorgesehenen Ausschnittstelle für den Ring an der Montagestation. Ziehen Sie das verglaste Gitter vorsichtig aus dem Gitterkasten und setzen Sie es in den Autogitterring ein. Stellen Sie sicher, dass das Gitter und der Ring ausgerichtet sind.
4. Richten Sie die Scheibe so aus, dass die Kreisöffnung auf der Oberseite der Autogrid-Ring- und Rasterbaugruppe positioniert ist. Um das Raster im Autogrid-Ring zu fixieren, platzieren Sie das Einfügewerkzeug für den C-Clip auf dem Raster und drücken Sie es leicht nach unten, um den C-Clip darin zu klicken.
5. Drehen Sie die Scheibe zurück und verschieben Sie die zusammengebauten Gitter in die Autogrid-Aufbewahrungsbox.
6. Montieren Sie die Kassettenladestation und kühlen Sie die Ladestation mit flüssigem Stickstoff.
7. Stellen Sie die autogrid Lagerbox in die Ladestation. Bewegen Sie die Gitterbaugruppe aus der Autogrid-Aufbewahrungsbox in die Kassette und klopfen Sie vorsichtig auf das Gitter, um die richtige Platzierung zu gewährleisten.
8. Verwenden Sie den Griff, um die Kassette in die Autoloader-Kapsel zu legen. Überprüfen Sie den Stift im Autoloader, um seine freie Bewegung zu bestätigen, und stellen Sie sicher, dass er nicht eingefroren ist.
9. Docken Sie die Autoloader-Kapsel zur Gitterbeobachtung an das TEM an.

Ergebnisse

Um optimale Gitterbedingungen für MjsHSP16.5 zu identifizieren, wurde ein erstes Kryo-EM-Screening durchgeführt, das sich hauptsächlich auf die Untersuchung verschiedener Proteinpufferbedingungen konzentrierte: (1) den abschließenden Reinigungspuffer, der die Stabilität und Homogenität von MjsHSP16.5 gewährleistet und für seine Kristallisation wichtig ist³⁰; (2) Puffer, angepasst an Bedingungen, die für das Wachstum von MjsHSP16.5-Kristallen mit hoher Beu...

Diskussion

Alle Proteinstrukturstudien beginnen mit der Proteinreinigung, einem iterativen Prozess, um ein Gleichgewicht zwischen der Isolierung von Proteinzielen mit hoher Reinheit und Homogenität bei gleichzeitiger Beibehaltung ihrer nativen Funktionalität zu erreichen. Obwohl die Pufferzusammensetzungen zur Aufreinigung und Konservierung von Proteinproben während des Aufreinigungsprozesses sorgfältig ausgewählt werden, stellen diese Puffer bei der anschließenden Kryo-EM-Probenvorbereitung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL Round Bottom Tube	SPL Life Sciences	40114
250 µL Gastight Syringe Model 1725 LTN	Hamilton	81100	Cemented Needle, 22s gauge, 2 in, point style 2
50 µL Dialysis Button	Hampton Research	HR3-326
50-mL Glass Beaker	DIAMOND	HA.1010D.50
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagent	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Micro Centrifuge Tube 1.5 mL	HD Micro	H23015
PCR Tubes 0.2 mL, flat cap	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Discharge unit	Ted Pella	91000
PELCO TEM grid holder block	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Uranyl acetate	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Buffer Screening Kit and Detergents	ThermoFisher Scientific	A49856