극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

요약

이 프로토콜은 시료 전처리 최적화를 통해 불균일한 입자 분포를 해결하기 위한 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)를 예로 사용하는 실용적인 방법을 제시하며, 연구자가 극저온 전자 현미경(cryo-EM)을 사용하여 고분자 구조를 효율적으로 규명할 수 있는 참고 자료를 제공합니다.

초록

극저온 전자 현미경(Cryo-EM)은 유리체 얼음에 부유하는 거의 네이티브 조건에서 고분자 구조를 연구할 수 있게 함으로써 구조 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 이 기술은 결정화(crystallization)를 필요로 하지 않고 단백질 및 기타 생체 분자의 고해상도 시각화를 가능하게 하여 그 기능과 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 최근 단일 입자 분석의 발전과 향상된 컴퓨터 데이터 처리로 인해 Cryo-EM은 현대 구조 생물학에서 없어서는 안 될 도구가 되었습니다. 채택이 증가하고 있음에도 불구하고 Cryo-EM은 특히 불균일한 입자 분포와 같은 효과를 제한할 수 있는 지속적인 문제에 직면해 있습니다. 이 문제는 종종 재구성된 단백질 구조의 분리능 저하와 정확도 감소로 이어집니다. 이 기사에서는 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)의 작은 열 충격 단백질을 예로 들어 이 문제를 해결하기 위한 간단하고 실용적인 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 시료 전처리를 최적화하여 우선 흡착을 최소화함으로써 보다 균일한 입자 분포와 고품질 단백질 Cryo-EM 구조를 보장합니다. 이 기술은 구조 연구에서 유사한 문제를 극복하고자 하는 연구자에게 귀중한 지침을 제공합니다.

서문

최근 기기 하드웨어 ^1,2와 이미지 처리 소프트웨어 ^3,4,5의 발전으로 극저온 전자 현미경(Cryo-EM)은 현대 구조 생물학에서 인기 있고 강력한 도구로 부상했습니다. 이러한 획기적인 발전에도 불구하고 Cryo-EM을 사용하여 고분해능 고분자 구조를 달성하는 데 병목 현상이 지속되고 있습니다. 이러한 중요한 과제 중 하나는 공기-물 계면 ^6,7,8,9에서 주로 관찰되는 배향 선호 현상을 포함한 불균일한 입자 분포입니다.

시료 유리화(vitrification) 과정에서 일부 분자는 그리드의 특정 축을 따라 정렬되는 경향을 보입니다. 이로 인해 최종 데이터 세트에서 입자 보기가 고르지 않게 분포됩니다. 특정 방향은 과대 대표될 수 있는 반면 다른 배향은 과소 대표되거나 완전히 부재하여 전체 단백질 구조의 불완전한 샘플링을 초래할 수 있습니다. 전자빔을 우선적으로 배향하는 단백질의 영역은 밀도 맵에서 더 두드러지게 나타나는 반면, 빔에서 멀어지는 배향 영역은 제대로 분리되지 않거나 완전히 누락될 수 있습니다^10,11. 결과적으로, 불균일한 입자 분포는 최종 재구성된 3차원(3D) 구조에 잠재적인 편향과 아티팩트를 도입합니다. 특히, 알파 나선 및 베타 시트와 같은 주요 구조 요소가 비뚤어질 수 있고, 아미노산 또는 뉴클레오티드 사슬이 단편화된 것처럼 보일 수 있으며, 특정 단백질 또는 핵산 분절의 밀도가 왜곡을 나타낼 수 있습니다¹². 궁극적으로, 이러한 허위 진술은 생물학적 분자의 구조와 기능을 정확하게 밝히는 데 큰 도전이 됩니다.

이러한 과제를 극복하기 위해 현재 시료 전처리 최적화 13,14,15, 그리드 처리 16,17,18,19,20,21,22, 데이터 수집 전략²³ 등 다양한 실험 접근법이 사용되고 있습니다. 특히, 가능할 때마다 샘플 준비 단계에서 문제를 해결하는 것이 좋습니다⁷. 시료 전처리의 일반적인 최적화에는 완충액 조성 수정, 소분자 또는 고분자 결합 파트너 도입, 분자 내 가교 결합 생성 및 다양한 계면활성이 포함됩니다. 이는 막 단백질^24,25에도 해당되지만, 세제는 정제 및 안정화 목적으로 특별히 사용해야 합니다. 이 중에서도 단백질 완충액 최적화의 사용자 정의 가능성, 비용 효율성 및 광범위한 접근성으로 인해 대부분의 실험실에서 선호되는 전략이 되었습니다. 이 접근 방식을 사용하면 각 단백질 샘플의 특정 요구 사항에 맞게 다양한 매개변수를 정확하고 즉각적으로 조정할 수 있습니다. 반복적인 개선을 통해 연구자는 다양한 버퍼 조건을 체계적으로 테스트하고 선호하는 방향을 최소화하고 Cryo-EM 데이터의 전반적인 품질을 개선하기 위해 다양한 매개변수를 조정할 수 있습니다. 단순히 단백질 완충액 성분을 변화시키고 농도를 조절하는 것만으로도 표면 전하를 조절하여 단백질 안정성에 영향을 미치는 효능이 입증되었으며, 결과적으로 유리체 얼음 내 단백질 거동에 영향을 미쳤습니다²⁵. 따라서 단백질 완충액 조성을 최적화하는 것은 Cryo-EM의 일반적인 문제를 해결하기 위한 가장 편리하고 간단한 접근 방식 중 하나로 간주됩니다.

여기에서는 Cryo-EM의 일반적인 장애물인 불균일한 입자 분포를 극복하기 위한 프로토콜이 제안됩니다. 이 프로토콜에서는 사례 연구로 Methanocaldococcus jannaschii(MjsHSP16.5)²⁶의 작은 열 충격 단백질을 사용하여 그리드 준비로 보완되는 단백질 준비 및 완충액 스크리닝을 위한 주요 절차를 설명합니다(그림 1). 이 sHSP는 기본적으로 안정적이고, 단량체당 16.5kDa의 분자량을 가지며, 24-mer 팔면체 케이지^26,27로 조립되어 cryo-EM에 의한 구조 분석을 위한 매력적인 후보입니다. 그러나 Cryo-EM 데이터 수집 중 불균일한 입자 분포의 관찰은 예상되지 않았으며 실험 중에 중요한 과제로 부상했습니다. 또한 유사한 문제를 해결하는 연구자에게 유익한 잠재적 접근 방식에 대해 논의하여 Cryo-EM을 사용하여 고분자 구조를 효율적으로 설명할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 단백질 정화

1. E. coli BL21(DE3)에서 재조합 MjsHSP16.5의 발현을 유도하고 앞서 설명한 바와 같이 니켈 킬레이트 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 단백질을 정제합니다²⁶. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼²⁶에서 정제한 후 12.5% SDS-PAGE 겔에 5μL의 피크 분획을 로드하고 표준 Coomassie blue staining²⁸로 시각화하여 단백질 순도를 검사합니다(그림 2).
2. 제조업체의 지침에 따라 50kDa 분자량 컷오프가 있는 원심 필터를 사용하여 MjsHSP16.5를 포함하는 풀 분획을 4°C에서 약 65mg/mL로 농축합니다( 재료 표 참조).
   참고: 단백질 응집을 방지하기 위해 원심분리 중 5분마다 단백질 용액을 부드럽게 피펫으로 분사합니다.
3. 농축 후 16,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 샘플을 원심분리하여 응집체를 제거하고, 0.2mL 박막 PCR 튜브에서 상등액을 50μL 부피로 분취하고, 튜브를 액체 질소에서 급속 동결하고, 추가 사용 전까지 -80°C에서 샘플을 보관합니다.

2. 투과 전자 현미경(TEM) 이미징을 위한 단백질 준비

1. 얼음 위에서 두 개의 얼린 단백질 튜브를 해동합니다. 해동되면 튜브를 여러 번 튕겨 용액을 부드럽게 혼합하여 균질성을 확인하고 16,000 × g 의 단백질 용액을 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 응집체를 제거합니다.
2. SEC 컬럼에 상등액을 주입하고 0.5mL 용리 분획을 수집합니다.
3. 280nm에서 가장 높은 UV 흡광도를 나타내는 피크에 해당하는 용리 분획을 수집하고 Bradford assay²⁹를 사용하여 이러한 분획의 단백질 농도를 측정합니다.
   참고: 다운스트림 응용 분야에서 단일 피크 분획에서 충분한 단백질 농도를 보장하려면 컬럼의 권장 용량 내에서 유지하면서 많은 양의 단백질 샘플을 SEC 컬럼에 로드해야 합니다.

3. 버퍼 교환

1. 원하는 완충 용액(9mM의 MOPS-Tris(pH 7.2), 50mM의 NaCl 및 0.1mM의 EDTA)를 준비하고 완충액을 50mL 비커로 분취한 다음 완충액 비커를 4°C로 유지합니다.
   참고: 표적 단백질 생화학에 대한 사전 지식을 바탕으로 20mM의 HEPES(pH 7.5), 100mM의 NaCl 및 0-5mM의 DTT와 같은 다양한 조성(완충액 유형, pH 및 이온 강도)으로 다양한 완충 용액을 준비하여 다운스트림 그리드 준비에서 최적의 단백질 용해성, 균질성 및 안정성을 촉진하는 조건을 식별합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 투석막을 준비합니다( 재료 표 참조).
3. 투석막을 가위를 사용하여 30mm x 30mm 조각으로 자릅니다. 이러한 멤브레인을 증류수 또는 완충 용액으로 배양하여 평형을 이룹니다(그림 3A).
4. 50μL 미세투석 버튼의 챔버에 55μL의 단백질 용액(약 2.5mg/mL)을 추가합니다(그림 3B).
5. 집게를 사용하여 투석막을 수직으로 잡고 투석막의 한쪽 가장자리를 티슈 페이퍼에 부드럽게 닿아 여분의 액체를 배출합니다(그림 3C). 미세 투석 버튼을 멤브레인으로 조심스럽게 덮어 미세 투석 챔버에 기포가 유입되지 않도록 합니다(그림 3D). 투석막 위에 O-링을 놓습니다. O-링을 버튼 가장자리의 홈으로 부드럽게 굴립니다.
6. 대체 방법: 골프 티의 축을 따라 O-링을 놓고 골프 티를 멤브레인에 거꾸로 놓습니다(그림 3E). O-링이 버튼의 테두리에 미끄러질 때까지 골프 티 아래로 부드럽게 밉니다(그림 3F). O-링을 버튼 가장자리의 홈으로 조심스럽게 안내합니다(그림 3G).
7. 각 투석 버튼을 멤브레인 면이 위쪽을 향하도록 대상 버퍼가 들어 있는 별도의 비커에 담그십시오(그림 3H).
8. 투석 과정에서 비커를 4°C로 유지하십시오. 2시간 후에 투석 버퍼를 교체하고 밤새 투석을 계속합니다.
9. 가는 바늘이 달린 주사기(예: Hamilton 주사기 또는 인슐린 주사기)를 사용하여 멤브레인을 조심스럽게 펀칭하고 미세투석실에서 단백질 용액을 회수합니다(그림 3I). 단백질 샘플을 얼음 위의 마이크로 원심분리 튜브에 넣어 나중에 사용할 때까지 보관하십시오. Bradford assay²⁹를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.

4. 그리드 준비

1. 적절한 그리드 유형을 선택합니다.
   참고: 구리 지지대에 비정질 구멍 모양의 탄소 필름이 일반적으로 사용됩니다. 탄소 필름 두께, 구멍 크기 및 메쉬 번호는 원하는 얼음 두께에 따라 선택해야 합니다. MjsHSP16.5의 시료 준비에는 Holey 탄소 코팅 그리드가 사용되었습니다.
2. 그리드 구멍이 손상되지 않도록 핀셋을 사용하여 그리드의 가장자리를 부드럽게 잡습니다. 탄소 면이 위쪽을 향하도록 그리드 홀더에 그리드를 배치합니다. 그리드 홀더를 글로우 방전 시스템의 챔버에 놓습니다.
3. 그리드를 친수성으로 만들기 위해 60mA에서 15초 동안 글로우 방전을 수행합니다. 이 과정에서 음전하를 적용하는 것이 좋습니다.
   알림: 권장 매개변수는 이 연구에 사용된 글로우 방전 시스템의 시작점 역할을 합니다. 최적화는 글로우 방전 기기 유형에 따라 그리고 특정 그리드 재료에 대해 원하는 수준의 친수성을 달성하기 위해 필요할 수 있습니다. 플라즈마 세척의 경우 대체 가스 또는 수소 또는 아르곤-산소 혼합물과 같은 가스 혼합물을 테스트하는 것이 좋습니다.
4. 선택 단계: 열린 유리병에 담긴 99% 아밀아민과 같은 추가 화학 용액을 그리드 홀더에 인접한 챔버에 도입하여 그리드에서 순 양전하를 특이적으로 생성합니다.
5. 최적의 성능을 보장하기 위해 0.5-1시간 이내에 방전된 그리드를 사용하십시오.

5. 네거티브 스테인 그리드 준비

1. 5 μL의 샘플(50-300 nM 또는 20-120 ng/mL)을 글로우 방전 그리드에 로드합니다. 단백질의 침전을 용이하게 하기 위해 샘플을 그리드 표면에 1분 동안 방해받지 않고 그대로 둡니다.
2. 파라핀 필름 시트에 각각 50μL의 물방울 3개를 준비합니다. 첫 번째 물방울의 표면에 그리드 표면을 문질러 그리드에서 샘플을 부드럽게 씻습니다. 나머지 두 방울로 세척 단계를 반복합니다.
   참고: 세탁 시간은 각 실험의 특정 요구 사항에 따라 최적화될 수 있습니다.
3. 여과된 1%(w/v) 우라닐 아세테이트 용액 5μL를 그리드에 로드하고 즉시 우라닐 아세테이트 용액을 피펫으로 제거합니다.
4. 5%(w/v) 우라닐 아세테이트 용액을 그리드에 추가로 로드합니다. 염색을 위해 그리드가 우라닐 아세테이트 용액에서 90초 동안 배양되도록 합니다.
   참고: 염색 시간은 특정 샘플에 따라 조정 및 최적화할 수 있습니다.
5. 그리드의 핀셋 쪽을 여과지로 부드럽게 만져 과도한 염색 용액을 제거합니다. 그리드를 실온에서 완전히 건조시키십시오. 건조된 그리드를 관찰할 때까지 실온의 그리드 컨테이너에 보관하십시오.

6. 샘플 유리화

1. 단백질 샘플을 원하는 농도로 희석합니다.
   참고: 단백질 농도는 각 구멍의 입자 수를 최대화할 수 있을 만큼 충분히 높아야 하지만 단일 입자의 분포를 보장할 수 있을 만큼 낮아야 합니다. Cryo-EM 단백질 농도는 일반적으로 0.5 - 2 mg/mL 범위입니다. 그러나 특정 단백질은 분자량과 특정 시료 준비 조건에 따라 이 범위를 벗어난 농도가 필요할 수 있습니다.
2. 16,000 × g 에서 4 °C에서 10분 동안 샘플을 원심분리하여 응집체를 제거합니다.
3. 급강하 냉동 기기를 켭니다. 가습기 저장통에 증류수를 채웁니다. 얼룩 패드에 링이 있는 여과지를 장착합니다. 유리화(vitrification)를 위한 매개변수(온도: 4°C, 습도: 100%, 블롯 시간: 6초, 블롯 힘: 5개, 대기 시간: 10초)를 설정합니다.
   참고: 블롯 시간과 힘은 유리화 장치 최적화를 위한 중요한 매개변수이며, 그리드에서 수분을 제거하고 공기-물 계면에 입자를 노출하면 해리 또는 방향 바이어스가 유발될 수 있습니다.
4. 황동 컵, 그리드 박스 홀더, 스파이더 유닛 및 오염 방지 링을 포함한 극저온 용기 구성 요소를 베이스 트레이에 조립합니다. 트레이에 액체 질소를 채워 용기 어셈블리를 식힙니다. 황동 컵에 극저온(액체 에탄)을 채웁니다. 극저온제가 용융 온도에 도달하면 스파이더 장치를 제거하십시오.
5. 핀셋과 그리드 어셈블리를 기기에 장착하고, 샘플(일반적으로 4μL)을 그리드의 탄소 쪽에 로드한 다음 플런지 동결 프로세스를 시작합니다.
6. 기기에서 핀셋을 조심스럽게 분리하고 그리드를 보관 그리드 상자에 놓고 뚜껑으로 상자를 밀봉합니다. 유리화 샘플이 들어있는 그리드 상자를 액체 질소에 보관하십시오.

7. 그리드를 TEM에 로드

1. 자동 그리드 조립 스테이션을 조립하고 액체 질소로 냉각합니다.
2. 유리화 그리드가 들어 있는 그리드 상자를 놓고 그리드에 접근하기 위해 뚜껑의 나사를 조심스럽게 푸십시오. 조립된 그리드를 쉽게 전송할 수 있도록 빈 자동 그리드 보관 상자를 근처에 배치하십시오.
3. 자동 그리드 링을 어셈블리 스테이션에서 링에 대해 지정된 절단 공간에 배치합니다. 격자 상자에서 유리화 격자를 조심스럽게 이동하여 자동 격자 링 안에 맞춥니다. 그리드와 링이 정렬되었는지 확인합니다.
4. 디스크를 정렬하여 원형 개구부를 자동 그리드 링과 그리드 어셈블리 위에 배치합니다. 그리드를 자동 그리드 링에 고정하려면 C 클립 삽입 도구를 그리드 위에 놓고 부드럽게 눌러 내부의 C 클립을 클릭합니다.
5. 디스크를 다시 회전시키고 조립된 그리드를 자동 그리드 보관 상자로 이동합니다.
6. 카세트 로딩 스테이션을 조립하고 로딩 스테이션을 액체 질소로 냉각합니다.
7. 자동 그리드 보관 상자를 적재 스테이션에 놓습니다. 그리드 어셈블리를 자동 그리드 보관 상자에서 카세트로 이동하고 그리드를 부드럽게 두드려 적절한 배치를 확인합니다.
8. 핸들을 사용하여 카세트를 오토로더 캡슐에 넣습니다. 오토로더의 핀을 확인하여 자유로운 움직임을 확인하고 얼지 않았는지 확인합니다.
9. 그리드 관찰을 위해 오토로더 캡슐을 TEM에 도킹합니다.

결과

MjsHSP16.5에 대한 최적의 그리드 조건을 식별하기 위해 주로 다양한 단백질 완충액 조건을 검사하는 데 중점을 둔 초기 Cryo-EM 스크리닝을 수행했습니다. (1) MjsHSP16.5의 안정성과 균질성을 보장하고 결정화에 중요한 최종 정제 완충액³⁰; (2) 고회절 품질 MjsHSP16.5 결정의 성장에 필요한 조건으로부터 적응된 완충액³⁰; 및 (3) MjsHSP16.5의 전자 현?...

토론

모든 단백질 구조 연구는 단백질 정제로 시작되며, 이는 고유 기능을 보존하면서 순도가 높고 균질한 단백질 표적을 분리하는 것 사이의 균형을 이루기 위한 반복적인 프로세스입니다. 단백질 시료를 정제하고 보존하기 위한 완충액 조성은 정제 과정에서 신중하게 선택되지만, 이러한 완충액은 후속 Cryo-EM 시료 전처리^{및 이미징 6}에서 종종 문제를 제기?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL Round Bottom Tube	SPL Life Sciences	40114
250 µL Gastight Syringe Model 1725 LTN	Hamilton	81100	Cemented Needle, 22s gauge, 2 in, point style 2
50 µL Dialysis Button	Hampton Research	HR3-326
50-mL Glass Beaker	DIAMOND	HA.1010D.50
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagent	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Micro Centrifuge Tube 1.5 mL	HD Micro	H23015
PCR Tubes 0.2 mL, flat cap	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Discharge unit	Ted Pella	91000
PELCO TEM grid holder block	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Uranyl acetate	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Buffer Screening Kit and Detergents	ThermoFisher Scientific	A49856