Ottimizzazione della preparazione dei campioni per la microscopia elettronica criogenica

Riepilogo

Questo protocollo presenta un metodo pratico che utilizza Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) come esempio per affrontare la distribuzione irregolare delle particelle attraverso l'ottimizzazione della preparazione del campione, fornendo un riferimento per i ricercatori per chiarire in modo efficiente le strutture macromolecolari utilizzando la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM).

Abstract

La microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) ha rivoluzionato la biologia strutturale consentendo lo studio di strutture macromolecolari in condizioni quasi native, sospese nel ghiaccio vitreo. Questa tecnica consente la visualizzazione ad alta risoluzione di proteine e altre biomolecole senza la necessità di cristallizzazione, offrendo informazioni significative sulla loro funzione e meccanismo. I recenti progressi nell'analisi di singole particelle, insieme a una migliore elaborazione dei dati computazionali, hanno reso la crio-EM uno strumento indispensabile nella moderna biologia strutturale. Nonostante la sua crescente adozione, la crio-EM deve affrontare sfide persistenti che possono limitarne l'efficacia, in particolare la distribuzione irregolare delle particelle. Questo problema spesso porta a una scarsa risoluzione e a una ridotta accuratezza nelle strutture proteiche ricostruite. Questo articolo delinea un approccio semplice e pratico per affrontare questa sfida, utilizzando come esempio la piccola proteina da shock termico di Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Il metodo ottimizza la preparazione del campione per ridurre al minimo l'adsorbimento preferenziale, garantendo una distribuzione più omogenea delle particelle e strutture crio-EM proteiche di qualità superiore. Questa tecnica offre una guida preziosa per i ricercatori che mirano a superare sfide simili negli studi strutturali.

Introduzione

Con i recenti progressi sia^{nell'hardware} dello strumento ^1,2 che nel software di elaborazione delle immagini ^3,4,5, la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) è emersa come uno strumento popolare e potente nella moderna biologia strutturale. Nonostante queste scoperte, persistono colli di bottiglia nel raggiungimento di strutture macromolecolari ad alta risoluzione utilizzando la crio-EM. Una di queste sfide significative è la distribuzione irregolare delle particelle, compreso il fenomeno della preferenza di orientamento, che si osserva prevalentemente all'interfaccia aria-acqua 6,7,8,9.

Durante la vitrificazione del campione, alcune molecole mostrano una tendenza ad allinearsi lungo assi specifici sulla griglia. Ciò porta a una distribuzione non uniforme delle viste delle particelle nel set di dati finale. Alcuni orientamenti possono essere sovrarappresentati mentre altri sono sottorappresentati o completamente assenti, con conseguente campionamento incompleto dell'architettura proteica totale. Le regioni della proteina che sono preferenzialmente orientate verso il fascio di elettroni appariranno più prominenti nella mappa di densità, mentre le regioni orientate lontano dal fascio potrebbero essere scarsamente risolte o completamente mancanti^10,11. Di conseguenza, la distribuzione irregolare delle particelle introduce potenziali distorsioni e artefatti nella struttura tridimensionale ricostruita (3D) finale. In particolare, elementi strutturali chiave come le alfa eliche e i fogli beta possono diventare obliqui, le catene di amminoacidi o nucleotidi possono apparire frammentate e le densità di specifici segmenti proteici o di acidi nucleici possono mostrare una distorsione¹². In definitiva, queste false rappresentazioni rappresentano una grande sfida per svelare con precisione la struttura e la funzione delle molecole biologiche.

Vari approcci sperimentali sono attualmente utilizzati per superare tali sfide, tra cui l'ottimizzazione della preparazione dei campioni 13,14,15, il trattamento della griglia 16,17,18,19,20,21,22 e la strategia di raccolta dei dati²³. In particolare, si consiglia di affrontare la sfida nella fase di preparazione del campione, quando possibile⁷. Le ottimizzazioni comuni nella preparazione dei campioni includono la modifica della composizione del tampone, l'introduzione di partner di legame a piccole molecole o macromolecolari, la generazione di legami incrociati intramolecolari e la variazione dei detergenti. Questo vale anche per le proteine di membrana^24,25, sebbene i detergenti debbano essere utilizzati specificamente per scopi di purificazione e stabilizzazione. Tra questi, la personalizzazione, l'economicità e l'ampia accessibilità dell'ottimizzazione del tampone proteico ne fanno una strategia preferita nella maggior parte dei laboratori. Questo approccio consente regolazioni precise e immediate dei vari parametri per soddisfare le esigenze specifiche di ciascun campione proteico. Attraverso il perfezionamento iterativo, i ricercatori possono testare sistematicamente diverse condizioni tampone e regolare vari parametri volti a ridurre al minimo gli orientamenti preferiti e migliorare la qualità complessiva dei dati crio-EM. La semplice variazione dei componenti del tampone proteico e la regolazione delle loro concentrazioni hanno dimostrato efficacia nell'influenzare la stabilità delle proteine modulando la carica superficiale, influenzando di conseguenza il comportamento delle proteine all'interno del ghiaccio vitreo²⁵. Pertanto, l'ottimizzazione della composizione del tampone proteico è considerata uno degli approcci più convenienti e diretti per affrontare le sfide comuni nella crio-EM.

In questo caso, viene suggerito un protocollo per affrontare un ostacolo comune nella crio-EM: superare la distribuzione irregolare delle particelle. In questo protocollo, le procedure chiave per la preparazione delle proteine e lo screening dei tamponi, integrate dalla preparazione della griglia, sono delineate utilizzando una piccola proteina da shock termico di Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)²⁶ come caso di studio (Figura 1). Questo sHSP è nativamente stabile, ha una massa molecolare di 16,5 kDa per monomero e si assembla in una gabbia ottaedrica di 24 metri^26,27, il che lo rende un candidato interessante per l'analisi strutturale mediante crio-EM. Tuttavia, l'osservazione di una distribuzione irregolare delle particelle durante la raccolta dei dati crio-EM non era prevista ed è emersa come una sfida significativa durante gli esperimenti. Inoltre, vengono discussi potenziali approcci utili per i ricercatori che affrontano sfide simili, facilitando così l'efficiente delucidazione delle strutture macromolecolari utilizzando la crio-EM.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Purificazione delle proteine

1. Indurre l'espressione del ricombinante MjsHSP16.5 in E. coli BL21(DE3) e purificare la proteina utilizzando una colonna cromatografica nichel-chelante come descritto in precedenza²⁶. Dopo la purificazione su una colonna²⁶ per cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), esaminare la purezza delle proteine caricando 5 μL di frazioni di picco su un gel SDS-PAGE al 12,5% e visualizzando con la colorazione standard Coomassie blue²⁸ (Figura 2).
2. Concentrare le frazioni del pool contenenti MjsHSP16.5 a 4 °C a circa 65 mg/mL utilizzando filtri centrifughi con un cutoff di peso molecolare di 50 kDa, secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei Materiali).
   NOTA: Pipettare delicatamente la soluzione proteica ogni 5 minuti durante la centrifugazione per prevenire l'aggregazione proteica.
3. Dopo la concentrazione, centrifugare il campione a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere gli aggregati, aliquotare il surnatante in volumi di 50 μL in provette PCR a parete sottile da 0,2 mL, congelare le provette in azoto liquido e conservare i campioni a -80 °C fino a nuovo utilizzo.

2. Preparazione delle proteine per l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

1. Scongelare due tubi proteici congelati con ghiaccio. Una volta scongelata, mescolare delicatamente la soluzione agitando più volte la provetta per garantire l'omogeneità e centrifugare la soluzione proteica a 16.000 × g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere gli aggregati.
2. Iniettare il surnatante su una colonna SEC e raccogliere 0,5 mL di frazioni di eluizione.
3. Raccogliere le frazioni di eluizione corrispondenti al picco che presenta la massima assorbanza UV a 280 nm e misurare la concentrazione proteica in queste frazioni utilizzando il saggio Bradford²⁹.
   NOTA: Per garantire una concentrazione proteica sufficiente in una singola frazione di picco per le applicazioni a valle, è necessario caricare un'elevata quantità di campione proteico sulla colonna SEC rimanendo entro la capacità consigliata della colonna.

3. Scambio di buffer

1. Preparare la soluzione tampone desiderata (9 mM di MOPS-Tris (pH 7,2), 50 mM di NaCl e 0,1 mM di EDTA), aliquotare i tamponi in becher da 50 mL e mantenere i becher tampone a 4 °C.
   NOTA: Sulla base delle conoscenze preliminari della biochimica delle proteine bersaglio, preparare una varietà di soluzioni tampone con diverse composizioni (tipi di tampone, pH e forza ionica), come 20 mM di HEPES (pH 7,5), 100 mM di NaCl e 0-5 mM di DTT, per identificare le condizioni che promuovono la solubilità, l'omogeneità e la stabilità ottimali delle proteine nella preparazione della griglia a valle.
2. Preparare la membrana per dialisi seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei Materiali).
3. Tagliare la membrana per dialisi in pezzi di 30 mm x 30 mm utilizzando le forbici. Equilibrare queste membrane incubandole in acqua distillata o soluzioni tampone (Figura 3A).
4. Aggiungere 55 μL della soluzione proteica (circa 2,5 mg/mL) alla camera dei bottoni per microdialisi da 50 μL (Figura 3B).
5. Tenere la membrana per dialisi verticalmente utilizzando una pinza e toccare delicatamente un bordo della membrana contro la carta velina per drenare il liquido in eccesso (Figura 3C). Coprire accuratamente il pulsante di microdialisi con la membrana, assicurandosi che non vengano introdotte bolle d'aria nella camera di microdialisi (Figura 3D). Posizionare l'O-ring sopra la membrana di dialisi. Arrotolare delicatamente l'O-ring nella scanalatura sul bordo del pulsante.
6. Metodo alternativo: posizionare l'O-ring lungo l'asse di un tee da golf e posizionare il tee da golf capovolto sulla membrana (Figura 3E). Far scorrere delicatamente l'O-ring lungo il tee da golf finché non scivola via sul bordo del pulsante (Figura 3F). Guidare con cautela l'O-ring nella scanalatura sul bordo del pulsante (Figura 3G).
7. Immergere ciascun pulsante di dialisi in un becher separato contenente il tampone di destinazione con il lato della membrana rivolto verso l'alto (Figura 3H).
8. Mantenere i becher a 4 °C durante il processo di dialisi. Sostituire il tampone per dialisi dopo 2 ore e continuare la dialisi durante la notte.
9. Utilizzare una siringa con un ago sottile (ad es. siringa di Hamilton o siringa da insulina) per perforare con cura la membrana e recuperare la soluzione proteica dalla camera di microdialisi (Figura 3I). Conservare il campione di proteine in una provetta da microcentrifuga con ghiaccio fino a nuovo utilizzo. Misurare la concentrazione proteica utilizzando il saggio di Bradford²⁹.

4. Preparazione della rete

1. Scegli il tipo di griglia appropriato.
   NOTA: Il film di carbonio forato amorfo su un supporto di rame è comunemente usato. Lo spessore del film di carbonio, la dimensione del foro e il numero di maglia devono essere scelti in base allo spessore del ghiaccio desiderato. Le griglie rivestite in carbonio Holey sono state utilizzate per la preparazione del campione di MjsHSP16.5.
2. Afferrare delicatamente le griglie ai bordi utilizzando una pinzetta per evitare di danneggiare i fori della griglia. Posizionare le griglie su un portagriglia con il lato in carbonio rivolto verso l'alto. Posizionare il supporto della griglia nella camera del sistema di scarica a incandescenza.
3. Eseguire la scarica a bagliore per 60 s a 15 mA per rendere la griglia idrofila. Si consiglia di applicare una carica negativa durante questo processo.
   NOTA: I parametri consigliati servono come punto di partenza per il sistema di scarica a incandescenza utilizzato in questo studio. L'ottimizzazione potrebbe essere necessaria a seconda del tipo di strumento a scarica di bagliore e per ottenere il livello di idrofilia desiderato per specifici materiali della griglia. Per la pulizia al plasma, prendere in considerazione la possibilità di testare gas alternativi o miscele di gas come idrogeno o miscele di argon e ossigeno.
4. Passaggio facoltativo: introdurre soluzioni chimiche aggiuntive, come l'amilammina al 99% in un flacone di vetro aperto, in una camera adiacente al supporto della griglia per produrre in modo specifico una carica positiva netta sulla griglia.
5. Utilizzare le griglie scaricate entro 0,5-1 h per garantire prestazioni ottimali.

5. Preparazione della griglia di colorazione negativa

1. Caricare 5 μL del campione (50-300 nM o 20-120 ng/mL) sulla griglia scaricata a incandescenza. Lasciare riposare il campione indisturbato sulla superficie della griglia per 1 minuto per facilitare la sedimentazione delle proteine.
2. Preparare tre gocce d'acqua da 50 μl ciascuna su un foglio di pellicola di paraffina. Lavare delicatamente il campione sulla griglia strofinando la superficie della griglia contro la superficie della prima goccia d'acqua. Ripetere la fase di lavaggio con le restanti due gocce d'acqua.
   NOTA: I tempi di lavaggio possono essere ottimizzati in base alle esigenze specifiche di ciascun esperimento.
3. Caricare 5 μl della soluzione filtrata di acetato di uranile all'1% (p/v) sulla griglia e pipettare immediatamente la soluzione di acetato di uranile.
4. Caricare altri 5 μl della soluzione di acetato di uranile all'1% (p/v) sulla griglia. Lasciare incubare la griglia nella soluzione di acetato di uranile per 90 s per la colorazione.
   NOTA: Il tempo di colorazione può essere regolato e ottimizzato in base a campioni specifici.
5. Toccare delicatamente il lato della pinzetta della griglia con carta da filtro per rimuovere la soluzione colorante in eccesso. Lasciare asciugare completamente la griglia all'aria a temperatura ambiente. Conservare la griglia essiccata in un contenitore a griglia a temperatura ambiente fino all'osservazione.

6. Vitrificazione del campione

1. Diluire il campione di proteine alla concentrazione desiderata.
   NOTA: La concentrazione proteica dovrebbe essere sufficientemente alta da massimizzare il numero di particelle in ciascun foro, ma abbastanza bassa da garantire la distribuzione delle singole particelle. Le concentrazioni di proteina Cryo-EM variano in genere da 0,5 a 2 mg/mL. Tuttavia, alcune proteine, a seconda del loro peso molecolare e delle specifiche condizioni di preparazione del campione, possono richiedere concentrazioni al di fuori di questo intervallo.
2. Centrifugare il campione a 16.000 × g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali aggregati.
3. Accendere lo strumento di congelamento a tuffo. Riempire il serbatoio dell'umidificatore con acqua distillata. Montare le carte da filtro con anelli sui tamponi di tampone. Impostare i parametri per la vetrificazione (temperatura: 4 °C, umidità: 100%, tempo di tamponamento: 6 s, forza di tamponamento: 5 unità, tempo di attesa: 10 s).
   NOTA: Il tempo e la forza di bagnatura sono parametri importanti per l'ottimizzazione del dispositivo di vetrificazione, poiché la rimozione dell'acqua dalla griglia e l'esposizione delle particelle all'interfaccia aria-acqua possono indurre dissociazione o distorsione dell'orientamento.
4. Assemblare i componenti del contenitore criogenico, tra cui la tazza in ottone, il supporto della scatola a griglia, l'unità ragno e l'anello anticontaminazione, nel vassoio di base. Raffreddare il gruppo contenitore riempiendo la vaschetta con azoto liquido. Riempi la tazza di ottone con criogeno (etano liquido). Rimuovere l'unità ragno una volta che il criogeno raggiunge la temperatura di fusione.
5. Montare le pinzette e il gruppo griglia sullo strumento, caricare il campione (in genere 4 μL) sul lato in carbonio della griglia e avviare il processo di congelamento a tuffo.
6. Sganciare con cautela le pinzette dallo strumento, posizionare la griglia su una scatola a griglia e sigillare la scatola con il coperchio. Conservare la scatola a griglia contenente i campioni vetrificati in azoto liquido.

7. Caricamento delle griglie su TEM

1. Assemblare la stazione di assemblaggio autogrid e raffreddarla con azoto liquido.
2. Posizionare la scatola della griglia contenente le griglie vetrificate e svitare con cautela il coperchio per accedere alle griglie. Posizionare una scatola di stoccaggio autogrid vuota nelle vicinanze per facilitare il trasferimento delle griglie assemblate.
3. Posizionare l'anello autogrid nell'apposito spazio di apertura dell'anello presso la stazione di assemblaggio. Spostare con cautela la griglia vetrificata dalla scatola della griglia e inserirla all'interno dell'anello della griglia automatica. Assicurarsi che la griglia e l'anello siano allineati.
4. Allineare il disco per posizionare l'apertura del cerchio sopra l'anello della griglia automatica e il gruppo griglia. Per fissare la griglia nell'anello della griglia automatica, posizionare lo strumento di inserimento della clip a C sopra la griglia e premere delicatamente per fare clic sulla clip a C all'interno.
5. Ruotare il disco all'indietro e spostare le griglie assemblate nella scatola di stoccaggio della griglia automatica.
6. Montare la stazione di caricamento della cassetta e raffreddare la stazione di caricamento con azoto liquido.
7. Posizionare la scatola di stoccaggio autogrid nella stazione di carico. Spostare il gruppo griglia dalla scatola di stoccaggio autogrid alla cassetta e picchiettare delicatamente la griglia per garantire il corretto posizionamento.
8. Utilizzare la maniglia per posizionare la cassetta nella capsula del caricatore automatico. Controllare il perno nel caricatore automatico per confermare il suo libero movimento e assicurarsi che non sia congelato.
9. Agganciare la capsula del caricatore automatico al TEM per l'osservazione della griglia.

Risultati

Per identificare le condizioni ottimali della griglia per MjsHSP16.5, è stato condotto uno screening crio-EM iniziale, concentrandosi principalmente sull'esame di varie condizioni del tampone proteico: (1) il tampone di purificazione finale, che garantisce la stabilità e l'omogeneità di MjsHSP16.5 ed è importante per la sua cristallizzazione³⁰; (2) tamponi adattati dalle condizioni necessarie per la crescita di cristalli³⁰ di MjsHSP16.5...

Discussione

Tutti gli studi strutturali delle proteine iniziano con la purificazione delle proteine, un processo iterativo per raggiungere un equilibrio tra l'isolamento di bersagli proteici con elevata purezza e omogeneità, preservando la loro funzionalità nativa. Anche se le composizioni dei tamponi per purificare e conservare i campioni proteici sono accuratamente selezionate durante il processo di purificazione, questi tamponi rappresentano spesso una sfida durante la successiva preparazione d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL Round Bottom Tube	SPL Life Sciences	40114
250 µL Gastight Syringe Model 1725 LTN	Hamilton	81100	Cemented Needle, 22s gauge, 2 in, point style 2
50 µL Dialysis Button	Hampton Research	HR3-326
50-mL Glass Beaker	DIAMOND	HA.1010D.50
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagent	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Micro Centrifuge Tube 1.5 mL	HD Micro	H23015
PCR Tubes 0.2 mL, flat cap	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Discharge unit	Ted Pella	91000
PELCO TEM grid holder block	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Uranyl acetate	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Buffer Screening Kit and Detergents	ThermoFisher Scientific	A49856